本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種堿性耐鹽普魯蘭酶pula及其基因和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

淀粉是由α-d葡萄糖單體通過α-1，4-糖苷鍵或α-1，6-糖苷鍵聚合而成的高分子化合物。動植物中存在著大量的淀粉。各類植物中含有較高比例的淀粉，淀粉是植物體儲存營養(yǎng)物質(zhì)的一種方式，植物中的淀粉是以球狀顆粒的形式貯藏，分布于種子、根、塊莖等。

淀粉酶(amylase)是指能水解淀粉和糖原的一類酶的總稱。淀粉酶作為一種催化劑，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于各個工業(yè)領(lǐng)域。大部分的植物、動物、微生物中都含有淀粉酶。根據(jù)淀粉酶水解底物產(chǎn)生的糖異構(gòu)體類型的不同而將其分為α和β淀粉酶。根據(jù)淀粉酶的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性的不同，可將其可分為：高溫淀粉酶、中溫淀粉酶和低溫淀粉酶。根據(jù)淀粉酶的最適ph和ph穩(wěn)定性的不同可將其分為：酸性、中性和堿性淀粉酶。根據(jù)淀粉酶水解糖苷鍵的方式的不同，可將其主要分為：α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、異淀粉酶、支鏈淀粉酶等。

普魯蘭酶是一類淀粉脫支酶，能夠?qū)Ｒ恍运馓窃椭ф湹矸鄯种c中的α-1，6-糖苷鍵，切下支鏈淀粉的整個側(cè)鏈將其變成直鏈淀粉。普魯蘭酶與異淀粉酶有所不同，普魯蘭酶能夠水解由兩到三個葡萄糖殘基構(gòu)成的側(cè)鏈而異淀粉酶卻不能。按水解位點的不同，普魯蘭酶可分為兩種類型，一種是ⅰ型普魯蘭酶，專一性水解α-1，6-糖苷鍵；另一種是ⅱ型普魯蘭酶，也被稱為淀粉普魯蘭酶，其同時具有水解α-1，6-糖苷鍵和內(nèi)切低聚糖α-1，4-糖苷鍵的能力。普魯蘭酶作為一種重要的糖苷水解酶，在淀粉加工、葡萄糖漿生產(chǎn)、啤酒生產(chǎn)和醫(yī)藥化工等方面具有巨大的應(yīng)用價值。

目前已報導(dǎo)的產(chǎn)普魯蘭酶的微生物很多，其中大部為細(xì)菌，如芽胞桿菌、微小桿菌和嗜冷希瓦氏菌屬等。此外，還有部分普魯蘭酶從嗜熱古菌和真菌中被發(fā)現(xiàn)。因為淀粉的糖化過程需要在較高的溫度(55～60℃)、微酸性條件下(ph4.5～5.5)進(jìn)行，酸性普魯蘭酶在糖漿工業(yè)中可提高利用率、降低糧耗和提高產(chǎn)品質(zhì)量，從而目前報道較多的普魯蘭酶大都是酸性酶。堿性普魯蘭酶在洗滌劑工業(yè)中具有重要的應(yīng)用前景。然而目前對于堿性普魯蘭酶的研究報導(dǎo)很少。此外，關(guān)于堿性普魯蘭酶的專利也鮮有報導(dǎo)。

本發(fā)明從大布蘇鹽堿湖底泥中分離了一株能夠產(chǎn)堿性耐鹽普魯蘭酶的嗜鹽嗜堿菌alkalibacteriumsp.，利用分子生物學(xué)和基因工程的方法獲得了該堿性耐鹽普魯蘭酶的編碼基因，并對該基因進(jìn)行了重組表達(dá)，重組酶具有在堿性條件下高活性和高穩(wěn)定性的特點。此外，該酶具有很好的鹽耐受性和穩(wěn)定性，在4mnacl存在的情況下還剩余45%以上的酶活。此外，該酶對普魯蘭糖的水解產(chǎn)物為三糖，表明該酶為i型普魯蘭酶。因此，該普魯蘭酶所具有的堿性耐鹽的特點，在洗滌劑和食品工業(yè)領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用潛力。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種堿性耐鹽普魯蘭酶pula及其基因和應(yīng)用。

