本發(fā)明涉及生物化工領(lǐng)域，尤其涉及一種融合蛋白基因、工程菌及其在制備9α-羥基-雄烯二酮中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

9α-oh-ad是一種重要的化工中間體，在甾體類物質(zhì)生產(chǎn)中起著重要作用。利用9α-oh-ad可以合成多種甾體原料藥，比如氫化可的松、地塞米松、依普利酮、17α-oh黃體酮、可的松等。9α-oh-ad的結(jié)構(gòu)式如式(1)所示：

目前，9α-oh-ad主要是以雄烯二酮(ad)為原料，通過多步化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行制備獲得。但化學(xué)法普遍存在著制備路線長、選擇性差、反應(yīng)復(fù)雜、收率低和污染嚴(yán)重等問題。因此，開發(fā)環(huán)境友好的9α-羥基-雄烯二酮生物制備方法來克服化學(xué)合成法的不利之處就顯得尤為重要。

現(xiàn)今已發(fā)現(xiàn)多種微生物可以用來制備9α-oh-ad，如諾卡氏菌(nocardia)、紅球菌(rhodococcus)等可以對雄烯二酮(ad)進(jìn)行9α-羥基化生成9α-oh-ad；分支桿菌(mycobacterium)等可以通過對植物甾醇底物進(jìn)行側(cè)鏈降解以及9α-羥基化等一系列的反應(yīng)來生成9α-oh-ad。

在微生物轉(zhuǎn)化法制備9α-oh-ad的過程中，在甾體母核上進(jìn)行的9α-羥基化反應(yīng)是其中的關(guān)鍵步驟，催化這一反應(yīng)的關(guān)鍵酶是3-甾酮-9α-羥基化酶(ksh)。ksh是一個雙組份酶，由3-甾酮-9α-羥基化酶(ksha)和3-甾酮-9α-羥基化酶還原酶(kshb)組成。其中，ksha是ksh的活性中心，負(fù)責(zé)甾體的9α-羥基化的主反應(yīng)；kshb是ksh系統(tǒng)的還原酶組件，負(fù)責(zé)將來自于輔酶的自由電子傳遞給ksha，使其從氧化態(tài)變成還原態(tài)并不斷的催化甾體進(jìn)行9α-羥基化反應(yīng)。

近年來，雖然在工業(yè)上利用紅平紅球菌或分支桿菌通過發(fā)酵法合成9α-oh-ad的效率在不斷提升，但仍然存在著菌體活力不高、發(fā)酵產(chǎn)率較低、反應(yīng)周期長和成本較高等問題。所以，制備高3-甾酮-9α-羥基化酶催化活力的工程菌并將其用于9α-oh-ad的制備，對于降低生產(chǎn)成本和縮短反應(yīng)周期就顯得十分重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種融合蛋白、工程菌以及利用該工程菌表達(dá)的融合蛋白催化底物雄烯二酮反應(yīng)生成9α-羥基-雄烯二酮，融合蛋白比活力高且產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率高。

本發(fā)明提供了一種融合蛋白基因，所述融合蛋白基因包括編碼3-甾酮-9α-羥基化酶的基因和編碼細(xì)胞色素p450bm-3酶中黃素域的基因。

p450bm-3是一個可溶性融合蛋白，由催化域(血紅素域)和還原域(黃素域)組成，還原域又分為fmn亞域和fad亞域，與kshb的結(jié)構(gòu)相似。p450bm-3的催化機(jī)制如下：底物和氧分子與血紅素域上的血紅素相結(jié)合，同時從nadph處獲得一個電子，電子通過黃素域的fad與fmn傳遞到血紅素，氧分子被還原分解，其中一個氧加入底物中，另外一個氧生成水，與ksha和kshb的協(xié)同催化機(jī)制極其相似。

所以，本專利選擇p450bm-3酶的黃素域作為電子傳遞基團(tuán)為ksha提供電子加強(qiáng)ksha酶的催化能力。在分子操作上，將p450bm-3基因編碼催化域的部分切除，更換為ksha基因，完成ksha與p450bm-3黃素域的融合表達(dá)。

我們分別以來源于分枝桿菌mycobacteriumtuberculosish37rv的3-甾酮-9α-羥基化酶(genbank數(shù)據(jù)庫中基因編碼堿基序列登錄號為rv3526)和紅平紅球菌(rhodococcuserythropolis)sq1的3-甾酮-9α-羥基化酶(其堿基序列在genbank的登錄號為ay083508.1)進(jìn)行了表達(dá)研究。

