本發(fā)明涉及兒童i型糖尿病診斷、預(yù)測(cè)預(yù)后領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及以檢測(cè)ubap2l異常為手段的兒童i型糖尿病診斷、預(yù)測(cè)預(yù)后方法。

背景技術(shù)：

i型糖尿病(t1dm)為在遺傳基礎(chǔ)上由環(huán)境因素激發(fā)的、自身免疫介導(dǎo)的以胰腺β細(xì)胞受損為特征的自身免疫性疾病，是一種由于胰島素缺乏或作用不足引起的能量代謝疾病。通常在兒童、少年、青年時(shí)期被診斷，發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)最高的年齡段是10-14歲，青少年以后，發(fā)病率下降。兒童i型糖尿病以往多指小于15歲發(fā)生的糖尿病，由于who(世界衛(wèi)生組織)已經(jīng)兒童定義為0-18歲，因此兒童糖尿病應(yīng)指小于18歲發(fā)生的糖尿病。兒童1型糖尿病的臨床表現(xiàn)為多尿、多飲、多食及消瘦。兒童1型糖尿病比成人糖尿病重，起病較急，不易早期發(fā)現(xiàn)，胰島β細(xì)胞的功能可出現(xiàn)明顯下降甚至發(fā)展為衰竭，早期并發(fā)癥即可出現(xiàn)，如糖尿病酮癥甚至酸中毒，如處理不及時(shí)或不當(dāng)，可能危及生命。i型糖尿病確切發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前認(rèn)為是遺傳、免疫和環(huán)境因素共同作用所致。

高通量測(cè)序技術(shù)(high-throughputsequencing)是指能夠一次并行對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條dna分子進(jìn)行序列測(cè)定，每一次序列測(cè)定的讀長(zhǎng)一般較短的測(cè)序技術(shù)。高通量測(cè)序技術(shù)是對(duì)傳統(tǒng)測(cè)序一次革命性變革，隨著2005年羅氏的454測(cè)序儀及2006年solexa測(cè)序儀出現(xiàn)后飛速發(fā)展，2009年左右高通量測(cè)序技術(shù)在國(guó)內(nèi)興起。高通量測(cè)序類(lèi)型分為多種，基因芯片、基因深度測(cè)序(genomere-sequencing)、轉(zhuǎn)錄組深度測(cè)序(transcriptomere-sequencing又稱rna-seq)等。

細(xì)胞的功能是從基因的表達(dá)開(kāi)始的，轉(zhuǎn)錄組是指某一時(shí)間細(xì)胞內(nèi)所有基因轉(zhuǎn)錄而來(lái)的rna總稱。通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)可獲得基因表達(dá)的rna水平有關(guān)信息，可以揭示基因表達(dá)與一些生命現(xiàn)象之間的內(nèi)在聯(lián)系。

高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展和應(yīng)用，為兒童i型糖尿病發(fā)病機(jī)理的研究提供了更加全面和快速的分析手段，也為兒童i型糖尿病的進(jìn)一步治療方案提供嶄新思路。深入研究?jī)和痠型糖尿病相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)制，有助于了解兒童i型糖尿病的遺傳分子機(jī)制，為尋找新的藥物提供理論依據(jù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供一種通過(guò)檢測(cè)ubap2l基因或蛋白表達(dá)差異來(lái)診斷兒童i型糖尿病的方法。

本發(fā)明的目的之二在于提供一種通過(guò)檢測(cè)ubap2l基因或蛋白表達(dá)差異來(lái)預(yù)測(cè)兒童i型糖尿病預(yù)后的方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了檢測(cè)ubap2l基因或ubap2l蛋白的產(chǎn)品在制備兒童i型糖尿病診斷工具中的用途。

本發(fā)明還提供了檢測(cè)ubap2l基因或ubap2l蛋白的產(chǎn)品在制備預(yù)測(cè)兒童i型糖尿病預(yù)后工具中的用途。

進(jìn)一步，所述檢測(cè)ubap2l基因或ubap2l蛋白的產(chǎn)品包括檢測(cè)ubap2l基因或ubap2l蛋白的表達(dá)水平的產(chǎn)品。所述產(chǎn)品包括能夠結(jié)合ubap2l基因的核酸或者能夠結(jié)合ubap2l蛋白的物質(zhì)(例如抗體)。所述核酸能夠檢測(cè)ubap2l基因的表達(dá)水平；所述物質(zhì)能夠檢測(cè)ubap2l蛋白的表達(dá)水平。

