本發(fā)明涉及基因工程代謝改造及微生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種含有l(wèi)-谷氨酸氧化酶基因的重組枯草芽孢桿菌及其制備方法。

背景技術(shù)：

生物轉(zhuǎn)化是指利用生物學(xué)的方法合成有機(jī)化合物的過程，即利用全細(xì)胞或提取酶作為催化劑將底物轉(zhuǎn)化成目標(biāo)產(chǎn)物的過程。

生物轉(zhuǎn)化實際是利用有活性的酶，因此，其催化的反應(yīng)具有如下特征：反應(yīng)的專一性，立體的選擇性，且反應(yīng)條件要求不高，與傳統(tǒng)的化學(xué)合成方法相比，生物催化的方法可以在低污染、低能耗、高特異性的條件下進(jìn)行，它可以替換多步化學(xué)反應(yīng)成一步酶催化反應(yīng)或是引入化合物結(jié)構(gòu)的多樣性，所以目前廣泛應(yīng)用在有機(jī)溶劑、聚合物材料、醫(yī)藥工業(yè)中間體、有機(jī)化學(xué)光學(xué)對映體、抗生素、維生素等重要工業(yè)產(chǎn)品的生產(chǎn)中。越來越多的微生物資源被報道應(yīng)用于生物轉(zhuǎn)化，其研究思路的發(fā)展歷程，經(jīng)過了從利用野生型全細(xì)胞進(jìn)行催化,到利用基因工程表達(dá)重組酶用來轉(zhuǎn)化，最后進(jìn)入了組合生物轉(zhuǎn)化和代謝工程的全局性調(diào)控階段。由于具有方向性強(qiáng)、目標(biāo)明確、可控性好和重現(xiàn)性好的優(yōu)勢，代謝工程在生物轉(zhuǎn)化宿主菌的改造方面具有良好的應(yīng)用前景，合成生物學(xué)的出現(xiàn)又將這種應(yīng)用提升到了一種多元化的新高度。

全細(xì)胞催化由于多樣性和易操作性的優(yōu)點在工業(yè)上得到了迅速的應(yīng)用，但是也存在以下幾方面的問題：底物跨膜的通透性大小影響最終的轉(zhuǎn)化率；副反應(yīng)導(dǎo)致底物或產(chǎn)物的降解；存在旁路反應(yīng)和副產(chǎn)物積累的問題。這些問題一定程度上限制了全細(xì)胞轉(zhuǎn)化在工業(yè)上的應(yīng)用，因此利用基因工程異源表達(dá)重組酶或?qū)μ烊幻高M(jìn)行定向改造在生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域得到了迅速的發(fā)展。

