本發(fā)明屬于病毒分子檢測
技術領域：
，具體涉及一種鯽魚冠狀病毒hb93及rt-pcr檢測引物及應用。技術背景國際病毒分類委員會(internationalcommitteeontaxonomyofviruses,ictv)于2012年發(fā)表了最新的病毒分類第九次報告，將套式病毒目(nidovirales)中的冠狀病毒科(coronaviridea)中新設冠狀病毒亞科(coronavirinea)和環(huán)曲病毒亞科(torovirinae)。冠狀病毒科是一類線形單股正鏈rna病毒，最早于1937年從雞身上分離出來，almeida等對這些病毒進行了形態(tài)學研究，電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)這些病毒的包膜上有形似日冕的棘突，故提出命名這類病毒為冠狀病毒[1]。1975年，國際病毒命名和分類委員會正式命名了冠狀病毒科。2002-2003年期間，自我國局部地區(qū)發(fā)生的非典型肺炎，即由冠狀病毒屬的嚴重急性呼吸綜合征病毒(sars-cov)引起，世界上有30多個國家和地區(qū)相繼報道出現(xiàn)病例，病死率超過10％。2012年，中東地區(qū)開始出現(xiàn)新型冠狀病毒，病死率超過50％，引起了世界范圍的廣泛關注，造成社會對冠狀病毒的恐慌。因此，對冠狀病毒進行深入研究具有重要意義。目前對冠狀病毒科的研究主要集中在冠狀病毒亞科，而對環(huán)曲病毒亞科研究甚少。其中，2006年鳊魚病毒屬(bafinivirus)的中的鳊魚病毒(whitebreamvirus)由schützeh等科學家在鳊魚體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，這也是目前ictv分類中確定的唯一以水生動物為宿主的冠狀病毒。目前鯽魚冠狀病毒(cruciancarpbafinivirus,ccbv)尚無公開報道，更也無有效的檢測方法。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供了一種鯽魚冠狀病毒hb93，所述的病毒分離自鯽魚病變細胞，該病毒已于2017年5月11日送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心進行保藏，分類命名：鯽魚冠狀病毒(cruciancarpbafinivirus)hb93，保藏編號：cctccno：v201722，地址：中國武漢武漢大學。本發(fā)明的另一個目的在于提供了基于鯽魚冠狀病毒hb93的全序列(seqidno.1所示)與其他病毒的全序列的差異設計的引物，利用該引物可用于檢測鯽魚冠狀病毒hb93。本發(fā)明的還有一個目的在于提供一種鯽魚冠狀病毒hb93rt-pcr檢測引物，所述的引物為f1：5'-caaagtaaaccctggaga-3'，r1：5'-atcaatgatggtgcagtt-3'；f2：5'-tgaaacaatccaagaaga-3'，r2：5'-acaagttatagccggtgt-3'。本發(fā)明還有一個目的在于提供了鯽魚冠狀病毒hb93的應用，所述的應用包括利用該病毒制備成鯽魚冠狀病毒病疫苗，或是制備成鯽魚冠狀病毒的實驗室對照品。本發(fā)明的最后一個目的在于提供一種鯽魚冠狀病毒hb93rt-pcr檢測引物的應用，包括利用所述的應用制備成鯽魚冠狀病毒檢測試劑盒。為了達到上述目的，本發(fā)明采取以下技術措施：一種鯽魚冠狀病毒hb93，所述的病毒分離自鯽魚病變細胞，該病毒已于2017年5月11日送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心進行保藏，分類命名：鯽魚冠狀病毒(cruciancarpbafinivirus)hb93，保藏編號：cctccno：v201722，地址：中國武漢武漢大學。將鯽魚冠狀病毒hb93(本發(fā)明或稱為ccbv-hb93)接種到草魚性腺細胞(grasscarpovarycellline,gco)單層，25℃培養(yǎng)7天，產(chǎn)生細胞病變效應(cpe)，可見gco細胞收縮變圓、折光度增加，部分細胞開始脫落，細胞單層開始破裂。培養(yǎng)基：m199，10％胎牛血清，ph7.0～7.2。鯽魚冠狀病毒hb93的形態(tài)特征：病毒呈棒狀，四周有明顯的日冕狀棘突結構，與典型的冠狀病毒形態(tài)相符。鯽魚冠狀病毒hb93的應用，所述的應用包括利用該病毒制備成鯽魚冠狀病毒病疫苗，或是制備成鯽魚冠狀病毒的實驗室對照品。本發(fā)明的保護內(nèi)容還包括基于鯽魚冠狀病毒hb93的全序列(seqidno.1所示)與其他病毒的全序列的差異設計的引物，所述的引物包括基于該差異序列，利用現(xiàn)有技術設計的諸如熒光定量引物，lamp引物，數(shù)字pcr引物等，利用該引物可用于檢測鯽魚冠狀病毒hb93。