作為優(yōu)選，所述3-甾酮-9α-羥基化酶來源于紅平紅球菌(rhodococcuserythropolis)sq1，其堿基序列在genbank的登錄號為ay083508.1；所述細(xì)胞色素p450bm-3酶來源于巨大芽孢桿菌(bacillusmegateriumnbrc15308)，該巨大芽孢桿菌也可命名為(bacillusmegateriumatcc14581)，即該菌株在nbrc菌種庫中的編號為15308，在atcc菌種庫中的編號為14581，其堿基序列在genbank的登錄號為：cp009920.1。

進(jìn)一步地，所述融合蛋白基因的堿基序列如seqidno.1所示。

上述3-甾酮-9α-羥基化酶基因和細(xì)胞色素p450bm-3酶基因均可通過克隆或者化學(xué)合成的方法獲得。

本發(fā)明提供了一種包含所述融合蛋白基因的表達(dá)載體或重組質(zhì)粒。

本發(fā)明還提供了一種由所述的融合蛋白基因編碼的融合蛋白。

本發(fā)明所述的融合蛋白可應(yīng)用在催化雄烯二酮反應(yīng)生成9α-羥基-雄烯二酮的反應(yīng)中。

進(jìn)一步地，編碼所述融合蛋白的重組基因的堿基序列如seqidno.1所示，其質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖如圖5所示。該融合蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示。

本發(fā)明中，首先利用genbank(登錄號ay083508.1)數(shù)據(jù)庫獲得來自于紅平紅球菌(rhodococcuserythropolis)sq1中的ksha的蛋白序列，將蛋白序列轉(zhuǎn)化為核酸序列，并將核酸序列上的密碼子替換為在大腸桿菌中使用頻率高的密碼子，得到可以在大腸桿菌中高效表達(dá)ksha-reyh的基因序列，然后對該優(yōu)化序列進(jìn)行全基因合成；再在優(yōu)化序列的兩端加入nhei和xhoi酶切位點(diǎn)，將合成的基因連入pet28a(+)載體，獲得重組表達(dá)載體pet28a-ksha-reyh；最后，將pet28a-ksha-reyh表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3)細(xì)胞，得到3-甾酮-9α-羥基化酶工程菌bl21(de3)-pet28a-ksha-reyh。

本發(fā)明將3-甾酮-9α-羥基化酶來源于紅平紅球菌(rhodococcuserythropolis)sq1的ksha在大腸桿菌中異源表達(dá)，并通過基因重組技術(shù)，將ksha與p450bm-3的黃素域進(jìn)行融合表達(dá)，最終得到融合蛋白ksha-p450bm-3，并使用重組工程菌催化底物雄烯二酮(ad)制備9α-羥基-雄烯二酮(9α-oh-ad)。

具體地，本發(fā)明將p450bm-3基因的血紅素域替代為ksha-reyh基因，使ksha-reyh基因與p450bm-3編碼黃素域的基因序列連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pet-28a-ksha-p450，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)宿主。

進(jìn)一步地，本發(fā)明使用定點(diǎn)突變對pet28a-p450bm-3重組質(zhì)粒進(jìn)行載體改造，在編碼血紅素域與編碼黃素域的基因序列中間進(jìn)行一個沉默突變，插入一個xhoi的酶切位點(diǎn)，再使用一個沉默突變，將載體末端的xhoi的酶切位點(diǎn)去掉；然后，使用nhei和xhoi酶切位點(diǎn)，將ksha-reyh基因連入改造后的pet28a-p450bm-3質(zhì)粒載體，獲得重組表達(dá)載體pet28a-ksha-p450；最后，將pet28a-ksha-p450表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3)細(xì)胞，得到融合蛋白表達(dá)工程菌bl21(de3)-pet28a-ksha-p450。

所以，本發(fā)明還提供了一種工程菌，包括宿主細(xì)胞和轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞的融合蛋白基因，所述融合蛋白基因上文所述。

其中，所述宿主細(xì)胞可以為大腸桿菌(e.coli)bl21、大腸桿菌(e.coli)blr、大腸桿菌(e.coli)origami、大腸桿菌(e.coli)novablue或大腸桿菌(e.coli)rosetta。

所述重組基因連接到重組表達(dá)載體上，再轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞內(nèi)；其中，所述重組表達(dá)載體可以為pet-28a(+)，pet-21a(+)，pet-duet。

本發(fā)明還提供了所述的工程菌在催化雄烯二酮反應(yīng)生成9α-羥基-雄烯二酮中的應(yīng)用。

具體地，利用所述的工程菌制備9α-羥基-雄烯二酮的方法，包括：

(1)培養(yǎng)工程菌并誘導(dǎo)酶類表達(dá)，離心取細(xì)胞，用緩沖液重懸，獲得靜息細(xì)胞懸液；

(2)往靜息細(xì)胞懸液中添加底物雄烯二酮進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)完成后，從反應(yīng)液中分離純化得到9α-羥基-雄烯二酮。