本發(fā)明的檢測(cè)ubap2l基因的產(chǎn)品可基于使用核酸分子的已知方法來(lái)發(fā)揮其功能：如pcr、如southern雜交、northern雜交、點(diǎn)雜交、熒光原位雜交(fish)、dna微陣列、aso法、高通量測(cè)序平臺(tái)等。使用該產(chǎn)品可以定性地、定量地、或半定量地實(shí)施分析。

包含在上述產(chǎn)品中的核酸可以通過(guò)化學(xué)合成來(lái)獲得，或通過(guò)從生物材料制備含有期望核酸的基因，然后使用設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增期望核酸的引物擴(kuò)增它來(lái)獲得。

進(jìn)一步，所述pcr方法為已知方法，例如，arms(amplificationrefractorymutationsystem，擴(kuò)增不應(yīng)突變系統(tǒng))法、rt-pcr(逆轉(zhuǎn)錄酶-pcr)法、嵌套pcr法等等。擴(kuò)增的核酸可以通過(guò)使用點(diǎn)印跡雜交法、表面等離子共振法(spr法)、pcr-rflp法、原位rt-pcr法、pcr-sso(序列特異性寡核苷酸)法、pcr-ssp法、ampflp(可擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性)法、mvr-pcr法、和pcr-sscp(單鏈構(gòu)象多態(tài)性)法來(lái)檢測(cè)。

上面所述的核酸包括擴(kuò)增ubap2l基因的引物，產(chǎn)品中包括的引物可以通過(guò)通過(guò)化學(xué)合成來(lái)制備，通過(guò)使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方法參考已知信息來(lái)適當(dāng)?shù)卦O(shè)計(jì)，并通過(guò)化學(xué)合成來(lái)制備。

在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述核酸為qpcr實(shí)驗(yàn)中使用的擴(kuò)增引物，所述引物的序列如seqidno.1(正向序列)和seqidno.2(反向序列)所示。

上面所述的核酸還可包括探針，所述探針可以通過(guò)化學(xué)合成來(lái)制備，通過(guò)使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方法參考已知信息來(lái)恰當(dāng)設(shè)計(jì)，并通過(guò)化學(xué)合成來(lái)制備，或者可以通過(guò)從生物材料制備含有期望核酸序列的基因，并使用設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增期望核酸序列的引物擴(kuò)增它來(lái)制備。

本發(fā)明的檢測(cè)ubap2l蛋白的產(chǎn)品可基于使用抗體的已知方法來(lái)發(fā)揮其功能：例如，可以包括elisa、放射免疫測(cè)定法、免疫組織化學(xué)法、western印跡等。

本發(fā)明的檢測(cè)ubap2l蛋白的產(chǎn)品包括特異性結(jié)合ubap2l蛋白的抗體或其片段?？梢允褂萌魏谓Y(jié)構(gòu)、尺寸、免疫球蛋白類(lèi)別、起源等的抗體或其片段，只要它結(jié)合靶蛋白質(zhì)即可。本發(fā)明的檢測(cè)產(chǎn)品中包括的抗體或其片段可以是單克隆的或多克隆的。抗體片段指保留抗體對(duì)抗原的結(jié)合活性的抗體一部分(部分片段)或含有抗體一部分的肽。抗體片段可以包括f(ab′)2、fab′、fab、單鏈fv(scfv)、二硫化物鍵合的fv(dsfv)或其聚合物、二聚化v區(qū)(雙抗體)、或含有cdr的肽。本發(fā)明的檢測(cè)ubap2l蛋白的產(chǎn)品可以包括編碼抗體或編碼抗體片段的氨基酸序列的分離的核酸，包含該核酸的載體，和攜帶該載體的細(xì)胞。

抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來(lái)獲得。例如，制備保留整個(gè)或部分靶蛋白質(zhì)的多肽或整合編碼它們的多核苷酸的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體作為抗原。使用抗原免疫動(dòng)物后，從經(jīng)過(guò)免疫的動(dòng)物獲得免疫細(xì)胞并融合骨髓瘤細(xì)胞以獲得雜交瘤。然后從雜交瘤培養(yǎng)物收集抗體。最后可以通過(guò)使用被用作抗原的ubap2l蛋白或其部分對(duì)獲得的抗體實(shí)施抗原特異性純化來(lái)獲得針對(duì)ubap2l蛋白的單克隆抗體。可以如下制備多克隆抗體：用與上文相同的抗原免疫動(dòng)物，從經(jīng)過(guò)免疫的動(dòng)物收集血液樣品，從血液中分離出血清，然后使用上述抗原對(duì)血清實(shí)施抗原特異性純化?？梢酝ㄟ^(guò)用酶處理獲得的抗體或通過(guò)使用獲得的抗體的序列信息來(lái)獲得抗體片段。