一種鯽魚冠狀病毒hb93rt-pcr檢測引物，包括f1：5'-caaagtaaaccctggaga-3'，r1：5'-atcaatgatggtgcagtt-3'；f2：5'-tgaaacaatccaagaaga-3'，r2：5'-acaagttatagccggtgt-3'。一種鯽魚冠狀病毒hb93rt-pcr檢測引物的應用，包括利用上述引物制備成用于檢測鯽魚冠狀病毒檢測試劑盒，或直接用于鯽魚冠狀病毒的檢測。優(yōu)選的，當制備成試劑盒時，該試劑盒的非診斷性檢測方法包括：一種鯽魚冠狀病毒的rt-pcr檢測方法，步驟包括：1)提取待測樣品的rna并逆轉錄為cdna；2)pcr體系采用25μl反應體系：濃度為40μm的兩對引物f1、r1或f2、r2分別各取0.5μl加入兩只pcr反應管，兩個pcr反應管中再分別加入2.5mmdntps2μl，25mmmgcl21.5μl，5utaq聚合酶0.5μl，模板cdna1μl，10×thermopolreactionbuffer2.5μl，用滅菌雙蒸水將兩管反應體系均補齊至25μl。反應條件，95℃預變性5min；95℃30s、48℃30s、72℃30s，30個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。3)檢測結果判定聚合酶鏈式反應擴增的最終反應產(chǎn)物取4μl，加入至含有0.5μg/ml溴化乙錠(eb)染料的2％的瓊脂糖凝膠中，于100v電壓下電泳30min，在凝膠成相系統(tǒng)上成像觀察擴增產(chǎn)物的圖譜。電泳圖片顯示343bp和389bp特征性條帶，則結果為陽性；如無任何條帶，則結果為陰性。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：1.本發(fā)明首次自鯽魚中分離出了冠狀病毒，對于鯽魚冠狀病毒的研究具備開拓性的意義。1.本發(fā)明的方法快速簡便：本發(fā)明所建的rt-pcr方法只需數(shù)小時，相比較傳統(tǒng)病毒分離方法數(shù)天時間，極大的提高了檢測效率。2.本發(fā)明的方法特異性強：兩對引物對靶序列的特異序列區(qū)的識別，保證了pcr方法擴增的高度特異性。附圖說明圖1為本發(fā)明提供的引物的靈敏度的實驗結果示意圖；其中，泳道1：原始模板、泳道2：10倍稀釋、泳道3：100倍稀釋、泳道4：1000倍稀釋、泳道5：10000倍稀釋、泳道6：100000倍稀釋、泳道7：1000000倍稀釋。圖2為利用本發(fā)明提供的引物對感染鯽魚冠狀病毒hb93的鯽魚組織進行檢測的結果示意圖；其中泳道p：陽性對照；m：marker泳道1：待測樣品1；泳道2：待測樣品2；泳道3：待測樣品3；泳道4：待測樣品4。具體實施方式本發(fā)明所述技術方案，如未特別說明，均為本領域的常規(guī)方案，所用試劑或原料，如未特別說明，均購自商業(yè)渠道或是已公開。實施例1：一種鯽魚冠狀病毒hb93，其分離過程如下：1)將攜帶病毒的鯽魚肝、腦、脾、腎等組織取出并碾磨后，培養(yǎng)基稀釋100倍，2000rpm離心后取上清過濾，接種到草魚性腺細胞(grasscarpovarycellline,gco)單層，25℃培養(yǎng)7天，產(chǎn)生細胞病變效應(cpe)，可見gco細胞收縮變圓、折光度增加，部分細胞開始脫落，細胞單層開始破裂。培養(yǎng)基：m199，10％胎牛血清，ph7.0～7.22)收集病變細胞，利用透射電鏡進行形態(tài)學鑒定。3)收集病毒，對其進行全基因組測序，序列為seqidno.1所示。鯽魚冠狀病毒的形態(tài)特征：病毒呈棒狀，四周有明顯的日冕狀棘突結構，與典型的冠狀病毒形態(tài)相符，該病毒已于2017年5月11日送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心進行保藏，分類命名：鯽魚冠狀病毒(cruciancarpbafinivirus)hb93，保藏編號：cctccno：v201722，地址：中國武漢武漢大學。實施例2：基于鯽魚冠狀病毒hb93的全序列(seqidno.1所示)與其他病毒的全序列的差異設計的引物：本發(fā)明以普通pcr為例進行說明，基于該差異序列設計的其他引物，熒光定量引物，lamp引物，數(shù)字pcr引物等，也能完成鯽魚冠狀病毒hb93的檢測。一種鯽魚冠狀病毒hb93rt-pcr檢測引物，包括f1：5'-caaagtaaaccctggaga-3'，r1：5'-atcaatgatggtgcagtt-3'；f2：5'-tgaaacaatccaagaaga-3'，r2：5'-acaagttatagccggtgt-3'。實施例3：利用鯽魚冠狀病毒hb93rt-pcr檢測引物對鯽魚冠狀病毒hb93的檢測，方法包括：1.