作為優(yōu)選，步驟(1)中，所述誘導(dǎo)酶類表達(dá)的方法為：至培養(yǎng)液的od600達(dá)到0.5～1.0，加入0.01～0.5mmiptg，25～30℃溫度下誘導(dǎo)6～12h；步驟(2)中，所述反應(yīng)的溫度為25～30℃，時間為1～24h。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明將3-甾酮-9α-羥基化酶在大腸桿菌中異源表達(dá)，并通過基因重組技術(shù)，將3-甾酮-9α-羥基化酶與細(xì)胞色素p450bm-3酶的黃素域進(jìn)行融合表達(dá)，得到融合蛋白ksha-p450，并使用含有該融合蛋白的重組工程菌催化底物雄烯二酮制備9α-羥基-雄烯二酮，不僅提高了比活力，同時也提高了轉(zhuǎn)化率。

附圖說明

圖1為本發(fā)明融合蛋白ksha-p450bm-3結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為重組載體pet28a-ksha-reyh和pet28a-ksha-mtyh經(jīng)nhei與xhoi雙酶切后的核酸電泳圖。

圖3為質(zhì)粒pet28a-ksha-reyh的質(zhì)粒構(gòu)建圖譜。

圖4為重組質(zhì)粒pet28a-ksha-p450的雙酶切驗(yàn)證結(jié)果；

其中，泳道1-5：nhei與xhoi雙酶切；泳道6-10：xhoi與ecori雙酶切。

圖5為重組質(zhì)粒pet28a-ksha-p450的質(zhì)粒構(gòu)建圖譜。

圖6為ksha與融合蛋白的sds-page蛋白電泳圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例13-甾酮-9α-羥基化酶工程菌的構(gòu)建

由于大腸桿菌與ksha來源菌分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosish37rv)和紅平紅球菌(rhodococcuserythropolis)sq1的密碼子偏好性有一定的差異性，為了使ksha在大腸桿菌中得到高表達(dá)，首先通過同義轉(zhuǎn)換調(diào)整密碼子偏好性，將ksha基因密碼子替換為在大腸桿菌中使用頻率高的密碼子。優(yōu)化軟件為jcat：(http://www.jcat.de)。

ksha-re改造后的序列(ksha-reyh)與原序列的相似度為81.24％，共改變了224個堿基；同時在優(yōu)化序列的前端和后端分別加上nhei和xhoi酶切位點(diǎn)。

ksha-mt改造后的序列(ksha-mtyh)與原序列的相似度為80.92％，共改變了221個堿基；同時在優(yōu)化序列的前端和后端分別加上nhei和xhoi酶切位點(diǎn)。

優(yōu)化后的基因序列交由上海捷瑞公司合成，使用nhei與xhoi對目的基因和載體雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的基因和載體片段。將回收后的目的基因和載體片段用t4dna連接酶進(jìn)行連接。

將上述連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有50μg/ml卡那霉素的lb固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12h。

挑取長出來的大腸桿菌菌落，于37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)12～15h，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，將提取的質(zhì)粒用nhei和xhoi進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。電泳結(jié)果見附圖2。將酶切結(jié)果正確的轉(zhuǎn)化子，送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行驗(yàn)證。將序列正確的重組質(zhì)粒(如圖3)轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞，得到3-甾酮-9α羥基化酶工程菌bl21(de3)-pet28a-ksha-reyh(ksha-reyh來源于紅平紅球菌)和bl21(de3)-pet28a-ksha-mtyh(ksha-mtyh來源于分枝桿菌)。

實(shí)施例2兩重組菌株bl21(de3)-pet28a-ksha-reyh和bl21(de3)-pet28a-ksha-mtyh的活性驗(yàn)證

將工程菌bl21(de3)-pet28a-ksha-mtyh與bl21(de3)-pet28a-ksha-reyh活化后，以2％的接種量接種到tb培養(yǎng)基中。在37℃培養(yǎng)至od600為0.5～1.0時，加入iptg至終濃度為0.5mmol·l^-1誘導(dǎo)表達(dá)，同時加入溶解于二甲基亞砜(dmso)中的底物ad至終濃度為300μmol·l^-1。于搖床中30℃反應(yīng)振蕩反應(yīng)，在加入底物ad的24h后，取樣，12000rpm離心2min，取上清液，使用水相濾膜過濾后，經(jīng)hplc高效液相色譜檢測。