枯草芽孢桿菌是在工業(yè)發(fā)酵和微生物分子遺傳領(lǐng)域具有重要價值的革蘭氏陽性菌，構(gòu)建枯草芽孢桿菌基因工程菌的最主要方法是利用能獨立復(fù)制的質(zhì)粒對該菌進(jìn)行遺傳改造?？莶菅挎邨U菌具有發(fā)酵周期短、產(chǎn)物豐富、可利用開發(fā)價值高以及作為食品藥品安全性好等顯著特點，它可產(chǎn)生多種抗生素，包括脂肽類、肽類、磷脂類、多烯類、氨基酸類、核酸類物質(zhì)，對多種動、植物及人類病原菌起到很好的抑制作用。而且芽孢桿菌還具有很強(qiáng)的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性。因此，芽孢桿菌被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、食品、飼料加工、環(huán)境污染治理等各個行業(yè)。據(jù)不完全統(tǒng)計枯草芽孢桿菌所產(chǎn)的酶占整個酶市場的50％，是工業(yè)上生產(chǎn)酶應(yīng)用最廣泛的菌種之一。但目前對利用重組改造后的芽孢桿菌進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗研究鮮有報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明申請人提拱了一種代謝改造的枯草芽孢桿菌生物轉(zhuǎn)化細(xì)胞及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明首先制備了含有密碼子優(yōu)化后的l-谷氨酸氧化酶基因的重組枯草芽孢桿菌，接著，經(jīng)代謝工程改造宿主的谷氨酸分解途徑和其轉(zhuǎn)運途徑，實現(xiàn)重組菌的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化l-谷氨酸生產(chǎn)α-酮戊二酸。本發(fā)明為參與細(xì)胞內(nèi)源代謝的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的構(gòu)建及改良提供了實驗依據(jù)，為利用枯草芽孢桿菌全細(xì)胞高效轉(zhuǎn)化l-谷氨酸生產(chǎn)α-酮戊二酸提供借鑒。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種代謝改造的枯草芽孢桿菌生物轉(zhuǎn)化細(xì)胞，所述枯草芽孢桿菌生物轉(zhuǎn)化細(xì)胞的制備方法為：首先經(jīng)過重組過表達(dá)獲得一種l-谷氨酸氧化酶，然后再對枯草芽孢桿菌內(nèi)源谷氨酸分解途徑進(jìn)行代謝工程改造，最后改造了枯草芽孢桿菌對谷氨酸轉(zhuǎn)運的途徑，制得所述枯草芽孢桿菌生物轉(zhuǎn)化細(xì)胞，即重組枯草芽孢桿菌。

編碼所述l-谷氨酸氧化酶的氨基酸序列如seqidno.1所示；所述l-谷氨酸氧化酶的基因序列如seqidno.2所示。

所述枯草芽孢桿菌代謝工程改造的過程為：

(1)獲取鏈霉菌(streptomycessp.x-119-6)來源，經(jīng)密碼子優(yōu)化后的l-谷氨酸氧化酶基因lgox；

(2)將步驟(1)所得l-谷氨酸氧化酶基因lgox克隆至含有木糖的誘導(dǎo)型表達(dá)載體phy-bs.xyl上，構(gòu)建含有l(wèi)-谷氨酸氧化酶基因的重組質(zhì)粒phy-bs.xyl-lgox；

(3)將步驟(2)所得重組質(zhì)粒phy-bs.xyl-lgox轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌wb600中，獲得重組枯草芽孢桿菌wb600/phy-bs.xyl-lgox，即重組枯草芽孢桿菌wb602。

所述枯草芽孢桿菌代謝工程改造的過程還可以為：

(1)獲取鏈霉菌(streptomycessp.x-119-6)來源，經(jīng)密碼子優(yōu)化后的l-谷氨酸氧化酶基因lgox；

(2)將步驟(1)中所得l-谷氨酸氧化酶基因lgox克隆至木糖誘導(dǎo)型表達(dá)載體phy-bs.xyl上，構(gòu)建含有l(wèi)-谷氨酸氧化酶基因的重組質(zhì)粒phy-bs.xyl-lgox；

(3)敲除枯草芽孢桿菌wb600中的谷氨酰胺合酶基因glna，同時實現(xiàn)步驟(1)所述l-谷氨酸氧化酶基因的整合，構(gòu)建了重組枯草芽孢桿菌wb603；

(4)將步驟(2)所得重組質(zhì)粒phy-bs.xyl-lgox轉(zhuǎn)化至重組枯草芽孢桿菌wb603中，獲得重組枯草芽孢桿菌wb603/phy-bs.xyl-lgox，即代謝改造的重組枯草芽孢桿菌wb604。

所述枯草芽孢桿菌代謝工程改造的過程還可以為：

(1)獲取來自鏈霉菌(streptomycessp.x-119-6)來源，經(jīng)密碼子優(yōu)化后的l-谷氨酸氧化酶基因lgox；

(2)將步驟(1)中所得l-谷氨酸氧化酶基因lgox克隆至木糖誘導(dǎo)型表達(dá)載體phy-bs.xyl上，構(gòu)建含有l(wèi)-谷氨酸氧化酶基因的重組質(zhì)粒phy-bs.xyl-lgox；

