本發(fā)明涉及微生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種利用生物分析儀檢測腸炎沙門氏菌的方法。

背景技術(shù)：

致病菌(pathogenicbacteria)能引起疾病的微生物稱為病原微生物或致病菌。病原微生物包括細(xì)菌、病毒、螺旋體、立克次氏體、衣原體、支原體、真菌及放線菌等。一般所說的致病菌指的是病原微生物中的細(xì)菌。細(xì)菌的致病性與其毒力、侵入數(shù)量及侵入門戶有關(guān)。雖然絕大多數(shù)細(xì)菌是無害甚至有益的，但是相當(dāng)大一部分可以致病。條件致病菌只在特定條件下致病，如有傷口可以允許細(xì)菌進(jìn)入血液，或者免疫力降低時(shí)。例如，金黃色葡萄球菌和鏈球菌也是正常菌群，?？梢源嬖谟隗w表皮膚，鼻腔而不引起疾病，但可以潛在引起皮膚感染，如肺炎(pneumonia)、腦膜炎(meningitis)和敗血癥(sepsis)等。

沙門氏菌是一種革蘭氏陰性短桿菌，不形成芽胞，臨床上可表現(xiàn)為胃腸炎、腸熱病、菌血癥綜合征或局灶性疾病。受此菌威脅最大的是嬰幼兒、老人及免疫缺陷個體。據(jù)統(tǒng)計(jì)在世界各國的種類細(xì)菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首。我國內(nèi)陸地區(qū)也以沙門氏菌為首位。當(dāng)前，各國政府和學(xué)術(shù)研究機(jī)構(gòu)都在致力于食品安全問題的研究，食品安全問題受到了空前的關(guān)注。

生理生化法和血清學(xué)法是目前國內(nèi)絕大多數(shù)檢測機(jī)構(gòu)都在使用的檢測沙門氏菌的方法，由于其檢測周期長、程序復(fù)雜、所需試劑繁多等缺點(diǎn)已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代檢測要求。因而，在臨床食物中毒時(shí)，找到一種快速、簡單、準(zhǔn)確的檢測方法顯得非常重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用生物分析儀檢測腸炎沙門氏菌的方法，可對腸炎沙門氏菌進(jìn)行快速檢測，操作簡單快捷，具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，適用性強(qiáng)，有利于大范圍的應(yīng)用推廣，對食品安全監(jiān)測監(jiān)管具有重大意義。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種利用生物分析儀檢測腸炎沙門氏菌的方法，包括以下步驟：

(1)提取待測腸炎沙門氏菌菌株的dna；

(2)以提取的腸炎沙門氏菌菌株的dna作為模板進(jìn)行pcr反應(yīng)；

(3)將凝膠基質(zhì)與染料混合物按照一定質(zhì)量比混合均勻，過濾；

(4)將凝膠染料混合物注入分離芯片中，將marker加入樣品孔中；

(5)將步驟(2)中的pcr產(chǎn)物加入樣品孔中，將ladder加入指定的ladder孔中；

(6)將芯片渦旋混勻后放入生物分析儀中進(jìn)行自動檢測分析。

優(yōu)選的，步驟(2)中pcr反應(yīng)所用的引物序列為：

sal-3a：5’-tatcgccacgttcgggcaa-3’；

sal-4a：5’-tcgcaccgtcaaaggaacc-3’。

優(yōu)選的，步驟(2)中pcr反應(yīng)條件為：首先，94℃變性3min，之后進(jìn)行25～30個擴(kuò)增循環(huán)，擴(kuò)增循環(huán)程式設(shè)定為94℃變性30s、70℃退火30s、72℃延伸1min。

優(yōu)選的，步驟(2)pcr擴(kuò)增循環(huán)后72℃延伸5min，pcr產(chǎn)物于4℃保存。

優(yōu)選的，步驟(3)中凝膠基質(zhì)和染料混合物的混合質(zhì)量比為15:1～20:1。

優(yōu)選的，步驟(3)中凝膠基質(zhì)與染料混合物混合均勻后，用離心過濾器過濾。

優(yōu)選的，步驟(4)中加入的marker的質(zhì)量為1-5μl。

優(yōu)選的，步驟(5)中加入的pcr產(chǎn)物的質(zhì)量與加入的ladder的質(zhì)量相同。

優(yōu)選的，步驟(6)中的生物分析儀為agilent2100生物分析儀。

本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明利用生物分析儀對腸炎沙門氏菌進(jìn)行快速檢測，操作簡單快捷，具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，適用性強(qiáng)，有利于大范圍的應(yīng)用推廣，對食品安全監(jiān)測監(jiān)管具有重大意義。