檢測條件為：液相柱采用hypersilods2c18(4.6mm×250mm)，5μm流動相為甲醇：水＝5：5；流速為1ml/min；柱溫40℃；紫外檢測波長254nm；進(jìn)樣體積20μl。

經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，重組菌株bl21(de3)-pet28a-ksha-mtyh轉(zhuǎn)化ad產(chǎn)生9α-oh-ad的得率很低，在tb培養(yǎng)基中經(jīng)24h的反應(yīng)，9α-oh-ad的得率僅為2.7％。而重組菌株bl21(de3)-pet28a-ksha-reyh卻可以較好的轉(zhuǎn)化ad產(chǎn)生9α-oh-ad，在色譜圖中可以明顯的看出，9α-oh-ad吸收峰的出現(xiàn)，底物ad吸收峰的減小，9α-oh-ad的得率為63.86％，是菌株bl21(de3)-pet28a-ksha-mtyh的23.57倍。

通過本次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，我們可以得出結(jié)論：來源于紅平紅球菌(rhodococcuserythropolis)sq1的ksha可以以ad作為理性底物生產(chǎn)9α-oh-ad，而來源于分支桿菌(mycobacteriumtuberculosis)h37rv的ksha的理想底物并非ad。

實(shí)施例3表達(dá)融合蛋白ksha-p450bm-3工程菌的構(gòu)建

首先，使用定點(diǎn)突變技術(shù)對pet28a-p450bm-3重組質(zhì)粒進(jìn)行載體改造：

(1)在編碼p450bm-3的血紅素域與編碼p450bm-3的黃素域的基因序列中間進(jìn)行一個沉默突變，插入一個xhoi的酶切位點(diǎn)；

(2)再使用一個沉默突變，將pet28a-p450bm-3載體多克隆位點(diǎn)末端的xhoi的酶切位點(diǎn)去除。

使用nhei與xhoi對目的基因和改造后的載體雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的基因和載體片段。將回收后的目的基因和載體片段用t4dna連接酶進(jìn)行連接。

將上述連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有50μg/ml卡那霉素的lb固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12h。

挑取長出來的大腸桿菌菌落，于37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)12～15h，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，將提取的質(zhì)粒用nhei、xhoi和xhoi、ecori進(jìn)行兩組雙酶切驗(yàn)證。電泳結(jié)果見附圖4。

將酶切結(jié)果正確的轉(zhuǎn)化子，送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行驗(yàn)證。將序列正確的重組質(zhì)粒(如圖5)轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞，得到融合蛋白表達(dá)工程菌bl21(de3)-pet28a-ksha-p450。融合蛋白的基因序列見序列表seqidno.1。

實(shí)施例43-甾酮-9α-羥基化酶(ksha)以及融合蛋白ksha-p450bm-3的誘導(dǎo)表達(dá)

挑取bl21(de3)-pet28a-ksha-reyh、bl21(de3)-pet28a-ksha-p450單菌落，于37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)12-15h；然后以2％的接種量接種于裝有50ml含有卡那霉素50μg/ml的lb培養(yǎng)基的250ml的三角瓶中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)；待菌液生長到od600到0.6～0.8時，加入終濃度為0.5mm的iptg；于28℃、150rpm誘導(dǎo)表達(dá)；誘導(dǎo)表達(dá)6h后，離心，棄去上清液，收集菌體沉淀，使用磷酸緩沖液(0.2mm，ph7.5)洗滌菌體后，加入5ml破胞緩沖液重懸菌體，使用超聲破胞儀破胞(功率300w，90個循環(huán)：超聲3s，間歇6s)，在4℃、13000rpm的條件下離心30min，收集上清液，即得到粗酶液。

取10μl上述兩種粗酶液，加入10μl的6×蛋白電泳緩沖液，再加入40μl的超純水，混合均勻后，將樣品在水浴鍋中100℃加熱5min，反應(yīng)結(jié)束后，取出樣品并立即置于冰上，防止蛋白復(fù)性。使用sds-page電泳分析蛋白表達(dá)結(jié)果，使用5％的濃縮膠、10％的分離膠。

另取大腸桿菌bl21(de3)-pet28a-p450bm-3作為陰性對照，其他處理?xiàng)l件與前面相同。

電泳結(jié)果圖見附圖6，由圖中可以看出重組菌株bl21(de3)-pet-28a-ksha-reyh在40kd與50kd條帶間，樣品組較對照組多一條條帶，且條帶明顯，分子量大小與44.5kd的ksha相吻合；重組菌株bl21(de3)-pet28a-ksha-reyh-p450bm-3在100kd與120kd條帶間，樣品組較對照組多一條條帶，且條帶明顯，分子量大小與111.68kd的融合蛋白相吻合。