標(biāo)記物與抗體或其片段的結(jié)合可以通過(guò)本領(lǐng)域普遍知道的方法來(lái)實(shí)施。例如，可以如下熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)或肽：用磷酸鹽緩沖液清洗蛋白質(zhì)或肽，添加用dmso、緩沖劑、等準(zhǔn)備的染料，然后混合溶液，再于室溫放置10分鐘。另外，標(biāo)記可使用商品化的標(biāo)記試劑盒，諸如生物素標(biāo)記試劑盒，如生物素標(biāo)記試劑盒-nh2、生物素標(biāo)記試劑盒-sh(dojindolaboratories)；堿性磷酸酶標(biāo)記試劑盒諸如堿性磷酸酶標(biāo)記試劑盒-nh2、堿性磷酸酶標(biāo)記試劑盒-sh(dojindolaboratories)；過(guò)氧化物酶標(biāo)記試劑盒諸如過(guò)氧化物酶標(biāo)記試劑盒-nh2、過(guò)氧化物酶標(biāo)記試劑盒-nh2(dojindolaboratories)；藻膽蛋白標(biāo)記試劑盒諸如藻膽蛋白標(biāo)記試劑盒-nh2、藻膽蛋白標(biāo)記試劑盒-sh、b-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒-nh2，b-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒-sh、r-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒-nh2、r-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒sh(dojindolaboratories)；熒光標(biāo)記試劑盒諸如熒光素標(biāo)記試劑盒-nh2、hilytefluor(tm)555標(biāo)記試劑盒-nh2、hilytefluor(tm)647標(biāo)記試劑盒-nh2(dojindolaboratories)；及dylight547和dylight647(technochemicalcorp.)、zenon(tm)、alexafluor(tm)抗體標(biāo)記試劑盒、qdot(tm)抗體標(biāo)記試劑盒(invitrogencorporation)和ez-標(biāo)記物蛋白質(zhì)標(biāo)記試劑盒(funakoshicorporation)。為了正確標(biāo)記，可以使用適宜的儀器來(lái)檢測(cè)經(jīng)過(guò)標(biāo)記的抗體或其片段。

預(yù)測(cè)預(yù)后是指預(yù)測(cè)患者狀況的過(guò)程或結(jié)果，并不意味著能以100％的準(zhǔn)確度預(yù)測(cè)患者狀況的過(guò)程或結(jié)果。預(yù)測(cè)預(yù)后是指確定某些過(guò)程或結(jié)果的可能性是否增加，而并不意味著通過(guò)與某些過(guò)程或結(jié)果不發(fā)生的情況比較來(lái)確定發(fā)生某些過(guò)程或結(jié)果的可能性。如本發(fā)明而言，本發(fā)明中ubap2l基因或ubap2l蛋白的水平降低的患者中，與不顯示該特征的患者相比，更有可能觀察到特定過(guò)程或結(jié)果。

進(jìn)一步，所述檢測(cè)ubap2l基因或ubap2l蛋白的產(chǎn)品可以是檢測(cè)ubap2l基因或ubap2l蛋白的試劑、也可以是包含所述試劑的試劑盒、芯片、試紙等，也可以是使用所述試劑的高通量測(cè)序平臺(tái)。

利用前面所述的檢測(cè)產(chǎn)品檢測(cè)兒童受試者樣本中的ubap2l基因或ubap2l蛋白的表達(dá)水平，與正常兒童相比，兒童受試者樣本中的ubap2l基因或ubap2l蛋白的表達(dá)水平降低，則診斷該兒童受試者為兒童i型糖尿病患者或該患有兒童i型糖尿病的兒童受試者的預(yù)后差。

作為依照本發(fā)明的檢測(cè)產(chǎn)品的樣本，可以使用例如自活檢受試者獲得的組織樣品或流體。樣本不受特別限制，只要它適于本發(fā)明的測(cè)定；例如，它可以包括組織、血液、血漿、血清、淋巴液、尿液、漿膜腔液、脊髓液、滑液、房水、淚液、唾液、或其級(jí)分或經(jīng)過(guò)處理的材料。

