本發(fā)明屬于病毒分子檢測技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種鯽魚冠狀病毒hb93的數(shù)字rt-pcr檢測引物及應(yīng)用。
背景技術(shù):
國際病毒分類委員會(internationalcommitteeontaxonomyofviruses,ictv)于2012年發(fā)表了最新的病毒分類第九次報(bào)告,將套式病毒目(nidovirales)中的冠狀病毒科(coronaviridea)中新設(shè)冠狀病毒亞科(coronavirinea)和環(huán)曲病毒亞科(torovirinae)。
冠狀病毒科是一類線形單股正鏈rna病毒,最早于1937年從雞身上分離出來,almeida等對這些病毒進(jìn)行了形態(tài)學(xué)研究,電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)這些病毒的包膜上有形似日冕的棘突,故提出命名這類病毒為冠狀病毒[1]。1975年,國際病毒命名和分類委員會正式命名了冠狀病毒科。2002-2003年期間,自我國局部地區(qū)發(fā)生的非典型肺炎,即由冠狀病毒屬的嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒(sars-cov)引起,世界上有30多個(gè)國家和地區(qū)相繼報(bào)道出現(xiàn)病例,病死率超過10%。2012年,中東地區(qū)開始出現(xiàn)新型冠狀病毒,病死率超過50%,引起了世界范圍的廣泛關(guān)注,造成社會對冠狀病毒的恐慌。因此,對冠狀病毒進(jìn)行深入研究具有重要意義。
目前對冠狀病毒科的研究主要集中在冠狀病毒亞科,而對環(huán)曲病毒亞科研究甚少。其中,2006年鳊魚病毒屬(bafinivirus)的中的鳊魚病毒(whitebreamvirus)由schützeh等科學(xué)家在鳊魚體內(nèi)發(fā)現(xiàn),這也是目前ictv分類中確定的唯一以水生動物為宿主的冠狀病毒。
目前鯽魚冠狀病毒(cruciancarpbafinivirus,ccbv)尚無公開報(bào)道,更也無有效的檢測方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的在于提供了一種鯽魚冠狀病毒hb93的數(shù)字rt-pcr檢測引物,所述的引物如下:
f:5'-ctatggaatggaagaaacacgac-3'
r:5'-gagagttgatgtcatagctacaag-3'
p:5'-fam-ctgggacaacaccaaaaccacctaag-tamra-3'。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供了一種鯽魚冠狀病毒hb93的數(shù)字rt-pcr檢測引物的應(yīng)用。所述的引物可用于制備檢測鯽魚冠狀病毒的檢測試劑盒。
為了達(dá)到上述目的,本發(fā)明采取以下技術(shù)措施:
一種鯽魚冠狀病毒hb93的數(shù)字rt-pcr檢測引物,所述的引物如下:
f:5'-ctatggaatggaagaaacacgac-3'
r:5'-gagagttgatgtcatagctacaag-3'
p:5'-fam-ctgggacaacaccaaaaccacctaag-tamra-3'。
一種鯽魚冠狀病毒hb93的數(shù)字rt-pcr檢測引物的應(yīng)用,包括利用上述引物制備檢測鯽魚冠狀病毒的檢測試劑盒。
優(yōu)選的,當(dāng)制備成試劑盒時(shí),該試劑盒的非診斷性檢測方法包括:
一種鯽魚冠狀病毒hb93的數(shù)字rt-pcr檢測方法,步驟包括:
1)提取待測樣品的rna并逆轉(zhuǎn)錄為cdna;
2)微滴pcr
擴(kuò)增體系:2×supermix10μl、10μm上下游引物各0.8μl、10μm探針0.4μl、cdna模板2μl、ddh2o補(bǔ)足至20μl。
反應(yīng)體系:50℃熱激活300s;95℃預(yù)變性300s;95℃變性15s,60℃退火及延伸60s,共50個(gè)循環(huán);在60℃下采集熒光信號。
3)結(jié)果判定
(1)在利用數(shù)字pcr進(jìn)行擴(kuò)增的過程中,陽性孔的判定方法為:出現(xiàn)明顯區(qū)別于陰性反應(yīng)孔的擴(kuò)增信號,這個(gè)反應(yīng)孔記為陽性擴(kuò)增孔;陽性樣品的判定方法為:在相同樣品的三個(gè)平行組里面,至少出現(xiàn)一個(gè)組還有陽性擴(kuò)增孔,就說明檢測樣品中含有靶向病毒成分;