(3)pcr擴(kuò)增來源于bacillussubtilis168的谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白gltp基因gltp；

(4)將步驟(3)擴(kuò)增后的基因gltp克隆至步驟(2)所獲得的重組質(zhì)粒phy-bs.xyl-lgox上，構(gòu)建重組共表達(dá)質(zhì)粒phy-bs.xyl-lgox-gltp；

(5)將步驟(4)所得的重組共表達(dá)質(zhì)粒phy-bs.xyl-lgox-gltp轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌wb600中，獲得重組枯草芽孢桿菌wb600/phy-bs.xyl-lgox-gltp，即重組枯草芽孢桿菌wb605。

一種所述枯草芽孢桿菌生物轉(zhuǎn)化細(xì)胞的應(yīng)用，所述枯草芽孢桿菌生物轉(zhuǎn)化細(xì)胞可用于全細(xì)胞轉(zhuǎn)化l-谷氨酸生產(chǎn)α-酮戊二酸，提高α-酮戊二酸的轉(zhuǎn)化效率。

所述枯草芽孢桿菌菌種的種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基：種子培養(yǎng)基(g·l^-1):酵母粉5，蛋白胨10，氯化鈉10；發(fā)酵培養(yǎng)基(g·l^-1)：甘油5，酵母粉24，蛋白胨12，k2hpo412.54，kh2po42.31，調(diào)節(jié)ph至7.0。

將重組菌經(jīng)種子培養(yǎng)基活化12h后，轉(zhuǎn)接5％的接種量至發(fā)酵培養(yǎng)基，至菌體達(dá)生長對數(shù)中期od600約為5左右，開始補加終濃度為10g·l^-1的木糖進(jìn)行誘導(dǎo)，共發(fā)酵約20h，離心收集菌體，并用0.1mol·l^-1的ph7.0磷酸鈉鹽緩沖液洗滌菌體2次，進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

轉(zhuǎn)化條件：全細(xì)胞催化劑和底物l-谷氨酸若干，1200u·ml^-1過氧化氫酶和100mmol·l^-1ph7.0磷酸鹽緩沖液，于10ml反應(yīng)體系中，37℃，200r·min^-1反應(yīng)24h，離心，取上清煮沸20min，再離心，hplc檢測上清中l(wèi)-谷氨酸與α-酮戊二酸的量。

本發(fā)明有益的技術(shù)效果在于：

本發(fā)明通過將目的基因整合至glna相應(yīng)位點，實現(xiàn)了glna基因的敲除和目的基因的整合，提高了l-谷氨酸的有效轉(zhuǎn)化率。本發(fā)明證實敲除細(xì)菌底物消耗的旁路代謝通道能有效提高轉(zhuǎn)化率，推測敲除產(chǎn)物的消耗途徑亦可提高目標(biāo)產(chǎn)物量。同時，本發(fā)明在全細(xì)胞催化過程中過表達(dá)底物轉(zhuǎn)運蛋白，提高了轉(zhuǎn)化效率，為參與細(xì)胞內(nèi)源代謝的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的構(gòu)建及改良提供了實驗依據(jù)，及工業(yè)上進(jìn)行全細(xì)胞高效催化生產(chǎn)α-酮戊二酸提供借鑒。

