本發(fā)明屬于家禽育種技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種基于鴨胚的卵母細(xì)胞的分離提取方法。

背景技術(shù)：

目前，在家畜中卵母細(xì)胞體外成熟是一項(xiàng)繁殖生物技術(shù)，通過體外成熟培養(yǎng)卵巢有腔卵泡來源的卵母細(xì)胞可以為育種、克隆及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物提供豐富的卵源，并且該技術(shù)已經(jīng)在生產(chǎn)上被廣泛應(yīng)用。在此技術(shù)中最重要的就是分離出大量并且活性好的卵母細(xì)胞，在此方面家畜研究已經(jīng)非常成熟，然而家禽卻鮮有報(bào)道。

現(xiàn)研究報(bào)道中，家畜卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)是采用膠原酶消化法從腔前卵泡獲得到大量來源于0.2-0.3mm腔前卵泡的卵母細(xì)胞-顆粒細(xì)胞復(fù)合物。但是該方法提取并非單一的卵母細(xì)胞，影響后續(xù)研究，并且對(duì)于卵泡結(jié)構(gòu)與哺乳動(dòng)物不一樣的家禽來說該方法是不適合的，因?yàn)榧仪萋雅蒹w積不僅比家畜小并且卵泡中還有大量的卵黃，影響卵母細(xì)胞提取。現(xiàn)有的方法一般選取成年家畜分離提取卵母細(xì)胞，這樣耗時(shí)長(zhǎng)。為了全面了解蛋鴨卵母細(xì)胞成熟期間的生理過程，本發(fā)明提供了一種低成本，省時(shí)，高效的蛋鴨卵母細(xì)胞分離提取方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明針對(duì)上述的問題，提供了一種基于鴨胚的卵母細(xì)胞的分離提取方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種基于鴨胚的卵母細(xì)胞的分離提取方法，包括以下步驟：

步驟1、選取鴨胚的卵巢組織4-6個(gè)，將卵巢組織置于滅菌pbs中，將卵巢組織剪碎；

步驟2、在剪碎的卵巢組織碎片中加入10ml混合酶消化液，將卵巢組織碎片和混合酶消化液置于細(xì)口消化瓶中，并放置在搖床上進(jìn)行消化處理；

步驟3、用移液槍吹打卵巢組織碎片，加入胎牛血清終止消化，用細(xì)胞篩網(wǎng)過濾；

步驟4、收集濾液，并進(jìn)行離心處理；棄濾液，在沉淀的細(xì)胞中加細(xì)胞培養(yǎng)基，移液器輕柔吹打20-30次，使細(xì)胞懸浮，將細(xì)胞懸浮液鋪板培養(yǎng)皿；分離提取得到基于鴨胚的卵母細(xì)胞。

進(jìn)一步地，步驟1中的鴨胚的胚齡為24-26天。

進(jìn)一步地，步驟2中的混合酶消化液的配比為每10ml中含有3-5mg膠原蛋白酶ⅱ、3-5mg蛋白酶和3-5mg透明質(zhì)酸酶。

進(jìn)一步地，步驟2中的消化時(shí)間為45-60min，消化溫度為37℃，消化轉(zhuǎn)速為170-190r/min。

進(jìn)一步地，步驟3中的胎牛血清的體積濃度為10％，細(xì)胞篩網(wǎng)的目數(shù)為200目。

進(jìn)一步地，步驟4中的離心轉(zhuǎn)速為1000-1500r/min，離心時(shí)間為3-4min。

進(jìn)一步地，步驟4中的細(xì)胞懸浮液按照1×10⁴cell/ml濃度鋪板培養(yǎng)皿。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以獲得包括以下技術(shù)效果：

1)胚胎階段原始卵泡是整個(gè)動(dòng)物生命周期最多的時(shí)期，分離此時(shí)期的卵巢能提取大量的卵母細(xì)胞；選擇此階段的卵巢還減少了卵黃對(duì)提取卵母細(xì)胞的影響。

2)本發(fā)明不需要解剖成年家禽，減少細(xì)胞污染并且減少了試驗(yàn)成本，能夠快速高效的獲取卵母細(xì)胞。

當(dāng)然，實(shí)施本發(fā)明的任一產(chǎn)品并不一定需要同時(shí)達(dá)到以上所述的所有技術(shù)效果。

附圖說明

此處所說明的附圖用來提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本發(fā)明的一部分，本發(fā)明的示意性實(shí)施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：

圖1是本發(fā)明實(shí)施例3中26胚齡鴨胚卵巢分離提取的卵母細(xì)胞混懸液，200倍放大，白色箭頭指著的為卵母細(xì)胞；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例3中培養(yǎng)1d后卵母細(xì)胞懸液，200倍放大，白色箭頭指著的為卵母細(xì)胞；

圖3是本發(fā)明對(duì)比例1中性成熟蛋鴨卵巢分離提取的卵母細(xì)胞混懸液，200倍放大，白色箭頭指著的為卵母細(xì)胞，圖中橢圓形細(xì)胞為鴨血紅細(xì)胞。

