本發(fā)明涉及一種檢測(cè)方法，具體涉及一種用于鑒別西紅花的熒光pcr檢測(cè)引物組、試劑盒及檢測(cè)方法和應(yīng)用。屬于分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

2015版《中國(guó)藥典》規(guī)定：西紅花為鳶尾科植物番紅花crocussativusl.的干燥柱頭。西紅花，又名藏紅花、番紅花，是一種名貴的中藥材，具有強(qiáng)大的生理活性，其柱頭在亞洲和歐洲作為藥用，有鎮(zhèn)靜、祛痰、解痙作用，用于胃病、調(diào)經(jīng)、麻疹、發(fā)熱、黃膽、肝脾腫大等的治療。由于西紅花價(jià)格十分昂貴，被譽(yù)為“植物黃金”，由于受利益的驅(qū)使，部分不法商販會(huì)利用其他植物的花柱或花絲冒充西紅花銷(xiāo)售。據(jù)報(bào)道，常見(jiàn)的摻假偽品主要有:紅花(carthamustinctoriusl.)的干燥花，蓮藕(nelumbonuciferag)的藕須，利用胡蘿卜絲和玉米須進(jìn)行染色等冒充正品西紅花。這些偽品在臨床上達(dá)不到西紅花的治療效果，因此，建立快速、準(zhǔn)確的鑒別西紅花的方法，對(duì)其市場(chǎng)監(jiān)管、保證臨床用藥安全具有十分重要的意義。

目前，對(duì)于中草藥的鑒別主要集中于性狀、顯微、理化、化學(xué)和生物學(xué)鑒定五大領(lǐng)域。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一些基于dna的生物學(xué)鑒定手段逐漸豐富起來(lái)，dna分子法主要是利用顯示生物特征的各種生物物種所具有的不同dna序列信息進(jìn)行鑒別，它可以突破依據(jù)感官檢測(cè)的局限性，與傳統(tǒng)分析方法相比，更加具有客觀性和準(zhǔn)確性。李順旭等通過(guò)利用氣相色譜法檢測(cè)西紅花有效成分來(lái)區(qū)分其正偽品，但對(duì)于源性真?zhèn)舞b定來(lái)說(shuō)，該方法只能鑒定出所含的生理生化成分，但是無(wú)法準(zhǔn)確分別出不同種類(lèi)的源性成分的來(lái)源。黃豐等利用rapd技術(shù)鑒別西紅花真?zhèn)?，雖然無(wú)需進(jìn)行雜交、基因克隆和測(cè)序等步驟，但是該方法在擴(kuò)增的過(guò)程中容易出現(xiàn)擴(kuò)增效率差，條帶模糊或難以辨認(rèn)的情況。

中草藥dna條形碼作為中草藥真?zhèn)舞b定的“有效身份證”。專(zhuān)利(cn201110132089)采用issr技術(shù)通過(guò)指紋圖譜鑒定西紅花干品。中國(guó)專(zhuān)利(cn104630327a)利用psba-trnh和rbcl基因設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行多重pcr檢測(cè)西紅花。這些傳統(tǒng)的dna分子檢測(cè)方法對(duì)dna提取質(zhì)量要求較高，并且靈敏度和假陽(yáng)性比率相對(duì)較高，判定上存在較大誤差，開(kāi)管操作易污染。目前，對(duì)于植物的鑒定大多采用its2、psba-trnh和rbcl基因設(shè)計(jì)引物，但并不是有了該基因設(shè)計(jì)引物所有的問(wèn)題就可以迎刃而解，針對(duì)具體的成分和植物源性進(jìn)行進(jìn)一步研究才可以得到最終問(wèn)題的解決。本發(fā)明通過(guò)對(duì)西紅花不同的基因篩選不同引物，發(fā)現(xiàn)its2基因擴(kuò)增效率更高，與紅花等偽品序列差異性大，西紅花種內(nèi)變異小，更適合西紅花鑒別。而近年來(lái)實(shí)時(shí)熒光pcr技術(shù)的飛速發(fā)展大大提高了檢測(cè)的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性，由于熒光定量整個(gè)檢測(cè)過(guò)程為閉管操作，所以有效的減少了實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的污染的危險(xiǎn)，目前廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。利用實(shí)時(shí)熒光pcr檢測(cè)西紅花真?zhèn)挝匆?jiàn)相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于鑒別西紅花的熒光pcr檢測(cè)引物組、試劑盒及檢測(cè)方法和應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