在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述樣本來(lái)自兒童受試者的血液。

本發(fā)明還提供了一種診斷兒童i型糖尿病的工具，所述工具能夠檢測(cè)兒童受試者樣本中ubap2l基因或ubap2l蛋白的表達(dá)水平。所述工具包括能夠結(jié)合ubap2l基因的核酸或者能夠結(jié)合ubap2l蛋白的物質(zhì)(例如抗體)。所述核酸能夠檢測(cè)ubap2l基因的表達(dá)水平；所述物質(zhì)能夠檢測(cè)ubap2l蛋白的表達(dá)水平。

進(jìn)一步，所述核酸和所述物質(zhì)的性質(zhì)同前面所述。

進(jìn)一步，所述診斷兒童i型糖尿病的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測(cè)序平臺(tái)；高通量測(cè)序平臺(tái)是一種特殊的診斷兒童i型糖尿病的工具，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，對(duì)一個(gè)人的基因表達(dá)譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過(guò)對(duì)比疾病患者和正常人群的基因表達(dá)譜，容易分析出哪個(gè)基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測(cè)序中獲知ubap2l基因的異常與兒童i型糖尿病相關(guān)也屬于ubap2l基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

本發(fā)明還提供了一種預(yù)測(cè)兒童i型糖尿病預(yù)后的工具，所述工具能夠檢測(cè)兒童受試者樣本中ubap2l基因或ubap2l蛋白的表達(dá)水平，所述預(yù)測(cè)兒童i型糖尿病預(yù)后工具包括能夠結(jié)合ubap2l基因的核酸或者能夠結(jié)合ubap2l蛋白的物質(zhì)(例如抗體)。所述核酸能夠檢測(cè)ubap2l基因的mrna水平；所述物質(zhì)能夠檢測(cè)ubap2l蛋白的表達(dá)水平。

進(jìn)一步，所述核酸和所述物質(zhì)的性質(zhì)同前面所述。

進(jìn)一步，所述預(yù)測(cè)兒童i型糖尿病預(yù)后的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測(cè)序平臺(tái)；高通量測(cè)序平臺(tái)是一種特殊的診斷工具，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，對(duì)一個(gè)人的基因表達(dá)譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過(guò)對(duì)比疾病患者和正常人群的基因表達(dá)譜，容易分析出哪個(gè)基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測(cè)序中獲知ubap2l基因的異常與兒童i型糖尿病相關(guān)也屬于ubap2l基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

本發(fā)明的檢測(cè)產(chǎn)品、診斷工具中使用的抗ubap2l抗體或其片段所識(shí)別的氨基酸的數(shù)目沒(méi)有特別限制，只要抗體能夠結(jié)合ubap2l即可。當(dāng)抗體作為治療藥物時(shí)，優(yōu)選的是它能夠識(shí)別盡可能多的氨基酸，只要它能抑制ubap2l功能。抗體或其片段識(shí)別的氨基酸的數(shù)目是至少一個(gè)，更優(yōu)選至少三個(gè)?？贵w的免疫球蛋白類(lèi)別不受限制，可以是igg、igm、iga、ige、igd或igy。

本發(fā)明的檢測(cè)產(chǎn)品、診斷工具中使用的抗ubap2l抗體的其他性質(zhì)同前面所述。

進(jìn)一步，所述受試者樣本可以使用例如自活檢受試者獲得的組織樣品或流體。樣本不受特別限制，只要它適于本發(fā)明的測(cè)定；例如，它可以包括組織、血液、血漿、血清、淋巴液、尿液、漿膜腔液、脊髓液、滑液、房水、淚液、唾液、或其級(jí)分或經(jīng)過(guò)處理的材料。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述樣本來(lái)自受試者的血液。

本發(fā)明還提供了一種診斷兒童i型糖尿病或預(yù)測(cè)兒童i型糖尿病預(yù)后的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)獲取兒童受試者的樣品；