本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。

本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。

本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述堿性耐鹽普魯蘭酶的基因工程方法。

本發(fā)明的另一目的提供上述堿性耐鹽普魯蘭酶的應(yīng)用。

本發(fā)明首先獲得一種堿性耐鹽普魯蘭酶pula，在堿性及高鹽條件下具有很高的酶活。這些性質(zhì)符合洗滌工業(yè)中對普魯蘭酶的堿性的要求，增強去污能力。

本發(fā)明所述堿性耐鹽普魯蘭酶pula，其氨基酸序列如seqidno.1所示。

本發(fā)明的普魯蘭酶pula總共含1184個氨基酸，經(jīng)軟件預(yù)測無信號肽，理論分子量為132.09kda，理論等電點為4.07。

本發(fā)明的普魯蘭酶pula的最適ph為9.0，在ph10.0時剩余77.4%的酶活。該普魯蘭酶在ph6.0-10.0之間均很穩(wěn)定，在此ph范圍內(nèi)處理60min后剩余酶活性在75%以上，這說明此酶具有較好的ph穩(wěn)定性。

本發(fā)明的普魯蘭酶pula的最適溫度為50℃，在40-55℃時剩余50%以上的酶活。在不存在底物的情況下，該酶在45℃較穩(wěn)定，處理一小時后剩余50%左右的酶活。該酶在50℃時的熱穩(wěn)定性不太好，處理一小時只剩余20%左右的酶活。

本發(fā)明的普魯蘭酶pula還具有很好的鹽的耐受性和穩(wěn)定性。在0.25–3.0mnacl存在的情況下剩余55%以上的酶活。而且在0.25mnacl存在的時候該酶的活性得到促進(jìn)，活力為對照的105%。此外，該酶在3m和4mnacl的濃度下處理60min,均剩余95%以上的酶活，表明該酶具有很好的鹽耐受性。

本發(fā)明還提供了編碼上述堿性耐鹽普魯蘭酶pula的基因，該基因的堿基序列如如seqidno.2所示。

本發(fā)明通過pcr的方法分離克隆了這一普魯蘭酶基因pula,dna全序列分析結(jié)果表明，普魯蘭酶pula結(jié)構(gòu)基因pula全長3555bp，起始密碼子為atg，終止密碼子為taa，gc含量50%，編碼1184個氨基酸組成的多肽(pula)，無信號肽序列，n端為一個第41家族的碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域（cbm），c端為一個普魯蘭酶的催化結(jié)構(gòu)域。在genbank中的比對結(jié)果表明它與alkalibacteriumpelagium(sek70797)的預(yù)測的普魯蘭酶最高一致性為93%，而且數(shù)據(jù)庫中與它相似性大于50%以上的普魯蘭酶基因均未做過性質(zhì)研究，表明pula是一個新的普魯蘭酶。

本發(fā)明還提供了包含上述堿性耐鹽普魯蘭酶基因pula的重組載體，優(yōu)選為pet22b-pula。將本發(fā)明的普魯蘭酶基因pula插入到表達(dá)載體合適的限制性酶切位點之間，使其核苷酸序列可操作的與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個最優(yōu)選的實施方案，優(yōu)選為將普魯蘭酶基因pula插入到質(zhì)粒pet22b(+)上的ncoi和noti限制性酶切位點之間，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pet22b-pula。

本發(fā)明還提供了包含上述堿性耐鹽普魯蘭酶基因pula的重組菌株，優(yōu)選所述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌和絲狀真菌，優(yōu)選為重組菌株bl21(de3)/pula。