(2)陽性質(zhì)控品反應(yīng)孔中產(chǎn)生陽性結(jié)果以及陰性質(zhì)控品反應(yīng)孔中產(chǎn)生陰性結(jié)果時(shí),該實(shí)驗(yàn)視為有效實(shí)驗(yàn),否則實(shí)驗(yàn)無效,需要重新更換反應(yīng)試劑,并重新進(jìn)行;
(3)當(dāng)待測樣品反應(yīng)管中為陰性結(jié)果時(shí),則說明未檢測到鯽魚冠狀病毒核酸;待測樣品反應(yīng)管中為陽性結(jié)果,則說明待測樣品中含有鯽魚冠狀病毒核酸。
以上所述反應(yīng)體系適合于從病魚組織、細(xì)胞中提取得到的rna樣品,并逆轉(zhuǎn)錄成cdna,可以實(shí)現(xiàn)對鯽魚冠狀病毒的精準(zhǔn)檢測。
在本發(fā)明所提供的方法中,可以利用本領(lǐng)域常規(guī)的數(shù)字pcr儀器完成檢測過程。
與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
利用本發(fā)明所提供的數(shù)字rt-pcr檢測方法和試劑盒可以實(shí)現(xiàn)對含鯽魚冠狀病毒樣品的精準(zhǔn)檢測,靈敏度可以達(dá)到2個(gè)拷貝。此外,該方法步驟簡便易于操作,因此在實(shí)際應(yīng)用中具有很大的靈活性,是一種檢測鯽魚冠狀病毒的有效方法。
附圖說明
圖1為本發(fā)明提供的引物的特異性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。
圖2為本發(fā)明提供的引物的靈敏度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖。
具體實(shí)施方式
以下將對本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)的說明。應(yīng)當(dāng)理解的是,此處所描述的具體實(shí)施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明,并不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明所述技術(shù)方案,如未特別說明,均為本領(lǐng)域的常規(guī)方案,所用試劑或原料,如未特別說明,均購自商業(yè)渠道或是已公開。
實(shí)施例1:
一種鯽魚冠狀病毒hb93(本發(fā)明或稱為ccbv-hb93),其分離過程如下:
1)將攜帶病毒的鯽魚肝、腦、脾、腎等組織取出并碾磨后,培養(yǎng)基稀釋100倍,2000rpm離心后取上清過濾,接種到草魚性腺細(xì)胞(grasscarpovarycellline,gco)單層,25℃培養(yǎng)7天,產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)(cpe),可見gco細(xì)胞收縮變圓、折光度增加,部分細(xì)胞開始脫落,細(xì)胞單層開始破裂。
培養(yǎng)基:m199,10%胎牛血清,ph7.0~7.2
2)收集病變細(xì)胞,利用透射電鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。
3)收集病毒,對其進(jìn)行全基因組測序,序列為seqidno.1所示。
鯽魚冠狀病毒的形態(tài)特征:病毒呈棒狀,四周有明顯的日冕狀棘突結(jié)構(gòu),與典型的冠狀病毒形態(tài)相符,該病毒已于2017年5月11日送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行保藏,分類命名:鯽魚冠狀病毒(cruciancarpbafinivirus)hb93,保藏編號:cctccno:v201722,地址:中國武漢武漢大學(xué)。
實(shí)施例2:
一種鯽魚冠狀病毒hb93的數(shù)字rt-pcr檢測引物,所述的引物如下:
f:5'-ctatggaatggaagaaacacgac-3'
r:5'-gagagttgatgtcatagctacaag-3'
p:5'-fam-ctgggacaacaccaaaaccacctaag-tamra-3'。
實(shí)施例3:
利用鯽魚冠狀病毒數(shù)字rt-pcr檢測引物和探針對鯽魚冠狀病毒的檢測,方法包括:
1.鯽魚組織或感染細(xì)胞總rna的提取及cdna的合成:采用
2.數(shù)字pcr擴(kuò)增反應(yīng)