(2)檢測(cè)兒童受試者樣品中ubap2l基因或蛋白的表達(dá)水平；

(3)將測(cè)得的ubap2l基因或蛋白的表達(dá)水平與兒童受試者的患病與否關(guān)聯(lián)起來(lái)。

(4)與正常兒童相比，ubap2l基因或蛋白的表達(dá)水平降低，則該兒童受試者被診斷為兒童i型糖尿病，或判斷患有兒童i型糖尿病的兒童受試者預(yù)后差。

在本發(fā)明的上下文中，“診斷兒童i型糖尿病”既包括判斷兒童受試者是否已經(jīng)患有兒童i型糖尿病、也包括判斷兒童受試者是否存在患有兒童i型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種診斷兒童i型糖尿病以及預(yù)測(cè)兒童i型糖尿病患者預(yù)后的分子標(biāo)志物，使用該分子標(biāo)志物可以在兒童i型糖尿病發(fā)生的早期即可作為判斷，提高了患者的生存率。另外，通過(guò)預(yù)測(cè)患者的預(yù)后，本發(fā)明能夠提供有意義的信息來(lái)為患者決定治療方案策略。

附圖說(shuō)明

圖1顯示利用qpcr檢測(cè)ubap2l基因在兒童i型糖尿病患者和正常兒童中的表達(dá)差異；

圖2顯示利用免疫印跡檢測(cè)ubap2l基因在兒童i型糖尿病患者和正常兒童中的表達(dá)差異。

具體的實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1篩選兒童i型糖尿病患者和正常兒童中差異表達(dá)的基因

1、臨床對(duì)象：內(nèi)分泌科初次就診的兒童i型糖尿病(按who1999年糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn))住院患者10例，其中男5例，女5例，年齡5-16歲；正常對(duì)照組8例，其中男3例，女5例皆為健康體檢者，無(wú)糖尿病家族史，并排除內(nèi)分泌疾患及其他慢性疾病，年齡5-16歲，與糖尿病患兒性別、年齡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)備案并批準(zhǔn)，入選患兒及健康對(duì)照兒童合法監(jiān)護(hù)人均簽署臨床研究同意書(shū)。

2、血液總rna提取

使用bdpaxgenerna采血管(bd，762165)收集待檢測(cè)外周血樣本193例，本實(shí)驗(yàn)血液樣本收集的具體步驟包括：

1)將bdpaxgenerna采血管放置室溫(18℃-25℃)保存；

2)準(zhǔn)備采血針和bdpaxgenerna采血管；

3)用bdpaxgenerna采血管采集2.5ml血液；

4)采血時(shí)要防止bdpaxgenerna采血管內(nèi)液體的倒流；

將病人手臂放置適合位置，采血時(shí)，將bdpaxgenerna采血管垂直放置，低于病人手臂平面，松開(kāi)采血帶，讓血液自動(dòng)流入bdpaxgenerna采血管內(nèi)，注意不要將bdpaxgenerna采血管內(nèi)液體倒流入病人體內(nèi)；

5)當(dāng)血液停止流出10秒鐘后，將bdpaxgenerna采血管取下。bdpaxgenerna采血管為負(fù)壓設(shè)計(jì)，會(huì)自動(dòng)吸取2.5ml血液。采血結(jié)束后立即將bdpaxgenerna采血管上下顛倒8-10次；

6)將bdpaxgenerna采血管正立放置，室溫(18℃-25℃)放置2小時(shí)。

7)放入4℃冰箱保存，運(yùn)輸過(guò)程中要保存在4℃冰盒當(dāng)中；

8)如果不需要運(yùn)輸室溫放置2小時(shí)后即可進(jìn)行rna的提取，如果需要保存先將bdpaxgenerna采血管置于-20℃冰箱中保存24小時(shí)后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。

3、待檢測(cè)外周血樣本總rna的提取純化

本實(shí)驗(yàn)同時(shí)使用qiagen公司的paxgenetmbloodrnakit(qiagen，762174)和mirneasyminikit(qiagen，217004)提取外周血總rna，具體步驟包括；

1)室溫5000rpm離心paxgenerna采血管10分鐘；

2)小心棄去上清，加入4ml無(wú)rna酶的水，蓋緊膠蓋；

3)在渦旋振蕩器上重新將沉淀懸起，室溫5000rpm離心10分鐘，小心棄去上清；

4)加入350μl重懸buffer(br1)，用移液器懸起沉淀，混勻直至無(wú)可見(jiàn)沉淀為止；

5)將重懸液移至1.5mlep管中，加入300μl結(jié)合緩沖液(br2)和40μl蛋白酶k，在渦旋振蕩器上震蕩5秒鐘，將ep管置于55℃水浴搖床之中400-1400rpm孵育10分鐘；