本發(fā)明還提供了一種制備堿性耐鹽普魯蘭酶pula的方法，包括以下步驟：

1）用上述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；

2）培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組普魯蘭酶的表達(dá)；

3）回收并純化所表達(dá)的普魯蘭酶pula。

其中，優(yōu)選所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞，優(yōu)選將重組大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞bl21(de3)，得到重組菌株bl21/pula。

本發(fā)明還提供了上述堿性耐鹽普魯蘭酶pula的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種性質(zhì)優(yōu)良的、適合于在洗滌和食品工業(yè)中應(yīng)用的新普魯蘭酶pula。本發(fā)明所提供的普魯蘭酶pula最適反應(yīng)溫度為50℃，該酶的最適ph為9.0，在ph10.0的時候剩余77.4%的酶活。該普魯蘭酶還具有很好的ph耐受性，在ph6.0～11.0非常穩(wěn)定。此外，該酶在0.25–3.0mnacl存在的情況下剩余50%以上的酶活，且在3m和4mnacl的濃度下非常穩(wěn)定。本發(fā)明的普魯蘭酶pula具有堿性耐鹽的特點，因此本發(fā)明的堿性耐鹽普魯蘭酶pula可在洗滌劑工業(yè)中使用，增強去污能力。此外，該酶還可以應(yīng)用于食品工業(yè)。

附圖說明

圖1：在大腸桿菌中表達(dá)的重組普魯蘭酶pula的sds-page分析。其中，1：低分子量蛋白質(zhì)marker；2：未誘導(dǎo)的含有普魯蘭酶基因載體pet-pula的大腸桿菌培養(yǎng)上清液；3：誘導(dǎo)的含有普魯蘭酶基因載體pet-pula的大腸桿菌培養(yǎng)上清液濃縮液；4：通過鎳柱純化的達(dá)到電泳純的pula蛋白。

圖2：重組普魯蘭酶pula的最適ph。

圖3：重組普魯蘭酶pula的ph穩(wěn)定性。

圖4：重組普魯蘭酶pula的最適溫度。

圖5：重組普魯蘭酶pula的熱穩(wěn)定性。

圖6：鈣離子對重組普魯蘭酶pula活性的影響。

圖7：重組普魯蘭酶pula的鹽耐受性。

圖8：重組普魯蘭酶pula的鹽穩(wěn)定性。

圖9：重組普魯蘭酶pula的對普魯蘭糖的降解產(chǎn)物分析。

具體實施方式

試驗材料和試劑

1、菌株及載體：大腸桿菌表達(dá)載體pet22b(+)及菌株escherichiacolibl21(de3)購自于novagen公司。

2、酶類及其它生化試劑：限制性內(nèi)切酶、t4dna連接酶、dna聚合酶、dntps和pmd18-t載體購于日本takara公司?；蚪M提取試劑盒購于北京tiangen公司，純化及質(zhì)粒提取試劑盒購于美國omega公司。普魯蘭糖(pullulan)購于美國sigma公司；蛋白胨(tryptone)、酵母提取物(yeastextract)為英國oxoid公司產(chǎn)品，其余試劑為國產(chǎn)分析純。

3、培養(yǎng)基：

（1）lb培養(yǎng)基（g/l）：酵母粉5.0，蛋白胨10.0，nacl10.0,ph7.0。

（2）平板篩選培養(yǎng)基（g/l）：酵母粉5.0，蛋白胨10.0，nacl10.0,瓊脂15.0，ph7.0。

說明：以下實施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》（第三版）j.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

實施例1：普魯蘭酶基因pula的克隆

嗜鹽嗜堿菌基因組dna的提?。豪玫矸蹫槲ㄒ惶荚吹暮Y選培養(yǎng)基從吉林乾安大布蘇鹽堿湖的底泥中分離得到一株產(chǎn)堿性普魯蘭酶的微生物，經(jīng)16s鑒定為嗜鹽嗜堿菌屬。采用天根公司的細(xì)菌基因組提取試劑盒(dp302)提取該嗜鹽嗜堿菌的基因組dna，具體操作完全按照該試劑盒的說明書進(jìn)行。