一種用于鑒別西紅花的熒光pcr檢測(cè)引物組，包括：

(1)用于鑒別西紅花的熒光pcr檢測(cè)特異性引物，其核苷酸序列如下：

正向引物序列zhhf：5'-acatcgttgtttgtgcctactc-3'，如seqidno.1所示；

反向引物序列zhhr：5'-ggacggttccttcttcttattc-3'，如seqidno.2所示；

(2)一種用于鑒別紅花實(shí)時(shí)熒光pcr檢測(cè)特異性引物，其核苷酸序列如下：

正向引物序列hhf:5'-gggaagtgtttggtttgggac-3'，如seqidno.3所示：

反向引物序列hhr:5'-ccgttagggtctttagagaggaat-3'，如seqidno.4所示：

(3)用于鑒別西紅花及其偽品的熒光pcr檢測(cè)通用引物，其核苷酸序列如下：

正向引物序列hhuf：5'-gcgactctcggcaacggata-3'，如seqidno.5所示；

反向引物序列hhur：5'-gtgacgcccaggcagacg-3'，如seqidno.6所示。

一種用于鑒別西紅花的熒光pcr檢測(cè)試劑盒，包括上述熒光pcr檢測(cè)引物組，以及西紅花dna提取液和多重實(shí)時(shí)熒光pcr反應(yīng)擴(kuò)增體系。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，所述pcr檢測(cè)試劑盒還包括西紅花陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品(紅花等偽品)和空白對(duì)照品(雙蒸水)。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，所述多重實(shí)時(shí)熒光pcr反應(yīng)擴(kuò)增體系采用20μl反應(yīng)體系，包括：2×sybrgreenmix10μl，各正向引物或反向引物2μm分別取1μl，50×rox0.4μl，dna(濃度1～50ng/μl)模板取2.0μl，用雙蒸水補(bǔ)足至20μl，如表1所示。

表1.pcr反系擴(kuò)增體系

上述引物組或試劑盒在鑒別西紅花中的應(yīng)用。

一種用于鑒別西紅花的檢測(cè)方法，具體步驟如下：

(1)從待測(cè)樣品中提取dna為模板，選擇靶基因；

(2)利用上述的引物組作為pcr擴(kuò)增引物，并使用上述試劑盒進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

(3)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照及空白對(duì)照，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，給出第n個(gè)循環(huán)時(shí)的熒光增加值δrn與擴(kuò)增曲線ct值，根據(jù)特異性引物和通用引物的熒光信號(hào)及擴(kuò)增曲線ct值來(lái)判定是否含有西紅花成分。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，步驟(1)中dna的提取使用植物基因組試劑盒，并按其說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，步驟(1)中靶基因選自內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)its2基因，相比于植物其他基因在核糖體rdna整體結(jié)構(gòu)功能上的特殊，既具有一定的保守性，又具有較高的可變性，其序列在不同種類(lèi)、或同種的不同個(gè)體中都可能存在較大差異，故利用its2序列作為西紅花鑒別靶基因特異性強(qiáng)且準(zhǔn)確性高。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，步驟(2)進(jìn)行pcr擴(kuò)增時(shí)，在至少3通道型號(hào)的熒光定量pcr儀上進(jìn)行，擴(kuò)增程序：95℃，2min；95℃，10s；64℃，35s，在此收集熒光信號(hào)，40個(gè)循環(huán)。根據(jù)不同型號(hào)的pcr儀的不同要求可以對(duì)標(biāo)記熒光號(hào)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。

本發(fā)明的有益效果：

普通的pcr擴(kuò)增雖然能夠克服傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)和顯微鑒別存在的問(wèn)題，但是需要經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行判斷，相對(duì)操作誤差較大且溴化乙錠污染，檢測(cè)周期長(zhǎng)，不能進(jìn)行實(shí)時(shí)快速檢測(cè)。本發(fā)明通過(guò)設(shè)計(jì)西紅花的特異性引物和通用引物，采用實(shí)時(shí)sybrgreen熒光染料法鑒別西紅花真?zhèn)?，無(wú)需特別的優(yōu)化條件，簡(jiǎn)便易行，成本較低而且能克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。