6)將上述液體移至paxgeneshredderspincolumn(psc)，室溫12000rpm離心3分鐘；

7)小心用移液器將上清移至新的1.5ep管中，不要吸到離心管底的沉淀；

8)將ep管中的液體平均分入2個(gè)ep管中，在每管中加入875μl無(wú)水乙醇(96-100％，分析純)，扣緊蓋子上下顛倒8-10次，簡(jiǎn)短離心，使液體全部收集在管底；

9)先將700μl液體移入rneasyminispincolumn柱中，室溫12000rpm離心1分鐘，棄去收集管中的過(guò)濾液體，在rneasyminispincolumn柱中繼續(xù)加入700μl液體室溫12000rpm離心1分鐘；

10)將液體全部離心完后，棄去收集管以及其中的液體；

11)加入350μlbufferrwt至rneasyspincolumn柱中，輕輕蓋上蓋子，室溫12000rpm離心15秒，棄去離心后的液體；

12)將10μl加入dna酶(dnaseistocksolution)加入70μlrdd中，輕輕上下顛倒8-10次，簡(jiǎn)短離心；

13)將上述80μl液體直接滴入rnasyspincolumn柱的中央，室溫放置15分鐘以去除dna；

14)加入350μlbufferrwt至rneasyspincolumn柱中，輕輕蓋上蓋子，室溫12000rpm離心15秒，棄去離心后的液體；

15)加入500μlbufferrpe至rneasyspincolumn柱中，輕輕蓋上蓋子，室溫12000rpm離心15秒，棄去離心后的液體；

16)加入500μlbufferrpe至rneasyspincolumn柱中，輕輕蓋上蓋子，室溫12000rpm離心2分鐘，棄去離心后的液體；

17)將rneasyspincolumn柱移至一新的收集管中，室溫12000rpm離心1分鐘；

18)將rneasyspincolumn柱移至新的無(wú)rna酶的ep管中，向膜的中央加入30μl去rna酶的水，靜置1分鐘后室溫12000rpm離心1分鐘；

19)將離心后的30μl含rna溶液重新滴入膜的中央，重復(fù)步驟18一次；

20)抽提好的rna通過(guò)紫外分光光度計(jì)分析rna濃度，在260和280nm測(cè)定吸光度來(lái)確定樣品的濃度和純度，a260/a280應(yīng)接近2.0為較純的rna(比值在1.9-2.1也可)，通過(guò)瓊脂糖電泳，檢測(cè)rna28s，18s，檢測(cè)rna的完整性。a260/a280大于1.90并且28s的電泳條帶與18s的電泳條帶之比在2∶1左右認(rèn)為rna質(zhì)檢合格，如果28s的電泳條帶與18s的電泳條帶之比小于1并且存在大量5s條帶認(rèn)為rna出現(xiàn)降解或部分降解，rna質(zhì)檢不合格。

4、片段化rna

illumina平臺(tái)是針對(duì)短序列片段進(jìn)行測(cè)序，mrna平均長(zhǎng)度可能達(dá)幾kb，因此需要對(duì)其進(jìn)行隨機(jī)打斷。利用金屬離子，可以將rna隨機(jī)斷裂成200bp左右的小片段。

5、反轉(zhuǎn)合成cdna

在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，利用隨機(jī)引物，以mrna為模板反轉(zhuǎn)合成一鏈cdna，進(jìn)行二鏈合成時(shí)，dntps試劑中用dutp代替dttp，使cdna第二鏈中堿基包含a/u/c/g。

6、連接adaptor

雙鏈的cdna結(jié)構(gòu)為粘性末端，加入endrepairmix將其補(bǔ)成平末端，隨后在3’末端加上一個(gè)a堿基，用于連接y字形的接頭。

7、ung酶消化cdna二鏈

在pcr擴(kuò)增前，用ung酶將cdna第二鏈消化，從而使文庫(kù)中僅包含cdna第一鏈。

8、illuminax-ten上機(jī)測(cè)序

illuminax-ten測(cè)序平臺(tái)，進(jìn)行2*150bp測(cè)序。

9、生物信息學(xué)分析

測(cè)序數(shù)據(jù)獲得以后的rawdata分析過(guò)程如下所示：

(1)用cutadapt對(duì)reads的5’和3’段進(jìn)行trim，trim掉質(zhì)量<20的堿基，并且刪掉n大于10％的reads；

(2)tophat比對(duì)到參考基因組上。所用的參考基因組版本為grch38.p7，fasta和gff文件下載自ncbi；

(3)cuffquant定量mrna的表達(dá)量并標(biāo)準(zhǔn)化輸出；

(4)在r環(huán)境下用degseq包比較對(duì)照組跟疾病組mrna的表達(dá)差異。顯著差異mrna篩選條件：p-value<0.05。

10、結(jié)果

用以上標(biāo)準(zhǔn)篩選得到差異表達(dá)基因342個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)的基因159個(gè)，表達(dá)下調(diào)的基因有183個(gè)。