根據(jù)普魯蘭酶基因的保守（hvrdftsdp和fdmmgdhd）序列設(shè)計合成了簡并引物pul-f和pul-r：

pul-f：5'-gtncgngayttyacntcngayc-3';

pul-r：5'-tcrtgrtcncccatcatrtc-3'

以上述的嗜鹽嗜堿菌基因組總dna為模板進(jìn)行pcr擴增。采用降落pcr方法進(jìn)行基因片段的擴增。反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，50-45℃退火30sec，72℃延伸30sec，10個循環(huán)（每個循環(huán)降落0.5℃）。然后94℃變性30sec，45℃退火30sec，72℃延伸30sec，30個循環(huán)，72℃保溫5min。得到一約570bp片段，將該片段回收后與pmd18-t載體相連送到英俊公司測序。

根據(jù)測序得到的普魯蘭酶基因的保守區(qū)的核甘酸序列，設(shè)計上游和下游各三條tail-pcr特異性引物：設(shè)計方向為需要擴增的未知區(qū)域方向，sp2的位置設(shè)計在sp1的內(nèi)側(cè)，sp3位于sp2的內(nèi)側(cè)。每兩個引物之間的距離沒有嚴(yán)格規(guī)定（為方便電泳識別結(jié)果，sp2和sp3一般間距100bp），引物長度一般22～30nt，退火溫度在62℃。并將它們分別命名為sl4-usp1,sl4-usp2,sl4-usp3(上游特異性引物);sl4-dsp1,sl4-dsp2,sl4-dsp3(下游特異性引物)見表1。按照tail-pcr中的程序?qū)啥藗?cè)翼序列進(jìn)行擴增。

表1普魯蘭酶pulatail-pcr擴增和全長擴增所需的引物

通過tail-pcr得到已知基因序列的側(cè)翼序列，擴增得到產(chǎn)物回收后送英俊公司測序。通過序列拼接獲得該片段的上下游側(cè)翼序列，全序列共長4.2kb，找到一個完整的開放閱讀框（orf）。普魯蘭酶基因pula由3555個堿基組成，編碼1184個氨基酸和一個終止密碼子，在genbank中的比對結(jié)果表明它與來源于alkalibacteriumpelagium(sek70797)的預(yù)測的普魯蘭酶最高一致性為93%。而且數(shù)據(jù)庫中與它相似性大于50%以上的普魯蘭酶基因均未做過性質(zhì)研究。pula編碼蛋白預(yù)計分子量為132kda，等電點為4.07。經(jīng)預(yù)測，pula無信號肽序列，中間為一個第41家族的碳水化合物結(jié)構(gòu)域，其c末端為一普魯蘭酶催化結(jié)構(gòu)域。

實施例2重組普魯蘭酶的制備。

以在基因5’和3’端分別引入了ncoi和noti酶切位點pula-m-f和pula-m-r為引物對（見表1），嗜鹽嗜堿菌基因組dna為模板，進(jìn)行pcr擴增。pcr反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸4min，30個循環(huán)，72℃保溫5min。將表達(dá)載體pet22b(+)進(jìn)行雙酶切(ncoi+noti)，同時將編碼普魯蘭酶的基因pula雙酶切(ecori+noti)，切好的編碼普魯蘭酶的基因片段與表達(dá)載體pet22b(+)連接，獲得含有普魯蘭酶基因pula的重組質(zhì)粒pet22b-pula并轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3)，獲得重組大腸桿菌菌株bl21/pula。

取含有重組質(zhì)粒pet22b-pula的bl21菌株，接種于5mllb(100μg/ml的氨芐青霉素)培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)好的菌液按1%接種于20mllb(加有100μg/ml的氨芐青霉素),37℃振蕩培養(yǎng)約2~3h(od600達(dá)到0.5)后加入終濃度1mmol/l的誘導(dǎo)劑iptg，30℃180rpm震蕩培養(yǎng)12h。12000rpm離心5min，收集培養(yǎng)基上清。dns法測定普魯蘭酶的活力。sds-page結(jié)果(圖1)表明，重組普魯蘭酶在大腸桿菌中得到了表達(dá)。所表達(dá)的普魯蘭酶經(jīng)過純化之后，其蛋白質(zhì)的含量達(dá)到總蛋白的95％以上。