本發(fā)明所需要的dna用量少，操作簡(jiǎn)便，閉管操作減少污染。在dna提取的前提下，可在2小時(shí)內(nèi)完成西紅花的檢測(cè)。另外，本發(fā)明涉及的方法還具有直觀、安全、通量大、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，能夠?qū)崟r(shí)、快速、準(zhǔn)確的進(jìn)行dna擴(kuò)增反應(yīng)和樣品檢測(cè)?？傊?，本發(fā)明可用于西紅花真?zhèn)蔚目焖勹b別，具有較高的可行性和應(yīng)用前景，為中草藥西紅花市場(chǎng)的健康穩(wěn)定發(fā)展具有重要的意義。

附圖說(shuō)明

圖1.當(dāng)西紅花zhhf/r特異引物、紅花特異引物hhf/r及通用引物hhuf/r同時(shí)有擴(kuò)增曲線時(shí)，說(shuō)明待檢樣本為同時(shí)檢測(cè)出正品西紅花和偽品紅花。

圖2.當(dāng)zhhf/r特異引物沒(méi)有擴(kuò)增曲線，hhuf/r通用引物有擴(kuò)增曲線時(shí)，說(shuō)明待檢樣本為西紅花的偽品。

圖3.正品西紅花的熔解曲線圖，zhhf/r特異引物和通用引物的熔解曲線同時(shí)存在且峰單一。

圖4.西紅花偽品的熔解曲線圖，zhhf/r特異引物基本無(wú)熔解曲線峰值，通用引物有熔解曲線，峰值不單一。

圖5.正品西紅花zhhf/r特異引物靈敏度擴(kuò)增曲線圖，檢測(cè)限為0.01ng。

圖6.偽品紅花hhf/r特異引物靈敏度擴(kuò)增曲線圖，檢測(cè)限為0.01ng。

圖7.通用引物hhuf/r靈敏度擴(kuò)增曲線圖，檢測(cè)限為0.01ng。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的闡述，應(yīng)該說(shuō)明的是，下述說(shuō)明僅是為了解釋本發(fā)明，并不對(duì)其內(nèi)容進(jìn)行限定。

本發(fā)明中所用實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器如下：

實(shí)驗(yàn)材料：

正品西紅花及常見(jiàn)偽品紅花購(gòu)自省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院；藕須、玉米須、胡蘿卜絲、菊花購(gòu)自濟(jì)南市某超市；白術(shù)、人參、黨參、生地、石斛等植物由山東東阿國(guó)膠堂有限公司；另外，市售西紅花藥材隨機(jī)選取15份購(gòu)自濟(jì)南市某藥材市場(chǎng)。以上樣品均經(jīng)過(guò)中草藥dna條形碼技術(shù)基因測(cè)序進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證。

所用試劑：

植物dna提取試劑盒，dna分子量makerdl2000、電泳上樣緩沖液等pcr反應(yīng)試劑購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。引物由生工生物工程(上海)有限公司負(fù)責(zé)合成。2×sybrgreenmix為dbibioscience品牌。dna測(cè)序由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)中心測(cè)序中心完成。

所用儀器：

abi7500熒光定量pcr儀為abi公司產(chǎn)品，takarapcr儀為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。5424d型高速離心機(jī)為eppendorf公司產(chǎn)品。

實(shí)施例1

1、西紅花及偽品樣本dna提取：

采用植物dna提取試劑盒提取，具體操作步驟見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。提取的基因組dna經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定其純度和濃度。測(cè)定od260/od280值均為1.8～1.9左右，濃度在10ng/μl以上，說(shuō)明dna純度較高，濃度適中，符合pcr擴(kuò)增要求。

2、靶基因的選擇和引物的設(shè)計(jì)：

its2序列是介于5.8s和28srrna基因之間的非編碼序列，因其在核糖體rdna整體結(jié)構(gòu)功能上的特殊，既具有一定的保守性，又具有較高的可變性，其序列在不同種類(lèi)、或同種的不同個(gè)體中都可能存在較大差異，因此，利用its2序列作為西紅花鑒定靶基因具有既簡(jiǎn)明又可靠的特性。

基于dna條形碼技術(shù)原理選擇its2基因?yàn)槟繕?biāo)靶基因，在genbank搜索并下載西紅花及常見(jiàn)偽品its2基因序列，通過(guò)mega5.0分析軟件比對(duì)設(shè)計(jì)特異引物和通用引物，各核苷酸序列見(jiàn)表2。

