本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一種與水稻高抗性淀粉含量基因sbe3-rs緊密連鎖的分子標(biāo)記、引物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

淀粉是人類食物和能量的主要來源，其進(jìn)入人體后，絕大部分在小腸中酶解后被消化吸收，小部分可逃避酶解進(jìn)入小腸，在大腸中被微生物發(fā)酵利用后，最終排出體外，前者為可消化吸收淀粉(digestiblestarch，ds)，后者為抗性淀粉(resistantstarch，rs)。rs具有降血糖、降血脂、促進(jìn)腸道健康及促進(jìn)礦物質(zhì)的消化和吸收等重要生理功能。高rs飲食者與低rs飲食者相比，具有較少的胰島素反應(yīng)，這對(duì)糖尿病患者控制餐后血糖值有很大益處，尤其對(duì)于非胰島素依賴性病人，通過攝食高rs食物，可延緩或抑制餐后血糖上升，有效改善糖尿病人的病情。

基于表型選擇的常規(guī)育種方法存在選擇效率低和育種周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)，迫切需要注入現(xiàn)代分子技術(shù)手段，輔之于高效率地基因型定向選擇，才能快速高效地培育出優(yōu)異水稻新品種。隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)的迅速發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用更加廣泛?；趐cr的分子標(biāo)記如微衛(wèi)星或ssr(simplesequencerepeat)等具有多態(tài)率高、相對(duì)穩(wěn)定、檢測(cè)方法簡(jiǎn)便快速及易于操作等特點(diǎn)而被廣泛的應(yīng)用。由于分子標(biāo)記輔助選擇不易受環(huán)境因素影響和性狀顯隱性干擾等，可以從分子水平定向選擇目標(biāo)性狀基因，同時(shí)還有可能打破不利基因之間的連鎖而高效率地聚合多個(gè)優(yōu)良基因于一體。通常所說的分子標(biāo)記既包括目標(biāo)基因的連鎖標(biāo)記也包括目標(biāo)基因自身功能標(biāo)記。分子標(biāo)記輔助多基因聚合育種技術(shù)已經(jīng)成為水稻、玉米等作物育種研究的一種發(fā)展趨勢(shì)，運(yùn)用該技術(shù)能否有效地將優(yōu)質(zhì)、多抗和高產(chǎn)等基因聚合到少數(shù)骨干品種中，關(guān)鍵在于能否獲得與目標(biāo)性狀基因或主效qtl緊密連鎖的實(shí)用分子標(biāo)記。

中國(guó)專利201210266649.9定位了控制水稻rs含量的主效基因sbe-rs，該突變基因在對(duì)應(yīng)于水稻淀粉分支酶sbe3基因第16外顯子的第105位出具有t→c的堿基突變，并且針對(duì)該位點(diǎn)開發(fā)了一個(gè)caps功能分子標(biāo)記，為通過分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)活轉(zhuǎn)基因手段培育高rs含量的高產(chǎn)水稻新品種提供理論和技術(shù)指導(dǎo)。

但是，由于caps分子標(biāo)記設(shè)計(jì)到先pcr反應(yīng)后用限制性內(nèi)切酶spel酶切步驟，所以使用起來存在步驟繁瑣，費(fèi)用昂貴等一系列弊端，因此，建立一種新的基于pcr技術(shù)的基因分型方法來快速、準(zhǔn)確地鑒定水稻高抗性淀粉突變體基因sbe3-rs基因型已成為目前抗性淀粉育種應(yīng)用中亟待解決的技術(shù)難題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種與水稻高抗性淀粉含量基因sbe3-rs緊密連鎖的分子標(biāo)記、擴(kuò)增該分子標(biāo)記的引物對(duì)以及檢測(cè)水稻高抗性淀粉含量基因sbe3-rs的方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種與水稻高抗性淀粉含量基因sbe3-rs緊密連鎖的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記的核苷酸序列如seqidno：1所示或seqidno：2所示。

一種擴(kuò)增上述分子標(biāo)記的引物對(duì)，包括引物1和引物2，所述引物1的核苷酸序列如seqidno：3所示，所述引物2的核苷酸序列如seqidno：4所示。

一種檢測(cè)水稻高抗性淀粉含量基因sbe3-rs的方法，包括如下步驟：

(1)pcr擴(kuò)增：以從待測(cè)水稻中提取的基因組dna作為dna擴(kuò)增模板，以seqidno：3所示的核苷酸序列和seqidno：4所示的核苷酸序列組成為擴(kuò)增引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