本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的具體實(shí)施方式部分予以詳細(xì)說明。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它附圖。

圖1為實(shí)施例1中11種細(xì)菌dna模板pcr反應(yīng)的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，l100為100bpdnaladder，1為腸炎沙門氏菌的電泳結(jié)果，2為福氏志賀氏菌的電泳結(jié)果，3為宋氏志賀氏菌的電泳結(jié)果，4為痢疾志賀氏菌的電泳結(jié)果，5為單增李斯特菌的電泳結(jié)果，6為威爾氏李斯特菌的電泳結(jié)果，7為小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的電泳結(jié)果，8為假結(jié)核耶爾森氏菌的電泳結(jié)果，9為金黃色葡萄球菌金黃色亞種a的電泳結(jié)果，10為金黃色葡萄球菌金黃色亞種b的電泳結(jié)果，11為金黃色葡萄球菌的電泳結(jié)果；

圖2為實(shí)施例1中腸炎沙門氏菌pcr擴(kuò)增片段在agilent2100生物分析儀中的凝膠樣圖，其中，1為腸炎沙門氏菌。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動的前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

以下實(shí)施例中使用的菌株均通過商購獲得，且分別購自cgmcc(中國普通微生物菌種保藏管理中心)和cmcc(中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心)，使用的特異性引物序列委托上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，agilent2100生物分析儀購自agilenttechnologies，分離芯片的分離過程在2100生物分析儀上進(jìn)行，pcr儀購自美國thermo公司，凝膠成像系統(tǒng)購自美國ultra.lum.inc。

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供了一種利用生物分析儀檢測腸炎沙門氏菌的方法，包括以下步驟：

(1)提取待測腸炎沙門氏菌菌株的dna；

(2)以提取的腸炎沙門氏菌菌株的dna作為模板進(jìn)行pcr反應(yīng)，pcr反應(yīng)所用的引物序列為：sal-3a：5’-tatcgccacgttcgggcaa-3’，sal-4a：5’-tcgcaccgtcaaaggaacc-3’；

pcr反應(yīng)條件為：首先，94℃變性3min，之后進(jìn)行25個擴(kuò)增循環(huán)，擴(kuò)增循環(huán)程式設(shè)定為94℃變性30s、70℃退火30s、72℃延伸1min，循環(huán)后72℃延伸5min，pcr產(chǎn)物于4℃保存。

(3)將300μl凝膠基質(zhì)與20μl染料混合物混合均勻后，用離心過濾器過濾；

(4)將凝膠染料混合物注入分離芯片中，將1μlmarker加入樣品孔中；

(5)取1μl步驟(2)中的pcr產(chǎn)物加入樣品孔中，將1μlladder加入指定的ladder孔中；

(6)將芯片渦旋混勻后放入agilent2100生物分析儀中進(jìn)行自動檢測分析。

對比例1

取5μl步驟(2)中的pcr產(chǎn)物進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳，60v1h，然后照相并觀察和分析相應(yīng)長度的擴(kuò)增條帶。

圖1為實(shí)施例1中11種細(xì)菌dna模板pcr反應(yīng)的瓊脂糖凝膠電泳圖，由圖1可見，腸炎沙門氏菌菌株出現(xiàn)1條特異條帶，而以福氏志賀氏菌、宋氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌、單增李斯特菌、威爾氏李斯特菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、假結(jié)核耶爾森氏菌、金黃色葡萄球菌金黃色亞種a、金黃色葡萄球菌金黃色亞種b和金黃色葡萄球菌dna作為模板，以sal-3a、sal-4a為引物進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)均無特異性條帶，表明pcr擴(kuò)增特異性強(qiáng)。

圖2為腸炎沙門氏菌pcr擴(kuò)增片段在agilent2100生物分析儀中的凝膠樣圖，由圖2可見，利用agilent2100生物分析儀檢測腸炎沙門氏菌pcr擴(kuò)增片段得到的片段大小與利用瓊脂糖凝膠法檢測得到的片段大小不同，通過比較兩者所測定的片段長度，利用agilent2100生物分析儀檢測得到的片段長度為284bp，與設(shè)計(jì)大小275bp相比，誤差率為3.3％，與報(bào)道的誤差率小于5％一致。而瓊脂糖凝膠電泳的電泳結(jié)果只能目測估計(jì)片段大小，誤差率大于5％，表明利用agilent2100生物分析儀檢測腸炎沙門氏菌具有較高的準(zhǔn)確度。