實(shí)施例2qpcr實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證兒童i型糖尿病患者和正常兒童中差異表達(dá)的基因

選擇實(shí)施例1篩選出的ubap2l基因進(jìn)行大樣本驗(yàn)證。

1、臨床對(duì)象：內(nèi)分泌科初次就診的兒童i型糖尿病(按who1999年糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn))住院患者10例，其中男5例，女5例，年齡5-16歲；正常對(duì)照組8例，其中男3例，女5例皆為健康體檢者，無(wú)糖尿病家族史，并排除內(nèi)分泌疾患及其他慢性疾病，年齡5-16歲，與糖尿病患兒性別、年齡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)備案并批準(zhǔn)，入選患兒及健康對(duì)照兒童合法監(jiān)護(hù)人均簽署臨床研究同意書(shū)。

2、血液總rna提取

同實(shí)施例1。

3、逆轉(zhuǎn)錄

用逆轉(zhuǎn)錄緩沖液對(duì)lμg總rna進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cdna。采用25μl反應(yīng)體系，每個(gè)樣品取1μg總rna作為模板rna，在pcr管中分別加入以下組分：depc水，5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，10mmol/ldntp，0.1mmol/ldtt，30μmmol/loligodt,200u/μlm-mlv，模板rna。42℃孵育1h，72℃10min，短暫離心。

4、qpcr

采用sybrgreen染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr，反應(yīng)體系為25μl：2×quantitectsybrgreenpcrmastermix(12.5μl)，10×miscriptuniversalprimer(2.5μl)，10×miscriptprimerassay(2.5μl)，rnase-free水(5.5μl)，cdna模板(2μl)。實(shí)施3平行，以gapdh為內(nèi)參。使用abi7500fast型熒光定量pcr儀(abi，美國(guó))，反應(yīng)條件為：94℃反應(yīng)15s，55℃反應(yīng)30s，70℃反應(yīng)34s，40個(gè)循環(huán)，添加熔解曲線。

引物序列如下：

擴(kuò)增ubap2l基因的正向引物序列為5’-tgttgcctaatccgtata-3’(seqidno.1)，反向引物序列為5’-atgctgtagtaatccaatg-3’(seqidno.2)；

擴(kuò)增gapdh基因的正向引物序列為5’-tttaactctggtaaagtggatat-3’(seqidno.3)，反向引物序列為5’-ggtggaatcatattggaaca-3’(seqidno.4)。

5、結(jié)果

采用2^-△△ct相對(duì)定量法，以正常兒童組的mrna相對(duì)表達(dá)水平為1。結(jié)果如圖1所示，與正常兒童相比，兒童i型糖尿病患者血液中ubap2l基因的mrna水平顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。

實(shí)施例3免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證兒童i型糖尿病患者和正常兒童中差異表達(dá)基因的表達(dá)產(chǎn)物

1、臨床對(duì)象：同實(shí)施例2。

2、單核細(xì)胞分離

兒童i型糖尿病患者和正常兒童取靜脈血10ml，注入盛肝素的無(wú)菌小瓶中，加蓋后立即輕輕搖勻。用無(wú)菌吸管加入等體積的hbss(nacl8.0g，na2hpo40.132g，kh2po40.06g，kcl0.4g，酚紅1ml，nahco30.35g，d-葡萄糖1.0g，溶于1000ml雙蒸水)，以降低紅細(xì)胞的凝聚。吸取8ml淋巴細(xì)胞分層液置50ml離心管中，將稀釋血液沿管壁緩慢加入，保持界面清楚，勿使兩者相混，在20℃2000r/min離心30min，小心吸取分層液與血漿交接部位混濁的灰白色層，即淋巴細(xì)胞層，加入另一支離心管中，用5倍體積的hbss洗滌2次，依次以2000r/min、1500r/min在室溫下離心10min，以便去除大部分混雜的血小板，用10ml雙蒸水與細(xì)胞團(tuán)塊混合1min，使殘余紅細(xì)胞裂解，然后迅速加入等量1.8％nacl溶液，2000r/min離心，去上清，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后用hbss溶液調(diào)整細(xì)胞至1×10⁶個(gè)/ml備用。