(2)擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定：若所得pcr擴(kuò)增產(chǎn)物為241bp堿基片段，則待測(cè)水稻為高抗性淀粉品種，若所得pcr擴(kuò)增產(chǎn)物為246bp堿基片段，則待測(cè)水稻為不含高抗性淀粉含量基因sbe3-rs品種。

進(jìn)一步地，步驟(2)中，所述241bp堿基片段為seqidno：1所示的核苷酸序列，所述246bp堿基片段為seqidno：2所示的核苷酸序列。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，從待測(cè)水稻中提取的基因組dna的提取方法為堿煮法，具體步驟為：取1/10的水稻籽粒胚乳，加入40ml的0.2mol/l的氫氧化鈉水溶液，在100℃條件下水浴3分鐘，再加入60ml的0.17mol/l的tris-hcl，在100℃條件下水浴1分鐘。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：含mg²⁺的10xbuffer2μl，10mm的dntp0.4μl，5μm的如seqidno：3所示的核苷酸序列和5μm的如seqidno：4所示的核苷酸序列各2μl，從待測(cè)水稻中提取的基因組dna1μl，5u/μl的taq酶0.5μl，其余為超純水，反應(yīng)體積為20μl，滴加一滴礦物油覆蓋；pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃5min；94℃60s、53.5℃60s，72℃60s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。

本發(fā)明還提供上述分子標(biāo)記、引物對(duì)以及檢測(cè)水稻高抗性淀粉含量基因sbe3-rs的方法在水稻育種中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：

本發(fā)明分子標(biāo)記位于高抗性淀粉突變體基因sbe3-rs的內(nèi)部，與水稻高抗性淀粉含量基因sbe3-rs緊密連鎖，與非基因內(nèi)部標(biāo)記相比，本發(fā)明分子標(biāo)記不會(huì)出現(xiàn)分離，可以更有效地提高育種效率。

本發(fā)明引物對(duì)可以很好地?cái)U(kuò)增經(jīng)過簡(jiǎn)單處理所得到的從待測(cè)水稻中提取的基因組，克服了現(xiàn)有技術(shù)中與該基因緊密連鎖的其他分子標(biāo)記無法擴(kuò)增經(jīng)過簡(jiǎn)單處理所得到的從待測(cè)水稻中提取的基因組的問題，獲得本發(fā)明檢測(cè)水稻高抗性淀粉含量基因sbe3-rs的方法，該本發(fā)明方法能夠?qū)ΣシN前的水稻種粒進(jìn)行快速基因鑒定篩選，然后有選擇性地播種，減少用工用地，縮短育種周期，進(jìn)一步提高育種效率。

本發(fā)明檢測(cè)水稻高抗性淀粉含量基因sbe3-rs的方法克服了常規(guī)育種中因表型選擇而導(dǎo)致育種效率低等問題，同時(shí)可取代專利201210266649.9中使用酶切的方案，可以利用本發(fā)明引物對(duì)對(duì)水稻高抗性淀粉突變體基因sbe3-rs進(jìn)行早期世代選擇而縮短育種周期，從而較快地篩選出高抗性淀粉突變體基因sbe3-rs的水稻材料。本發(fā)明可應(yīng)用于水稻育種，以提高育種效率。

附圖說明

圖1是seqidno：5所示的核苷酸序列和seqidno：6所示的核苷酸序列組成的引物對(duì)擴(kuò)增高抗性淀粉突變體基因sbe3-rs和不含高抗性淀粉突變體基因sbe3-rs品種后，擴(kuò)增產(chǎn)物堿基片段對(duì)比圖。

圖2是seqidno：3所示的核苷酸序列和seqidno：4所示的核苷酸序列組成的引物對(duì)擴(kuò)增高抗性淀粉突變體基因sbe3-rs品種降糖稻1號(hào)和不含高抗性淀粉突變體基因sbe3-rs品種fd1710以及兩者雜交種的電泳圖。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均由常規(guī)生化試劑公司購(gòu)買得到。

實(shí)施例1

高抗性淀粉突變體基因sbe3-rs性狀鑒定專用引物對(duì)seqidno：3所示的核苷酸序列和seqidno：4所示的核苷酸序列的獲得

1.1雙親基因組擴(kuò)增

用于創(chuàng)建水稻重組自交系(recombinantinbredline，ril)群體的雙親分別是降糖稻1號(hào)4和安徽豐大種業(yè)股份有限公司選育的fd1710。fd1710為母本，不含高抗性淀粉突變體基因sbe3-rs；降糖稻1號(hào)為父本，含高抗性淀粉突變體基因sbe3-rs。