實(shí)施例5

取保存與冰箱內(nèi)的甘油菌，向5ml含有卡那霉素50μg/ml的lb培養(yǎng)基中接入10μl的甘油菌，于37℃、200rpm振蕩過夜；取上一步的新鮮菌液，接種于50ml含有50μg/ml卡那霉素的tb培養(yǎng)基(胰蛋白胨12g/l、酵母提取物24g/l、甘油4ml/l、kh2po417mmol/l、k2hpo472mmol/l)中，接種量2％，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)；待菌液生長到od600到0.6～0.8時，加入終濃度為0.5mm的iptg，然后于28℃、150rpm進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

誘導(dǎo)表達(dá)11h后，對菌體取樣，以無菌發(fā)酵培養(yǎng)液為空白對照，在波長600nm處測量菌體的od600作為菌體生物量的數(shù)值。收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體，使用pbs緩沖液洗滌一次后，再次使用pbs緩沖液重懸菌體，加入終濃度為200μm的底物ad(投料底物采用乙醇溶解)，使用恒溫金屬振蕩器在30℃、800rpm的條件下進(jìn)行反應(yīng)。

在反應(yīng)的不同時間點(diǎn)取樣，測定體系中產(chǎn)物的含量。樣品12000rpm離心1min，取上清液，采用水相濾膜過濾后，采用hplc高效液相色譜分析產(chǎn)物的含量。液相色譜分析條件：采用hypersilods2c18(4.6mm×250mm)，5μm流動相為甲醇：水＝5：5；流速為1ml/min；柱溫40℃；紫外檢測波長254nm；進(jìn)樣體積20μl。產(chǎn)物峰面積關(guān)聯(lián)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到產(chǎn)物濃度。

以單獨(dú)表達(dá)ksha-reyh的菌株作為實(shí)驗(yàn)對照組，所有實(shí)驗(yàn)操作方法與實(shí)驗(yàn)組相一致。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：反應(yīng)兩個小時，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)化率為43.49％，菌體比活力為264.96nmol/(min·g)是對照組的2.3倍。反應(yīng)十二個小時后，反應(yīng)組的轉(zhuǎn)化率達(dá)到71.69％，菌體比活力為72.79nmol/(min·g)，比活是對照組的3.26倍。

實(shí)施例6

將實(shí)施例5中的誘導(dǎo)時間更改為6h，其余條件保持不變，在反應(yīng)4h時取樣，菌體比活力為48.30nmol/(min·g)，比活是對照組的3.14倍。

sequencelisting

<110>浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院

<120>一種融合蛋白、工程菌及其在制備9α-羥基-雄烯二酮中的應(yīng)用

<130>

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>3021

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

atggctctgggtaccggtccgctgaccaccaccgacgcttctacccagtctggtgctggt60

gaagaaatccgtgaaatcgaagctgctgctccgccggctcgtttcgctcgtggttggcac120

tgcctgggtctgtctaacacctaccgtgacggtcagccgcaccagatcgaagctttcggt180

acctctctggttgttttcgctgactctaaaggtgacatcaaaatcctggacgcttactgc240

cgtcacatgggtggtaacctggctcacggtaccgttaaaggtgactctatcgcttgcccg300

ttccacgactggcgttggggtggtaacggtaaatgcaccgctatcccgtacgctcgtcgt360

gttccgccgctggctaaaacccgtgcttggaccaccctggaaaaaaacggtcagctgttc420

gtttggcacgacccgcagggtaacccgccgccggctgaagttaccatcccggacatcgaa480

ggtttcggttctgacgaatggtctgactggtcttggaacaccctgaccatcgaaggttct540

cactgccgtgaaatcgttgacaacgttgttgacatggctcacttcttctacgttcactac600

tctttcccgaaatacttcaaaaacatcttcgaaggtcacgttgcttctcagtacatggaa660

tctgttggtcgtgaagacatcatctctggtaccaactacggtgacccgaacgctgttctg720

cgttctgacgcttcttacttcggtccgtcttacatgatcgactggatcaaatctgaagct780

aacggtcagatcatcgaaaccgttctgatcaactgccactacccgatctctaacaacgct840

ttcgttctgcagtacggtgctatggttaaaaaactgccgggtatggacgacgaatctacc900

gctgctatggctgctcagttcaccgaaggtgttgaaatgggtttcctgcaggacgttgaa960

atctggaaaaacaaagctccgatcgacaacccgctgctgtctgaagaagacggtccggtt1020

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