附圖說明

圖1為重組誘導(dǎo)型表達(dá)載體phy-bs.xyl-lgox雙酶切驗證；

圖2為基因突變敲除盒pmdganpl酶切驗證；

圖3為bacillussubtilis中g(shù)lna基因敲除pcr驗證；

圖4為共表達(dá)載體phy-bs.xyl-lgox-gltp酶切驗證；

圖5為重組菌wb602與wb605細(xì)胞轉(zhuǎn)化比較；

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明進(jìn)行具體描述。

實施例1重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建：

經(jīng)密碼子優(yōu)化合成來源于鏈霉菌(streptomycessp.x-119-6)的l-谷氨酸氧化酶(lgox)基因序列(l-谷氨酸氧化酶的氨基酸序列如seqidno.1所示；所述l-谷氨酸氧化酶的基因序列如seqidno.2所示)，并在5’端和3’端分別加上bamhⅰ和ecorⅰ酶切位點，由公司合成上述lgox基因并克隆至puc57載體上，獲得重組質(zhì)粒puc57-lgox，接著，經(jīng)分子克隆將上述lgox基因連接至phy-bs.xyl誘導(dǎo)型表達(dá)載體，制得含有l(wèi)-谷氨酸氧化酶基因的重組質(zhì)粒phy-bs.xyl-lgox，經(jīng)bamhⅰ和ecorⅰ雙酶切驗證(圖1)獲得相應(yīng)大小的目的片段。

將未含外源lgox基因的誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒phy-bs.xyl和重組質(zhì)粒phy-bs.xyl-lgox轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌wb600中，獲得重組菌wb600/phy-bs.xyl，wb600/phy-bs.xyl-lgox，分別命名為wb601，wb602。

實施例2基因glna的敲除及目的基因的整合

(1)以引物glna-f和glna-r分別為上下游引物經(jīng)pcr擴(kuò)增來自枯草芽孢桿菌b.subtiliswb600的基因glna(谷氨酰胺合成酶)，經(jīng)t-a克隆連接至pmdt19-simple質(zhì)粒載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒，分別標(biāo)記為pmd-glna，在上述擴(kuò)增的基因中分別選取兩個合適的酶切位點ncoⅰ和pstⅰ，雙酶切后，去除818bp的部分glna基因片段，膠回收獲得3210bp的片段，即以剩余部分為同源臂；

(2)以b.subtiliswb600基因組為模板，p43-ncoⅰ-f，p43-r-lgox為上下游引物擴(kuò)增大小為426bp的p43啟動子，以puc57-lgox為模板，p43-lgox-f，lgox-pstⅰ-r為上下游引物擴(kuò)增lgox基因，以上述擴(kuò)增出的lgox和p43為模板，p43-ncoⅰ-f，lgox-pstⅰ為上下游引物，將l-谷氨酸氧化酶基因與p43啟動子進(jìn)行融合pcr，實現(xiàn)兩者的無縫連接，將融合好的片段經(jīng)ncoⅰ和pstⅰ雙酶切，連接至經(jīng)相同酶切的pmd-glna質(zhì)粒載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒載體，記為pmd-glna-p43-lgox，測序融合部分p43-lgox；

(3)經(jīng)pcr擴(kuò)增來源于pma5質(zhì)粒載體上的neo(新霉素基因)，并在引物兩端分別加上與p43啟動子上游相同的酶切位點，連接至t載體，測序，ncoⅰ酶切膠回收目的片段neo，與步驟(2)中所獲得的重組質(zhì)粒載體pmd-glna-p43-lgox經(jīng)相同酶切后，連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒載體(圖2)，記為pmd-glna-neo-p43-lgox，至此基因突變敲除盒pmdganpl構(gòu)建成功；

(4)將構(gòu)建好的glna和amye基因敲除突變盒pmdganpl經(jīng)枯草芽孢桿菌化轉(zhuǎn)至b.subtiliswb600，涂布含有6μg·ml^-1的新霉素平板，37℃，培養(yǎng)16～24h后，挑取單菌落用表1中敲除驗證引物glna-qcyz-f，p43-r-lgox進(jìn)行pcr鑒定(圖3)，若glna基因敲除成功，則pcr產(chǎn)物片段大小為1727bp，敲除后的突變菌命名為wb603，而基因未成功敲除則無法得到pcr產(chǎn)物片段。本實施例中所用引物序列如表1所示。

表1

注：上表中“單下劃線”為酶切位點，“雙下劃線為”終止密碼子

實施例3重組菌株wb604的構(gòu)建

按照化轉(zhuǎn)的方法將表達(dá)質(zhì)粒phy-bs.xyl-lgox轉(zhuǎn)化至wb603，構(gòu)建重組菌wb604，具體實施方式如下：