采用ctab法提取雙親葉片的基因組dna，以ncbi上公布的sbe3-rs序列(網(wǎng)址)設(shè)計(jì)引物對(duì)，由seqidno：5所示的核苷酸序列和seqidno：6所示的核苷酸序列組成，委托北京梓熙生物公司合成后，進(jìn)行pcr擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：10xbuffer2μl(含mg²⁺)，dntp0.4μl(10mm)，seqidno：5所示的核苷酸序列和seqidno：6所示的核苷酸序列各2μl(5μm)，基因組dna1μl(40ng/μl)，taq酶0.5μl(5υ/μl)，其余為超純水，反應(yīng)體積為20μl，滴加一滴礦物油覆蓋；pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?94℃5min；94℃60s，53.5℃60s，72℃60s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。

pcr擴(kuò)增產(chǎn)物送去測(cè)序，測(cè)序公司為北京梓熙生物公司，測(cè)序結(jié)果在ncbi網(wǎng)站的在線比對(duì)結(jié)果見圖1。圖中虛線區(qū)域表示5bp的缺失，其中query是降糖稻1號(hào)，含高抗性淀粉突變體基因sbe3-rs的序列；sbjct是fd1710，不含高抗性淀粉突變體基因sbe3-rs的序列。

1.2引物合成和驗(yàn)證

根據(jù)圖1的測(cè)序比對(duì)結(jié)果，在跨越兩個(gè)序列有5bp插入缺失差異區(qū)域設(shè)計(jì)引物，上游引物為seqidno：3所示的核苷酸序列，下游引物為seqidno：4所示的核苷酸序列。委托北京梓熙生物公司合成。上游引物和下游引物(將該引物對(duì)命名為qk1)位于基因sbe3-rs內(nèi)部區(qū)域。

利用新合成的引物擴(kuò)增降糖稻1號(hào)和fd1710，以及兩者的雜交種。采用堿煮法從待測(cè)水稻中提取基因組dna，具體步驟為：取1/10的水稻籽粒胚乳，加入40ml的0.2mol/l的氫氧化鈉水溶液，在100℃條件下水浴3分鐘，再加入60ml的0.17mol/l的tris-hcl，在100℃條件下水浴1分鐘，即提取得到待測(cè)水稻的基因組dna，4℃冰箱冷卻備用。

pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：10xbuffer2μl(含mg²⁺)，dntp0.4μl(10mm)，上游引物和下游引物各2μl(5μm)，從待測(cè)水稻中提取的基因組dna1μl，taq酶0.5μl(5u/μl)，反應(yīng)體積為20μl，滴加一滴礦物油覆蓋；pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃5min；94℃60s，53.5℃60s，72℃60s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。

pcr擴(kuò)增產(chǎn)物用6％聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，快速銀染法染色并觀察拍照，見圖2，圖中降糖稻1號(hào)、fd1710和雜交種每個(gè)材料各3個(gè)重復(fù)，m大小為250bp。對(duì)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，從擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖可以清晰地看出，降糖稻1號(hào)有一條電泳帶，經(jīng)測(cè)序所述電泳帶對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物為241bp堿基片段，為seqidno：1所示的核苷酸序列；fd1710有一條電泳帶，經(jīng)測(cè)序所述電泳帶對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物為246bp堿基片段，為seqidno：2所示的核苷酸序列；雜交品種有二條電泳帶，經(jīng)測(cè)序所述電泳帶對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物為241bp和246bp堿基片段，為seqidno：1所示的核苷酸序列和序列表seqidno：2所示的核苷酸序列。