鯽魚組織或感染細胞總rna的提取及cdna的合成：采用提取待測樣品的總rna。配置逆轉錄反應體系：3μl總rna，oligo(dt)18primer1μl，滅菌雙蒸水8μl，混勻65℃5min后立刻冰??；將5×reactionbuffer4μl，rnase抑制劑1μl，5mmdntps2μl，m-mlv逆轉錄酶1μl加入冰浴的反應液中，混勻后，42℃1h，95℃5min，將獲得cdna模板-20℃保存?zhèn)溆谩?.聚合酶鏈式反應擴增：采用25μl反應體系：濃度為40μm的兩對引物f1、r1或f2、r2分別各取0.5μl加入兩只pcr反應管，再分別加入2.5mmdntps2μl，25mmmgcl21.5μl，5utaq聚合酶0.5μl，模板cdna1μl，10×thermopolreactionbuffer2.5μl，用滅菌雙蒸水將兩管反應體系均補齊至25μl。反應條件，95℃預變性5min；95℃30s、48℃30s、72℃30s，30個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。f1：5'-caaagtaaaccctggaga-3'，r1：5'-atcaatgatggtgcagtt-3'；f2：5'-tgaaacaatccaagaaga-3'，r2：5'-acaagttatagccggtgt-3'。3.聚合酶鏈式反應擴增產(chǎn)物分析：取聚合酶鏈式反應擴增擴增的最終反應產(chǎn)物4μl，加入至含有0.5μg/ml溴化乙錠(eb)染料的2％的瓊脂糖凝膠中，于100v電壓下電泳30min，在凝膠成相系統(tǒng)上成像觀察擴增產(chǎn)物的圖譜。若f1和r1能擴增出343bp且f2和r2能擴增出389bp特征性條帶，則該樣品為陽性；如無任何條帶，則為陰性。實施例4：鯽魚冠狀病毒rt-pcr檢測引物特異性試驗利用實施例3所述的方法，對表1中的待檢病毒樣品進行檢測，同時設置陰性對照組(雙蒸水)和陽性對照組(ccbv-hb93)，待檢病毒樣品具體為：鯉春病毒血癥病毒(svcv)，草魚呼腸孤病毒873(gcrv-873)，草魚呼腸孤病毒9014(gcrv-9014)，傳染性造血器官壞死病毒(ihnv)。表1鯽魚冠狀病毒rt-pcr檢測試劑盒特異性試驗試驗編號名稱擴增結果1ccbv-hb93+2svcv－3gcrv-873－4gcrv-9014－5ihnv－結果如表1所示，僅陽性對照組(ccbv-hb93)可檢測到343bp和389bp特征性條帶，其余組均無特征條帶，說明鯽魚冠狀病毒hb93rt-pcr檢測引物具備很強的特異性。實施例5：鯽魚冠狀病毒rt-pcr檢測引物的靈敏度將濃度為1785ng/μl的ccbv-hb93cdna模板10倍梯度稀釋，利用實施例3的方法，檢測利用本發(fā)明提供的引物pcr的檢測限，結果如圖1所示，可見105倍稀釋還可檢測到目的條帶，也就是最低可檢測17.85pg/μl的cdna模板。實施例6：鯽魚冠狀病毒hb93rt-pcr檢測引物在制備鯽魚冠狀病毒檢測試劑盒中的應用：1.鯽魚組織總rna的提取及cdna的合成：采用提取感染鯽魚冠狀病毒hb93的鯽魚的肝脾腎等內(nèi)臟組織的總rna。配置逆轉錄反應體系：3μl總rna，oligo(dt)18primer1μl，滅菌雙蒸水8μl，混勻65℃5min后立刻冰?。粚?×reactionbuffer4μl，rnase抑制劑1μl，5mmdntps2μl，m-mlv逆轉錄酶1μl加入冰浴的反應液中，混勻后，42℃1h，95℃5min，將獲得cdna模板-20℃保存?zhèn)溆谩?.聚合酶鏈式反應擴增：采用25μl反應體系：濃度為40μm的兩對引物f1、r1或f2、r2分別各取0.5μl加入兩只pcr反應管，再分別加入2.5mmdntps2μl，25mmmgcl21.5μl，5utaq聚合酶0.5μl，模板cdna1μl，10×thermopolreactionbuffer2.5μl，用滅菌雙蒸水將兩管反應體系均補齊至25μl。反應條件，95℃預變性5min；95℃30s、48℃30s、72℃30s，30個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。f1：5'-caaagtaaaccctggaga-3'，r1：5'-atcaatgatggtgcagtt-3'；f2：5'-tgaaacaatccaagaaga-3'，r2：5'-acaagttatagccggtgt-3'。3.聚合酶鏈式反應擴增產(chǎn)物分析：取聚合酶鏈式反應擴增的最終反應產(chǎn)物4μl，加入至含有0.5μg/ml溴化乙錠(eb)染料的2％的瓊脂糖凝膠中，于100v電壓下電泳30min，在凝膠成相系統(tǒng)上成像觀察擴增產(chǎn)物的圖譜。