3、單核細(xì)胞總蛋白質(zhì)提取

將上述實(shí)驗(yàn)所得細(xì)胞懸液(濃度為1×10⁶個(gè)/ml)室溫1000r/min離心10min，棄上清后加入100μl裂解緩沖液，4℃震蕩1h，用超聲波儀破碎細(xì)胞，每次10s，共10次，于4℃12000r/min離心1h；取上清用brandford法定量蛋白，分裝成2.5μg/μl，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

4、westernblot檢測(cè)

每個(gè)樣本均取25μg總蛋白上樣進(jìn)行電泳，并在電泳中加入預(yù)染marker，選用8％的page膠電泳。

根據(jù)預(yù)染marker(預(yù)染標(biāo)記物)的顯示，判定目的蛋白充分分離后，停止電泳。取出凝膠，根據(jù)marker顯示的條帶切下目的條帶，用蒸餾水沖洗目的條帶。

預(yù)制大小與page凝膠相同的pvdf膜和若干濾紙，將pvdf膜用甲醇浸泡數(shù)秒后和若干濾紙一同放置于電轉(zhuǎn)緩沖液中浸泡2h后取出。

將凝膠、纖維墊、黑色板、白色板、浸泡后的pvdf膜和若干濾紙，按照黑色板-纖維墊-濾紙-凝膠-pvdf膜-濾紙-纖維墊-白色板的順序依次放好，夾緊黑色板和白色板后，按照黑色板的一面對(duì)照黑色負(fù)極的順序放入轉(zhuǎn)膜儀內(nèi)，先在轉(zhuǎn)膜電流為200ma的條件下轉(zhuǎn)膜10min，再在轉(zhuǎn)膜電流為300ma的條件下轉(zhuǎn)膜30min至轉(zhuǎn)膜完成，得到印記pvdf膜。

將印記pvdf膜放入含有5％脫脂奶粉的tbst緩沖溶液中，在室溫下震蕩2h進(jìn)行封閉。

按照tbst緩沖溶液與一抗的體積比為1:1000的條件制備一抗孵育液，將封閉后的印記pvdf膜放入一抗孵育液中，在溫度為4℃的條件下孵育12h，得到第一孵育pvdf膜，使用tbst緩沖溶液沖洗第一孵育pvdf膜，沖洗次數(shù)為5～6次，每次沖洗的時(shí)間均為5min。

按照tbst緩沖溶液和二抗體積比為1:5000的條件制備二抗孵育液，將沖洗后的第一孵育pvdf膜放入二抗孵育液中，在室溫下震蕩2h得到第二孵育pvdf膜，使用tbst緩沖溶液按照沖洗次第二孵育pvdf膜，沖洗次數(shù)為5～6次，每次沖洗的時(shí)間均5min。

在每張沖洗后的第一孵育pvdf膜、第二孵育pvdf膜上滴加ecl(electrochemiluminescence，化學(xué)發(fā)光底物)化學(xué)發(fā)光底物，孵育至第一孵育pvdf膜、第二孵育pvdf膜有明顯的熒光后，用濾紙吸去第一孵育pvdf膜、第二孵育pvdf膜上的ecl化學(xué)發(fā)光底物，用保鮮膜包裹第一孵育pvdf膜、第二孵育pvdf膜后，進(jìn)行x光膠片壓片，依次放入顯影液顯影、定影液定影，得到第一膠片和第二膠片，利用bandscan軟件，分析所有第一膠片、第二膠片的灰度值，得到樣本中ubap2l蛋白的表達(dá)結(jié)果。

5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

將蛋白條帶的灰度值使用imagej軟件進(jìn)行分析，以β-actin為內(nèi)參，將目的白條帶的灰度值進(jìn)行歸一化處理。結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示，采用spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)p<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

6、結(jié)果

結(jié)果如圖2所示，與正常兒童相比，兒童i型糖尿病患者血液中ubap2l蛋白含量降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。

上述實(shí)施例的說(shuō)明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。

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<110>北京泱深生物信息技術(shù)有限公司

<120>ubap2l在兒童i型糖尿病診斷或預(yù)后中的用途

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