實(shí)施例2

qk1的擴(kuò)增產(chǎn)物與水稻高抗性淀粉含量性狀的相關(guān)性驗(yàn)證

以含高抗性淀粉突變體基因sbe3-rs的降糖稻1號(hào)和不含抗性淀粉突變體基因sbe3-rs的fd1710做親本，兩者雜交后的285個(gè)f2代材料為試驗(yàn)對(duì)象。采用堿煮法從待測(cè)水稻中提取基因組dna，具體步驟同與實(shí)施例1。以qk1進(jìn)行pcr擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：10xbuffer2μl(含mg²⁺)，dntp0.4μl(10mm)，seqidno：3所示的核苷酸序列和seqidno：4所示的核苷酸序列各2μl(5μμ)，待測(cè)水稻提取的基因組dna1μl，taq酶0.5μl(5u/μl)，反應(yīng)體積為20μl，滴加一滴礦物油覆蓋；pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃5min；94℃60s，53.5℃60s，72℃60s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。

pcr擴(kuò)增產(chǎn)物用6％聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，快速銀染法染色并觀察拍照記錄,其中純合的241bp的80株，純合246bp的64株，雜合帶型的171株。

rs含量測(cè)定：應(yīng)用rs含量測(cè)定試劑盒(megazyme，co.wicklow,ireland)進(jìn)行測(cè)定，方法略有改進(jìn)。具體步驟為：準(zhǔn)確稱取100mg米粉樣品，小心放入帶螺旋蓋的塑料管中，依次加入a-胰淀粉酶反應(yīng)液和淀粉葡萄糖苷酶(agm)，37℃震蕩孵育16h，非rs被溶解，水解成d-葡萄糖；孵育結(jié)束后加入99％乙醇終止反應(yīng)；離心上述溶液，棄上清，底部殘留絮狀圖即為樣品中的rs，再用50％乙醇洗滌沉淀；倒置離心管，沉淀干燥后用2mol/l氫氧化鈉溶解沉淀，并加入agm，置于60℃水浴中孵育1h，最后用d-葡萄糖用葡糖氧化酶/過氧化物酶試劑測(cè)定葡萄糖含量，并計(jì)算rs含量。其中單株rs含量大于3％的歸位高rs含量單株，rs含量低于3％歸位低rs含量。

分析如下：如下表1所示，供試水稻樣本中存在純合241bp的80株，70株rs含量高，10株低；而不帶有246bp片段的64個(gè)材料中60rs株含量低，4株高；雜合的171株，152株rs含量低，19株高；兩者的一致性達(dá)到90.5％。因此，可以得出結(jié)論，seqidno：3所示的核苷酸序列和seqidno：4所示的核苷酸序列組成的引物對(duì)是與水稻高抗性淀粉含量性狀相關(guān)位點(diǎn)相緊密連鎖的分子標(biāo)記，可用于水稻分子輔助育種。

表1pcr擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定結(jié)果與試劑盒檢測(cè)試驗(yàn)對(duì)照

應(yīng)當(dāng)理解本文所述的例子和實(shí)施方式僅為了說明，并不用于限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)它做出各種修改或變化，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

。

sequencelisting

序列表

<110>安徽豐大種業(yè)股份有限公司

<120>一種與水稻高抗性淀粉含量基因sbe3-rs緊密連鎖的分子標(biāo)記、引物及其應(yīng)用

<160>6

<170>patentinversion3.1

<210>1

<211>241

<212>dna

<213>水稻（zeamaysl.）

<220>

<221>gene

<222>（1）..（241）

<223>

<400>1

actggatgtgttggttgctgaactgcaaaataatttatgttgctttctatcaggtggtct60

tggactcagatgctggactctttggtggatttggcaggatccatcacactgcagagcact120

tcactgccgtaagtcttgctcagatgaaattgcgtaccgtatattgtgtgctctttatta180

acctctgttgtgctcattccttgcaggattgttcacatgacaacaggccctactcgttctc241

<210>2

<211>274

<212>dna

<213>水稻（zeamaysl.）

<220>

<221>gene

<222>（1）..（246）

<223>

<400>2

actggatgtgttggttgctgaactgcaaaataatttatgttgctttctatcaggtggtct60

tggactcagatgctggactctttggtggatttggcaggatccatcacactgcagagagca120

ccacttcactgccgtaagtcttgctcagatgaaattgcgtaccgtatattgtgtgctctt180

tattaacctctgttgtgctcattccttgcaggattgttcacatgacaacaggccctactc240

gttctc246

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>primer_bind

<222>（1）..（20）

<223>

<400>3

actggatgtgttggttgctg20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>primer_bind

<222>（1）..（20）

<234>

<400>4

gagaacgagtagggcctgtt20

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>primer_bind

<222>（1）..（20）

<223>

<400>5

tagtcctaggtctggatcct20

<210>6

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>primer_bind

<222>（1）..（20）

<234>

<400>6

cagaagtgcagaactatgta20