實施例3重組普魯蘭酶pula的性質(zhì)測定

1、重組普魯蘭酶的活性分析

重組普魯蘭酶的活性測定采取3,5－二硝基水楊酸（dns）法：具體方法如下：在ph9.0，50℃條件下，1ml的反應(yīng)體系包括100μl適當(dāng)?shù)南♂屆敢海?00μl底物（1%櫸木普魯蘭糖），反應(yīng)10min，加入1.5mldns終止反應(yīng)，沸水煮5min。冷卻后540nm測定od值。1個酶活單位(u)定義為在給定的條件下每分鐘釋放出1μmol還原糖的所需的酶量。

2、重組普魯蘭酶pula的最適ph和ph穩(wěn)定性的測定

最適ph測定：將純化好的重組普魯蘭酶pula在37℃下和0.1mph4.0–11.0的緩沖液中進(jìn)行酶促反應(yīng)。酶的ph穩(wěn)定性測定：將酶液置于0.1mph4.0–11.0的緩沖液中，在37℃下處理1h，然后在ph9.0及50℃下進(jìn)行酶促反應(yīng)，以未處理的酶液作為對照。緩沖液為：0.1mmcilvainebuffer（ph4.0–7.0），0.1mtris-hclbuffer（ph7.0–9.0）和0.1mglycine-naoh（ph9.0–11.0）。以1%普魯蘭糖為底物，反應(yīng)10min，測定pula的活力。結(jié)果表明：pula的最適ph為9.0,在ph10.0剩余77.4%的酶活(圖2)；此普魯蘭酶在ph6.0-10.0之間均很穩(wěn)定,在此ph范圍內(nèi)處理60min后剩余酶活性在75%以上，這說明此酶具有較好的ph穩(wěn)定性（圖3）。

3、重組普魯蘭酶pula的最適溫度及熱穩(wěn)定性測定

酶的最適溫度的測定：在ph9.0的緩沖液中，于10–60℃下進(jìn)行酶促反應(yīng)。酶的熱穩(wěn)定性測定：將同樣酶量的酶液置于45℃、50℃和55℃中，處理0–60min后，在ph9.0及50℃下進(jìn)行酶促反應(yīng)，以未處理的酶液作為對照。以1%普魯蘭糖為底物，反應(yīng)10min。酶反應(yīng)最適溫度測定結(jié)果(圖4)表明,其最適溫度為50℃。酶的熱穩(wěn)定性性試驗表明(圖5)，重組酶在45℃時穩(wěn)定性較好。55℃下保溫60min，剩余酶活性為13%,。

4、重組普魯蘭酶pula的vmax和km的測定

以不同濃度的普魯蘭糖（1，0.8，0.4，0.2，0.15和0.1%）為底物，在最適條件下測定酶活性，計算相應(yīng)的反應(yīng)速度，利用米氏方程雙倒數(shù)法求得km值及vmax。結(jié)果表明：該酶的vmax為38.02±2.55μmolmin^–1mg^–1，km為0.09±0.01mgml^–1。

5、不同金屬離子化學(xué)試劑對pula酶活的影響測定

在酶促反應(yīng)體系中加入5mm的金屬離子及化學(xué)試劑，研究其對酶活性的影響。在50℃及ph9.0條件下，以普魯蘭糖為底物測定酶活性。結(jié)果（表2）表明：ca²⁺，zn²⁺，mn²⁺，fe³⁺和co²⁺能夠分別提高酶活力40%以上；cu²⁺和hg²⁺幾乎完全抑制酶活性；ni²⁺，edta和sds對酶活有微弱的抑制作用。其它試劑對酶活力有微弱的促進(jìn)作用。