電泳圖片顯示343bp和389bp特征性條帶，則結果為陽性；如無任何條帶，則結果為陰性。結果如圖2所示，陽性對照(鯽魚冠狀病毒hb93)顯示389bp和343bp特征性條帶，陰性(水)對照無明顯條帶，1-4號感染了鯽魚冠狀病毒hb93的鯽魚組織樣品顯示343bp和389bp特征性條帶，說明樣品1-4為鯽魚冠狀病毒陽性，與實際情況相符。實施例7：鯽魚冠狀病毒hb93在制備鯽魚冠狀病毒的實驗室對照品中的應用：即將本發(fā)明提供的鯽魚冠狀病毒hb93作為對照品，將待確認的其他鯽魚冠狀病毒與本發(fā)明的病毒進行生理生化上的比較，并且將待測樣品跟seqidno.1所示序列進行比較。sequencelisting<110>湖北出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心<120>一種鯽魚冠狀病毒hb93及rt-pcr檢測引物及應用<130>一種鯽魚冠狀病毒hb93及rt-pcr檢測引物及應用<160>5<170>patentinversion3.1<210>1<211>26000<212>dna<213>人工序列<400>1ttgaattaccaataaactaccacccgctatcatagcactagacactagcgaactgctagc60ttcctccaagctgcacaacgcaaactgtctttttaactctcctaacctcgaacgcagcgc120aggtaccctcacccggaccacgcgtgtgcccttgactggaaaccctaccttcgatcaggc180cttcgaacgcagcaaaggtaccctcacccggaccacttgtgtgcccctacgcctgctctt240acgtagccccatcctacccacccgccaactcttaacctatcagctttgcccaccgtgacg300actagacgtgatctaactgctactaccaatcctattacaaccaacttgcccaccaagacg360actagagagtgacgtaactgctactgcctaaggcactaccagcgaaatcataatctgctc420ctcttgacccaagacggtttggaacggtgctactagtgaactcacttctgctccttgcga480cccaaagacggttattatttggaaaacctcttacagactagagtcttgaatctccactgc540tactgtcgaagtcggtgtgctgcctttataaagccggtgaactgctactgttcttagaac600attatcaggaatcctgctgaattttgtcagctatccctccaagcgctactagtggtctct660tacctctactctgcccctttacctactcaatataacttaaatctcttctagaatcgcgct720agcgcaaaccttcaccggtaaccgccagaacgtcctacaagctctcaaccaccggcactt780tgttgctaaatcctacgtgcaagcatctttttgctataacatccacgttcgaaaatcaac840aaaaatgcccaacatgcgaatccgcaagattgctcctaaagccgctgttaaaccaaccca900tagcggcccaagagtggtctccaatcccgcaagctgccacatttacatcggaccccaact960gcgtgctcacaactacccgagcgtgctaaagggttcctttaaggctgccagcgcggaaac1020cataacagctatcaacctaattgccaccgtccgcaaggatgctggtatttcaggtcaata1080tgctgggaagatgggttatgaccccgagatgggacttttcgtttccgtcgaaggtgttcg1140tgctctccaagcttccaaactccaaactgcccttaaggcaattaaaaagggtactagacc1200ctttggccttttcaggcctaaacagagtgtgactaacacccacgctcaaaatttgctagc1260cctccaccgtgctagctccaccggcccttggaccaaacacttaccatctcaaggtcccat1320aggtaactgcctcgcagaattcatgcaggagtacactaccacaattccaccatttgatag1380tgtcctcactgaaaacggttggcaatacgctgtcacgattgacggtgtgactaaatctcg1440cctcccgtacaccgaaattcgccgcggtggttatgaatttaaaacaactaattaccacat1500cggtgcaatccaggttactgccaaccacattggcaaagtaaaccctggagatactaaatt1560ggactgtcaatatttcatgttgacacgtaatcaaaagccccaaaacttcactgctgagca1620actcgaaggaaacatccataacatcatcttcgacctcagtcatgaaactggcaaacccaa1680actctatggaatggaagaaacacgacaatgggctgggacaacaccaaaaccacctaagaa1740aaagcttagacttgtagctatgacatcaactctcagtgccactccatcaaccacacaccc1800agcgcccctaacaaccacacgcgcaccacttaaaacacacatttcaattggcccgcacaa1860ctgcaccatcatagatattaataaagcccaattcgcctttgataactacacttctcaact1920ccctaactcttgtgttcaccgtgccaacaaagctgtttgcgccggtttgaatggctgatc1980ctttccttttcctacccactttaactacctctctaaagtagaaacatctaaaggaactta2040tcaattggggtacattttagccccaaaactacggcccctgctatccaattctacgtcttg2100caatttcagaaccacgtctacctacgtcttctccccatgcctatgaacctttctttccgc2160actatctgcgacattgaaaccgcccacggtcaaccacacccaacttacacaagcccagac2220tggcgcgtgtattacctcgcaaagtacgatcccaccaaagtactcagagttcaagttgtt2280gattgggcaggttcagataccattactgaagatcatgtcaccctcttcccacgccgacac2340attatgactaaagttttgaaaaacgaccaaactaaagttaactacatcgacccaactaaa2400gatgcagcaacaacacccttcacaattgaaacagttgaaggaggcaaagttgaagtactc2460tccgccaacgtcatccgtcaaattaacattgaaactggtcgcggcaagaaacgtaaaaca2520gctaaattagatgtaaaaatttcaattagagttaaagctactaaaacccgcacaacaatt2580cacgtcttcataacccaagcaaaagatgaaagcaaaatcgtcactccaacctcagaaatg2640cagggagtagttgacgttttaatttccagagcatgtgtcctctcacaacacgcaggacct2700gacatgacttatgaactgcacacacctgacggttcttgcactaaccccctcgttcaattc2760tttgaagaagaaggcgaggttcctgaagatgtttacgatctcttcccatctgtagaacgt2820aacgctgaaggcttagttatgtgcatgccagaaggttttgccctcatctctggttgcatt2880cctcatccacttgcttactatgctgacaagtacggtcaaacactcgtacctgaattcaaa2940gtgacaagaactcacgttgaacgcggccccattccaccatcacggtccatttactacaca3000ttcatcccaattaatgtagactccatcccacccttcggacacacctacaaatccctcgcc3060aaacttaacacatttaacctgggttgggaagatcaagacatgttagataacgctgacacc3120ctccttccatgtctcttagaaaatgaaaacatgaaacttcacctaacatggaaaatcatc3180gcccgtgacttctcagataacaccactgaaacagcccttactacctacactgattttaca3240actagtgatttcaccccagccaaccaaacaggatccagctctcaatcccttagctctcca3300cctctttcccaactctcttcccacaaatctcttgctaacctctcagaaactggctcaata3360gataacatcccggaaaacacccctgaaacaatccaagaagaagaagatatcgaa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