培養(yǎng)基：枯草芽孢桿菌b.subtiliswb600轉(zhuǎn)化用培養(yǎng)基：

spⅰ-a溶液(g·l^-1)：(nh4)2so44，k2hpo4·3h2o28，kh2po412，二水合檸檬酸鈉2；

spⅰ-b溶液(g·l^-1)：mgso4·7h2o0.4；

500g·l^-1葡萄糖溶液；

100×caye溶液(g·l^-1)：酪蛋白氨基酸20，酵母粉100；

cacl2溶液：50mmol·l^-1；

mgcl2溶液：250mmol·l^-1；

100×egta溶液：稱取3.8gegta(乙二醇雙四乙酸)溶解于1l去離子水中，并用naoh調(diào)ph至8.0，過濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

將1～6中所配試劑于115℃高溫高壓滅菌20min，冷卻后放置4℃冰箱備用；

用以上溶液配制枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化用培養(yǎng)基(現(xiàn)配現(xiàn)用)：

spⅰ培養(yǎng)基(20ml)：spⅰ-a和spⅰ-b各9.8ml，50％葡萄糖溶液和100×caye溶液各200μl，混勻；

spⅱ培養(yǎng)基(6ml)：5.88mlspⅰ培養(yǎng)基，60μlcacl2溶液，60μlmgcl2溶液，混勻，向50ml離心管中每管分裝2ml，備用。

b.subtiliswb600感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化

(1)菌種活化，從保藏管中接種50μl菌株至3mlspⅰ培養(yǎng)基中，37℃，200r·min^-1過夜培養(yǎng)；

(2)從上述3mlspⅰ培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接100μl于5mlspⅰ培養(yǎng)基中，37℃，200r·min^-1培養(yǎng)4.5h；

(3)從5mlspⅰ培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接200μl于2mlspⅱ培養(yǎng)基中，37℃，200r·min^-1培養(yǎng)1.5h；

(4)向2mlspⅱ培養(yǎng)基中加入20μl100×egta溶液，37℃，200r·min^-1培養(yǎng)10min；

(5)將上述菌懸液分裝至1.5ml離心管中，每管500μl，直接用于轉(zhuǎn)化或-70℃保存?zhèn)溆茫?/p>

轉(zhuǎn)化：

(1)將連接產(chǎn)物或質(zhì)粒加入制備好的感受態(tài)中，混勻，37℃培養(yǎng)2.5h；

(2)5000r·min^-1離心后培養(yǎng)的菌體2min，棄部分上清，用移液槍吹吸重懸菌體涂布于抗性平板；

(3)涂布抗性篩選平板于37℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行pcr及酶切驗證。

實施例4全細(xì)胞催化劑的制備及轉(zhuǎn)化實驗研究

將上述構(gòu)建好的4株重組菌wb601，wb602，wb603，wb604按5％接種量分別接種于發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵，8h后補加10g·l^-1的木糖進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)酵共20h，離心收集、洗滌菌體兩次，進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗。

轉(zhuǎn)化條件：2.5g·l^-1dcw全細(xì)胞催化劑，10g·l^-1的l-谷氨酸底物，1200u·ml^-1過氧化氫酶和100mmol·l^-1ph7.0磷酸鹽緩沖液，于10ml反應(yīng)體系中，37℃，200r·min^-1反應(yīng)24h，離心，檢測上清中l(wèi)-谷氨酸與α-酮戊二酸的量。