具體實(shí)施方式

以下將配合實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方式，藉此對(duì)本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù)手段來解決技術(shù)問題并達(dá)成技術(shù)功效的實(shí)現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實(shí)施。

本發(fā)明公開了一種基于鴨胚的卵母細(xì)胞的分離提取方法，包括以下步驟：

步驟1、選取24-26天胚齡的鴨胚的卵巢組織4-6個(gè)，將卵巢組織置于滅菌pbs中，用眼科剪將卵巢組織剪碎；選取鴨胚分離卵巢，收集的卵母細(xì)胞不僅濃度大，并且都為未成熟階段的卵母細(xì)胞，便于研究蛋鴨卵母細(xì)胞成熟機(jī)制；

步驟2、在剪碎的卵巢組織碎片中加入混合酶消化液(每10ml消化液中含有膠原蛋白酶ⅱ，蛋白酶，透明質(zhì)酸酶各3-5mg)，將卵巢組織碎片和混合酶消化液置于細(xì)口消化瓶中，于搖床上消化45-60min，37℃，170-190r/min；本發(fā)明選擇膠原蛋白酶ⅱ，蛋白酶，透明質(zhì)酸酶這3種酶消化卵巢，因?yàn)槁殉步Y(jié)構(gòu)復(fù)雜，卵泡外包覆著結(jié)締組織層，卵母細(xì)胞由內(nèi)到外有顆粒細(xì)胞層，卵泡膜層，膠原酶能很好的消化結(jié)締組織，而蛋白酶對(duì)上皮組織效果較好，透明質(zhì)酸酶能降解細(xì)胞與細(xì)胞之間的蛋白多糖；

步驟3、用移液槍吹打卵巢組織碎片，加入體積濃度為10％的胎牛血清終止消化，200目細(xì)胞篩網(wǎng)過濾；

步驟4、收集濾液，在轉(zhuǎn)速為1000-1500r/min的條件下進(jìn)行離心處理3-4min；棄濾液，在沉淀的細(xì)胞中加細(xì)胞培養(yǎng)基，移液器輕柔吹打20-30次，使細(xì)胞懸?。话凑?×10⁴cell/ml濃度鋪板培養(yǎng)皿；分離提取得到基于鴨胚的卵母細(xì)胞；鋪板培養(yǎng)皿的細(xì)胞濃度高于1×10⁴cell/ml時(shí)，細(xì)胞懸液中易貼壁細(xì)胞之間相互作用，促進(jìn)增殖分化，貼壁，會(huì)影響卵母細(xì)胞顯微鏡下的篩選。

實(shí)施例1

一種基于鴨胚的卵母細(xì)胞的分離提取方法，包括以下步驟：

步驟1、選取25胚齡的鴨胚的卵巢組織4個(gè)，將卵巢組織置于滅菌pbs中，用眼科剪將卵巢組織剪碎；

步驟2、在剪碎的卵巢組織碎片中加入混合酶消化液(每10ml消化液中含有膠原蛋白酶ⅱ，蛋白酶，透明質(zhì)酸酶各5mg)，將卵巢組織碎片和混合酶消化液置于細(xì)口消化瓶中，于搖床上消化45min，37℃，190r/min；

步驟3、用移液槍吹打卵巢組織碎片，加入10％胎牛血清終止消化，200目細(xì)胞篩網(wǎng)過濾；

步驟4、收集濾液，在轉(zhuǎn)速為1200r/min的條件下進(jìn)行離心處理3.5min；棄濾液，在沉淀的細(xì)胞中加細(xì)胞培養(yǎng)基，移液器輕柔吹打30次，使細(xì)胞懸?。话凑?×10⁴cell/ml濃度鋪板培養(yǎng)皿；分離提取得到基于鴨胚的卵母細(xì)胞。

本實(shí)施例1得到比較純的單一卵母細(xì)胞，卵母細(xì)胞-顆粒細(xì)胞復(fù)合物很少，低濃度的細(xì)胞鋪板阻礙了卵泡膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的增殖分化，有利于卵母細(xì)胞顯微鏡下篩選，并且獲取的卵母細(xì)胞都是未成熟的卵母細(xì)胞，便于研究家禽卵母細(xì)胞成熟機(jī)制。

實(shí)施例2

一種基于鴨胚的卵母細(xì)胞的分離提取方法，包括以下步驟：

步驟1、選取24天胚齡的鴨胚的卵巢組織6個(gè)，將卵巢組織置于滅菌pbs中，用眼科剪將卵巢組織剪碎；

步驟2、在剪碎的卵巢組織碎片中加入混合酶消化液(每10ml消化液中含有膠原蛋白酶ⅱ，蛋白酶，透明質(zhì)酸酶各4mg)，將卵巢組織碎片和混合酶消化液置于細(xì)口消化瓶中，于搖床上消化50min，37℃，170r/min；