表2.引物序列

3、西紅花的熒光檢測(cè)：

選用20μl的實(shí)時(shí)熒光pcr擴(kuò)增體系，反應(yīng)體系見(jiàn)表1。

4、pcr擴(kuò)增條件為：pcr擴(kuò)增條件為：95℃2min；95℃10s，64℃，35s，在此收集熒光信號(hào)，40個(gè)循環(huán)。

5、結(jié)果分析：每次試驗(yàn)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照及空白對(duì)照，試驗(yàn)結(jié)束后打開(kāi)分析軟件，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，給出δrn(第n個(gè)循環(huán)時(shí)的熒光增加值)與擴(kuò)增曲線ct值，根據(jù)特異引物和通用引物的熒光信號(hào)及擴(kuò)增曲線ct值來(lái)判定待測(cè)樣品是否為西紅花及偽品紅花。結(jié)果見(jiàn)圖1，當(dāng)西紅花zhhf/r特異引物、紅花特異引物hhf/r及通用引物hhuf/r同時(shí)有擴(kuò)增曲線時(shí)，說(shuō)明待檢樣本為同時(shí)檢測(cè)出正品西紅花和偽品紅花。圖2結(jié)果顯示，當(dāng)zhhf/r特異引物沒(méi)有擴(kuò)增曲線，hhuf/r通用引物有擴(kuò)增曲線時(shí)，說(shuō)明待檢樣本為西紅花的偽品。

實(shí)施例2特異性驗(yàn)證

利用本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物，分別以西紅花、紅花、藕須、玉米須、胡蘿卜絲、菊花、白術(shù)、人參、黨參、生地、石斛等植物總基因組dna為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光pcr檢測(cè)，驗(yàn)證其引物的特異性。其結(jié)果見(jiàn)表3，圖3為正品西紅花的熔解曲線圖，zhhf/r特異引物和通用引物hhuf/r的熔解曲線同時(shí)存在且峰單一；圖4為西紅花偽品的熔解曲線圖，zhhf/r特異引物基本無(wú)熔解曲線峰值，通用引物hhuf/r有熔解曲線，峰值不單一。以上結(jié)果表明本研究所設(shè)計(jì)的引物具有很強(qiáng)的特異性。

表3.特異性驗(yàn)證試驗(yàn)

實(shí)施例3靈敏度實(shí)驗(yàn)

按照實(shí)施例1，將西紅花的基因組dna定量到50ng，按10×梯度稀釋?zhuān)總€(gè)梯度均取2.0μl為模板量(即：10ng、1ng、0.1ng、0.01ng、0.001ng)，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)，評(píng)估本發(fā)明的檢測(cè)限。見(jiàn)圖5～7，結(jié)果表明本方法定量檢測(cè)限為0.01ng，說(shuō)明本發(fā)明所提供的方法具有很高的靈敏度。

實(shí)施例4實(shí)際樣本檢測(cè)

利用本發(fā)明提供的試劑盒及檢測(cè)方法對(duì)市售的15份樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光pcr檢測(cè)，并與測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證，以驗(yàn)證方法的使用價(jià)值。由表4中可以看出，該方法與測(cè)序結(jié)果完全一致，市售西紅花樣品中檢出7份偽品。同時(shí)，通過(guò)中草藥dna條形碼檢測(cè)，需要時(shí)間較長(zhǎng)，不能達(dá)到實(shí)時(shí)檢測(cè)效果，而且一些相近物種較難區(qū)分。本發(fā)明設(shè)計(jì)的方法，能夠2小時(shí)內(nèi)完成對(duì)樣本的準(zhǔn)確快速鑒別，且靈敏度高。該檢測(cè)方法適合于待測(cè)樣品中西紅花源性成分的檢測(cè)。

表4.實(shí)際樣本檢測(cè)

上述雖然結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行了描述，但并非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動(dòng)即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍以內(nèi)。

sequencelisting

<110>山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心

<120>一種用于鑒別西紅花的熒光pcr檢測(cè)引物組、試劑盒及檢測(cè)方法和應(yīng)用

<130>2017

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>正向引物zhhf

<400>1

acatcgttgtttgtgcctactc22

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>反向引物序列zhhr

<400>2

ggacggttccttcttcttattc22

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>正向引物序列hhf

<400>3

gggaagtgtttggtttgggac21

<210>4

<211>24

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>反向引物序列hhr

<400>4

ccgttagggtctttagagaggaat24

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>正向引物序列hhuf

<400>5

gcgactctcggcaacggata20

<210>6

<211>18

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>反向引物序列hhur

<400>6

gtgacgcccaggcagacg18