轉(zhuǎn)化結(jié)果如表2，通過wb601，wb603兩株重組菌比較，僅實現(xiàn)lgox基因整合的突變菌wb603的α-kg產(chǎn)量從原始對照菌wb601的0.08g·l^-1提高到0.32g·l^-1，表明將lgox基因整合至染色體上可以使重組菌獲得一定酶活，將l-谷氨酸轉(zhuǎn)化生成少量α-kg，但由于拷貝數(shù)過低，致使表達(dá)量不高，不適合直接進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗，故在此基礎(chǔ)上再導(dǎo)入一游離質(zhì)粒phy-bs.xyl-lgox，構(gòu)建了相應(yīng)的重組菌wb604與wb602比較，轉(zhuǎn)化率從glna基因敲除前的87.9％提高至95.4％，說明glna基因的表達(dá)會消耗部分底物，從而降低生物轉(zhuǎn)化率，而本發(fā)明通過將目的基因整合至glna相應(yīng)位點，實現(xiàn)了glna基因的敲除和目的基因的整合，使其轉(zhuǎn)化率相應(yīng)提高。本實驗證實敲除細(xì)菌底物消耗的旁路代謝通道能有效提高轉(zhuǎn)化率，推測敲除產(chǎn)物的消耗途徑亦可提高目標(biāo)產(chǎn)物。

表2

實施例5共表達(dá)載體的構(gòu)建

提取枯草芽孢桿菌染色體為模板，以表1中g(shù)ltp-xbaⅰ-f和gltp-xbaⅰ-r為上下游引物，擴(kuò)增完整的轉(zhuǎn)運蛋白gltp片段(1396bp),經(jīng)ta克隆、轉(zhuǎn)化等操作連接至pmdt-19simple載體，構(gòu)建質(zhì)粒t-gltp，送至上海生工生物工程有限公司測序驗證正確，此質(zhì)粒經(jīng)xbaⅰ酶切，割膠回收1396bp目的片段，連接至經(jīng)相同酶切的誘導(dǎo)型穿梭質(zhì)粒載體phy-bs.xyl-lgox，構(gòu)建了重組質(zhì)粒phy-bs.xyl-lgox-gltp，分別經(jīng)bamhⅰ和ecorⅰ雙酶切，xbaⅰ單酶切，分別獲得7648bp和2103bp(lgoxstr基因片段)，8355bp和1396bp(gltp基因片段)的dna條帶，如圖4所示，所得條帶與dna序列分析結(jié)果一致，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

實施例6共表達(dá)菌株的構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)化

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒載體phy-bs.xyl-lgox-gltp轉(zhuǎn)化至wb600，構(gòu)建重組菌wb600/phy-bs.xyl-lgox-gltp，命名為wb605。活化種子wb602和wb605，將重組菌wb602與wb605進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化l-谷氨酸實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖5)：在40g·l^-1l-谷氨酸，1g·l^-1葡萄糖，1u·ml^-1的全細(xì)胞催化劑酶活力的條件下轉(zhuǎn)化30h，定點取樣，發(fā)現(xiàn)表達(dá)了轉(zhuǎn)運蛋白gltp的重組菌wb605在20h時，底物也基本消耗完，產(chǎn)生37.8g·l^-1的α-酮戊二酸，達(dá)到95.1％的轉(zhuǎn)化率，此段時間內(nèi)的平均轉(zhuǎn)化速率達(dá)1.89g·l^-1·h^-1；而未表達(dá)轉(zhuǎn)運蛋白的重組菌wb602在轉(zhuǎn)化20h時，產(chǎn)生約30.9g·l^-1的α-酮戊二酸，其轉(zhuǎn)化率為77.8％，平均轉(zhuǎn)化速率為1.55g·l^-1·h^-1；轉(zhuǎn)運蛋白gltp的過表達(dá)使得達(dá)平衡期時的全細(xì)胞平均轉(zhuǎn)化速率提高了21.9％。說明轉(zhuǎn)運蛋白gltp的過表達(dá)，加速了細(xì)胞將l-谷氨酸轉(zhuǎn)運至細(xì)胞內(nèi)的速率，與未表達(dá)轉(zhuǎn)運蛋白gltp重組菌相比，在lgox酶活力相同的條件下，提高了谷氨酸的運輸速率，從而提高了轉(zhuǎn)化效率。