表二金屬離子及化學(xué)試劑對重組普魯蘭糖pula活性的影響

6、不同濃度ca²⁺對重組普魯蘭酶pula的活性的影響

普魯蘭酶pula中含有ca²⁺結(jié)合位點，因此研究了不同濃度ca²⁺對該酶活性的影響：在酶促反應(yīng)體系中加入不同濃度的ca²⁺，研究其對酶活性的影響。在50℃及ph9.0條件下，以普魯蘭糖為底物測定酶活性。結(jié)果表明，濃度為30mm以下的ca²⁺對該酶活性都具有促進(jìn)作用，其中濃度為5nm時活性最大，為不加鈣離子的1.42倍（圖6）。

7、不同濃度nacl對重組普魯蘭酶pula的活性和穩(wěn)定的測定

nacl對重組普魯蘭酶pula的活性影響：在酶促反應(yīng)體系中加入不同濃度的nacl，研究其對酶活性的影響。在50℃及ph9.0條件下，以普魯蘭糖為底物測定酶活性。nacl對重組普魯蘭酶pula的穩(wěn)定性的影響：將酶液分別置于含有3m和4m的ph7.0的緩沖液中，在37℃下處理1h，然后在ph9.0及50℃下進(jìn)行酶促反應(yīng)，以未處理的酶液作為對照。結(jié)果表明：在0.25–4.0mnacl存在的情況下，該酶能夠剩余45%以上的酶活（圖7）。在3m和4mnacl的濃度下處理60min,剩余95%以上的酶活（圖8）。

8、重組普魯蘭酶pula對普魯蘭糖的降解產(chǎn)物分析

樣品處理過程如下：使用過量純酶液與ph9.0buffer配置的1%普魯蘭糖底物混勻，放置在重組酶最穩(wěn)定的溫度中水浴反應(yīng)，分別于10min，30min，1h，2h，4h和8h下取樣，沸水浴5min滅活酶液，冷卻至室溫后13000r/min離心5min，取相同體積的樣品點樣在硅膠板上。薄層層析實驗表明，該酶對普魯蘭糖的水解產(chǎn)物只有三塘，表明該酶為i型普魯蘭酶（圖9）。

應(yīng)當(dāng)理解的是，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進(jìn)或變換，而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護范圍。

sequencelisting

<110>福州大學(xué)

<120>一種堿性耐鹽普魯蘭酶pula及其基因和應(yīng)用

<130>10

<160>10

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1184

<212>prt

<213>氨基酸序列

<400>1

metalaaspglyglythralaleuleuthrvalaspasnglyserleu

151015

ilealaglugluilegluthrproaspaspseraspgluglnleuglu

202530

gluthrgluvalglugluglyphepheargilehisphealaserleu

354045

proseraspasparggluthrleuglyleutrpiletrpasnaspval

505560

lysgluprosergluasnargglyalatrpproasnglyalathrser

65707580

phethrglualavalglnthrasptyrglytrptyrmetaspileglu

859095

leuglugluasnproglnserileglypheleuileasnservalser

100105110

glyasnasnleuserglyaspilevalleuargleuleuthrserglu

115120125

metasnglnvaltrpleuasphisglutyralametthrprotyrglu

130135140

proleuleuglulysaspmetileargileasntyrlysargaspasn

145150155160

asnasptyraspasptrpglyleutrpthrtrpaspaspvalalaglu

165170175

prothrgluasntrpproalaglyalaglnaspseraspglyvalgly

180185190

proasnglythrtyrpheasnleuthrleualagluaspseraspgln

195200205

ileglypheleupheleuasnlysalaaspglyserglnthrargasp

210215220

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225230235240

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245250255

metileargalagluleuilesergluthrgluilegluvalphephe

260265270

hisserthrgluglyleugluglualaaspleuleugluleuilegln

275280285

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290295300

hisaspargargvalvalserleuthrglyasppheservalgluhis

305310315320

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325330335

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355360365

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405410415

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420425430

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450455460

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