將pcr反應(yīng)循環(huán)分別進(jìn)行30、25、15、10、5個循環(huán)，對pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和agilent2100生物分析儀檢測，檢測結(jié)果顯示瓊脂糖凝膠電泳在15個循環(huán)以上才可檢測到目的條帶，而利用agilent2100生物分析儀檢測在10個循環(huán)時(shí)即可清楚檢測到目的片段，表明利用agilent2100生物分析儀檢測腸炎沙門氏菌具有較高的靈敏度。

實(shí)施例2

本實(shí)施例提供了一種利用生物分析儀檢測腸炎沙門氏菌的方法，包括以下步驟：

(1)提取待測腸炎沙門氏菌菌株的dna；

(2)以提取的腸炎沙門氏菌菌株的dna作為模板進(jìn)行pcr反應(yīng)，pcr反應(yīng)所用的引物序列為：sal-3a：5’-tatcgccacgttcgggcaa-3’，sal-4a：5’-tcgcaccgtcaaaggaacc-3’；

pcr反應(yīng)條件為：首先，94℃變性3min，之后進(jìn)行30個擴(kuò)增循環(huán)，擴(kuò)增循環(huán)程式設(shè)定為94℃變性30s、70℃退火30s、72℃延伸1min，循環(huán)后72℃延伸5min，pcr產(chǎn)物于4℃保存。

(3)將400μl凝膠基質(zhì)與20μl染料混合物混合均勻后，用離心過濾器過濾；

(4)將凝膠染料混合物注入分離芯片中，將4μlmarker加入樣品孔中；

(5)取1μl步驟(2)中的pcr產(chǎn)物加入樣品孔中，將1μlladder加入指定的ladder孔中；

(6)將芯片渦旋混勻后放入agilent2100生物分析儀中進(jìn)行自動檢測分析。

實(shí)施例3

本實(shí)施例提供了一種利用生物分析儀檢測腸炎沙門氏菌的方法，包括以下步驟：

(1)提取待測腸炎沙門氏菌菌株的dna；

(2)以提取的腸炎沙門氏菌菌株的dna作為模板進(jìn)行pcr反應(yīng)，pcr反應(yīng)所用的引物序列為：sal-3a：5’-tatcgccacgttcgggcaa-3’，sal-4a：5’-tcgcaccgtcaaaggaacc-3’；

pcr反應(yīng)條件為：首先，94℃變性3min，之后進(jìn)行30個擴(kuò)增循環(huán)，擴(kuò)增循環(huán)程式設(shè)定為94℃變性30s、70℃退火30s、72℃延伸1min，循環(huán)后72℃延伸5min，pcr產(chǎn)物于4℃保存。

(3)將500μl凝膠基質(zhì)與25μl染料混合物混合均勻后，用離心過濾器過濾；

(4)將凝膠染料混合物注入分離芯片中，將5μlmarker加入樣品孔中；

(5)取2μl步驟(2)中的pcr產(chǎn)物加入樣品孔中，將2μlladder加入指定的ladder孔中；

(6)將芯片渦旋混勻后放入agilent2100生物分析儀中進(jìn)行自動檢測分析。

實(shí)施例4

本實(shí)施例提供了一種利用生物分析儀檢測腸炎沙門氏菌的方法，包括以下步驟：

(1)提取待測腸炎沙門氏菌菌株的dna；

(2)以提取的腸炎沙門氏菌菌株的dna作為模板進(jìn)行pcr反應(yīng)，pcr反應(yīng)所用的引物序列為：sal-3a：5’-tatcgccacgttcgggcaa-3’，sal-4a：5’-tcgcaccgtcaaaggaacc-3’；

pcr反應(yīng)條件為：首先，94℃變性3min，之后進(jìn)行28個擴(kuò)增循環(huán)，擴(kuò)增循環(huán)程式設(shè)定為94℃變性30s、70℃退火30s、72℃延伸1min，循環(huán)后72℃延伸5min，pcr產(chǎn)物于4℃保存。

(3)將375μl凝膠基質(zhì)與25μl染料混合物混合均勻后，用離心過濾器過濾；

(4)將凝膠染料混合物注入分離芯片中，將5μlmarker加入樣品孔中；

(5)取1μl步驟(2)中的pcr產(chǎn)物加入樣品孔中，將1μlladder加入指定的ladder孔中；

(6)將芯片渦旋混勻后放入agilent2100生物分析儀中進(jìn)行自動檢測分析。

本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明利用生物分析儀對腸炎沙門氏菌進(jìn)行快速檢測，操作簡單快捷，具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，適用性強(qiáng)，特別有利于大范圍的應(yīng)用推廣，對食品安全監(jiān)測監(jiān)管具有重大意義。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都應(yīng)當(dāng)屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。