步驟3、用移液槍吹打卵巢組織碎片，加入10％胎牛血清終止消化，200目細(xì)胞篩網(wǎng)過濾；

步驟4、收集濾液，在轉(zhuǎn)速為1500r/min的條件下進(jìn)行離心處理3min；棄濾液，在沉淀的細(xì)胞中加細(xì)胞培養(yǎng)基，移液器輕柔吹打30次，使細(xì)胞懸?。话凑?×10⁴cell/ml濃度鋪板培養(yǎng)皿；分離提取得到基于鴨胚的卵母細(xì)胞。

本實(shí)施例2得到比較純的單一卵母細(xì)胞，卵母細(xì)胞-顆粒細(xì)胞復(fù)合物很少，低濃度的細(xì)胞鋪板阻礙了卵泡膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的增殖分化，有利于卵母細(xì)胞顯微鏡下篩選，并且獲取的卵母細(xì)胞都是未成熟的卵母細(xì)胞，便于研究家禽卵母細(xì)胞成熟機(jī)制。

實(shí)施例3

一種基于鴨胚的卵母細(xì)胞的分離提取方法，包括以下步驟：

步驟1、選取26天胚齡的鴨胚的卵巢組織5個(gè)，將卵巢組織置于滅菌pbs中，用眼科剪將卵巢組織剪碎；

步驟2、在剪碎的卵巢組織碎片中加入混合酶消化液(每10ml消化液中含有膠原蛋白酶ⅱ，蛋白酶，透明質(zhì)酸酶各3mg)，將卵巢組織碎片和混合酶消化液置于細(xì)口消化瓶中，于搖床上消化60min，37℃，180r/min；

步驟3、用移液槍吹打卵巢組織碎片，加入10％胎牛血清終止消化，200目細(xì)胞篩網(wǎng)過濾；

步驟4、收集濾液，在轉(zhuǎn)速為1000r/min的條件下進(jìn)行離心處理4min；棄濾液，在沉淀的細(xì)胞中加細(xì)胞培養(yǎng)基，移液器輕柔吹打20次，使細(xì)胞懸??；按照1×10⁴cell/ml濃度鋪板培養(yǎng)皿；分離提取得到基于鴨胚的卵母細(xì)胞。

本實(shí)施例3成功建立了鴨胚提取分離卵母細(xì)胞的方法，見圖1。通過次方法得到比較純的單一卵母細(xì)胞懸液，幾乎沒有血紅細(xì)胞影響顯微鏡下的視野。選取1×10⁴cell/ml低濃度的細(xì)胞量鋪板見圖2，能阻礙了卵母細(xì)胞懸液中卵泡膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞等易貼壁細(xì)胞的增殖分化和貼壁速度，有利于卵母細(xì)胞顯微鏡下篩選，便于后續(xù)研究家禽卵母細(xì)胞成熟機(jī)制。

對(duì)比例1

步驟1、選取性成熟蛋鴨2只，解剖取其卵巢組織，剪去卵泡；將剩余的卵巢組織置于滅菌pbs中，用眼科剪將卵巢組織剪碎；

步驟2、在剪碎的卵巢組織碎片中加入10ml混合酶消化液(每10ml消化液中含有膠原蛋白酶ⅱ，蛋白酶，透明質(zhì)酸酶各3mg)，將卵巢組織碎片和混合酶消化液置于細(xì)口消化瓶中，于搖床上消化45min，37℃，180r/min；

步驟3、用移液槍吹打卵巢組織碎片，100目細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，收集濾液并終止消化；

步驟4、收集的濾液，在轉(zhuǎn)速為1000r/min的條件下進(jìn)行離心處理4min；棄濾液，在沉淀細(xì)胞中加入含有胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，移液器輕柔吹打20次，使細(xì)胞懸浮，將細(xì)胞懸浮液鋪板于9cm培養(yǎng)皿；

步驟5、過濾后的卵巢組織碎片加入新鮮的混合酶消化液，置于細(xì)口消化瓶中，于搖床上消化30min，37℃，180r/min；

步驟6、重復(fù)步驟3和4。

本對(duì)比例1為性成熟蛋鴨卵巢分離提取卵母細(xì)胞懸液的方法，見圖3。與實(shí)施例3相比較，性成熟蛋鴨解剖分離卵巢組織方法比鴨胚解剖復(fù)雜，費(fèi)時(shí)，并且成年鴨沒有鴨胚經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。由于發(fā)育成熟的卵巢具有豐富的血管，成熟卵泡中含有卵黃質(zhì)，收集得到的卵母細(xì)胞混懸液中還有大量的血細(xì)胞和卵黃，影響卵母細(xì)胞顯微鏡下觀察和篩選。

上述說明示出并描述了發(fā)明的若干優(yōu)選實(shí)施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對(duì)其他實(shí)施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識(shí)進(jìn)行改動(dòng)。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動(dòng)和變化不脫離發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。