1)配制微滴pcr反應(yīng)體系:微滴pcr擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)體系,以20μl計(jì):10μl2×supermix,10μm上下游引物各0.8μl,10μm探針0.4μl,cdna模板2μl,ddh2o補(bǔ)足至20μl。
2)在微滴pcr的生成芯片上,加入步驟1)中的20μl微滴pcr反應(yīng)體系,再加入70μl的微滴生成用油,進(jìn)行微滴生成步驟,完成微滴生成步驟后,將微滴化的反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至96孔板中,封膜。
3)將封膜后的96孔板放入pcr擴(kuò)增儀中,pcr擴(kuò)增程序?yàn)?0℃熱激活300s;95℃預(yù)變性300s;95℃變性15s,60℃退火及延伸60s,共50個(gè)循環(huán);
完成pcr擴(kuò)增后,將微滴吸入流式熒光檢測器中,在60℃下進(jìn)行熒光檢測。
出現(xiàn)明顯區(qū)別于陰性反應(yīng)孔的擴(kuò)增信號,這個(gè)反應(yīng)孔記為陽性擴(kuò)增孔;陽性樣品的判定方法為:在同一組的三個(gè)平行組里面,至少出現(xiàn)一個(gè)組還有陽性擴(kuò)增孔,就說明檢測樣品中含有鯽魚冠狀病毒核酸。陽性質(zhì)控品反應(yīng)孔中產(chǎn)生陽性結(jié)果以及陰性質(zhì)控品反應(yīng)孔中產(chǎn)生陰性結(jié)果時(shí),該實(shí)驗(yàn)視為有效實(shí)驗(yàn),否則實(shí)驗(yàn)無效,需要重新更換反應(yīng)試劑,并重新進(jìn)行;當(dāng)待測樣品反應(yīng)管中為陰性結(jié)果時(shí),則說明未檢測到鯽魚冠狀病毒核酸;待測樣品反應(yīng)管中為陽性結(jié)果,則說明待測樣品中含有鯽魚冠狀病毒核酸。
實(shí)施例4:
鯽魚冠狀病毒數(shù)字rt-pcr引物特異性實(shí)驗(yàn)
利用實(shí)施例3所述的方法,對表1中的待檢病毒樣品進(jìn)行檢測,同時(shí)設(shè)置陰性對照組(雙蒸水)和陽性對照組(ccbv-hb93),待檢病毒樣品具體為:鯉春病毒血癥病毒(svcv),草魚呼腸孤病毒873(gcrv-873),草魚呼腸孤病毒9014(gcrv-9014),草魚呼腸孤病毒104(gcrv-104),傳染性造血器官壞死病毒(ihnv),傳染性胰腺壞死病毒(ipnv),病毒性出血性敗血癥病毒(vhsv)。
表1鯽魚冠狀病毒rt-pcr檢測試劑盒特異性試驗(yàn)
結(jié)果如表1所示,僅陽性對照組(ccbv-hb93)可檢測到擴(kuò)增信號(圖1),其余組均無擴(kuò)增信號,說明鯽魚冠狀病毒數(shù)字rt-pcr檢測引物具備很強(qiáng)的特異性。
實(shí)施例5:
鯽魚冠狀病毒數(shù)字rt-pcr引物靈敏度實(shí)驗(yàn):
本實(shí)驗(yàn)采用鯽魚冠狀病毒陽性樣品ccbv-hb93的cdna進(jìn)行10倍梯度稀釋。通過實(shí)施例3給出的檢測方法進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示本體系在2個(gè)拷貝的模板量下,可以產(chǎn)生穩(wěn)定的擴(kuò)增,即本數(shù)字pcr的檢測方法在擴(kuò)增體系為20ul時(shí),最低可檢測到為2個(gè)拷貝(圖2)。
雖然,上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述,但在本發(fā)明基礎(chǔ)上,可以對之作一些修改或改進(jìn),這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此,在不
偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn),均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
sequencelisting
<110>湖北出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院安徽出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心中華人民共和國龍巖出入境檢驗(yàn)檢疫局
<120>一種鯽魚冠狀病毒hb93的數(shù)字rt-pcr檢測引物及應(yīng)用
<130>一種鯽魚冠狀病毒hb93的數(shù)字rt-pcr檢測引物及應(yīng)用
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