本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及新的分離自海水的嗜氣芽孢桿菌，其經(jīng)過發(fā)酵后具有防治根結(jié)線蟲的作用。
背景技術(shù)：
嗜氣芽孢桿菌（bacillusaerophilus）多數(shù)是從海洋中分離得到的，不同的菌株具有不同的性質(zhì)，例如，中國專利申請(qǐng)201410168127公開一種嗜氣芽孢桿菌，其保藏號(hào)為cgmccno.8840，用于降解石油烴，提高治理海洋石油污染的效率；又如，中國專利申請(qǐng)201510314671公開一種嗜氣芽孢桿菌fe2，其保藏號(hào)為cgmccno.10662，其發(fā)酵上清液可完全抑制黃曲霉素的產(chǎn)生，用于飼料、糧食、大田作物等的黃曲霉素污染的有效防控。
植物病原線蟲對(duì)農(nóng)作物的危害大，常造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前根結(jié)線蟲的防治方法包括輪作防病、抗線蟲品種培育、化學(xué)防治和生物防治等。其中，輪作防病被廣泛使用，但對(duì)一些特殊經(jīng)濟(jì)作物或特定地區(qū)無法達(dá)到合理輪作的要求，具有較大的局限性。常規(guī)抗病育種因研究進(jìn)展緩慢而不被大家重視。由于化學(xué)殺線蟲藥劑的使用可以起到立竿見影的預(yù)期效果而被大家廣泛使用，但化學(xué)藥劑的長期使用帶來了一系列的副作用，如藥劑殘留造成環(huán)境污染、次要病害猖獗發(fā)生、抗性喪失等，正逐步被限制使用。
目前還沒有發(fā)現(xiàn)嗜氣芽孢桿菌（bacillusaerophilus）能用于防治根結(jié)線蟲對(duì)農(nóng)作物的為害。本發(fā)明人憑借長期研究積累的經(jīng)驗(yàn)，幸運(yùn)地分離到了一株新的嗜氣芽孢桿菌（bacillusaerophilus），發(fā)現(xiàn)其經(jīng)過發(fā)酵后具有防治根結(jié)線蟲的作用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種新的嗜氣芽孢桿菌（bacillusaerophilus）。另外，本發(fā)明還提供了該菌株的16srrna基因片段、發(fā)酵液、發(fā)酵方法以及防治根結(jié)線蟲的應(yīng)用等。
具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了嗜氣芽孢桿菌（bacillusaerophilus）zdxc-01，其保藏號(hào)為cgmccno.14104。該菌株分離自海水，已于2017年5月5日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（簡(jiǎn)稱cgmcc，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所），其菌體為桿狀，大小為（0.2~0.3）μm×（1.0~1.7）μm，能運(yùn)動(dòng)，產(chǎn)芽孢，革蘭氏染色呈陽性。在lb培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)48h，菌落呈乳白色，凸起，邊緣規(guī)則，不透明，菌落直徑大小為1~1.5mm。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了該菌株，尤其是其發(fā)酵液，具有防治線蟲的作用。
在第二方面，本發(fā)明提供了嗜氣芽孢桿菌（bacillusaerophilus）zdxc-01的16srrna基因片段，其核苷酸序列如seqidno：1所示。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了新的菌株（即，本發(fā)明第一方面的嗜氣芽孢桿菌（bacillusaerophilus）zdxc-01），從來源、鏡檢和培養(yǎng)等角度來看，其為嗜氣芽孢桿菌（bacillusaerophilus），通過對(duì)16srrna基因測(cè)序也從分子生物學(xué)角度鑒定了該菌株。
在第三方面，本發(fā)明提供了嗜氣芽孢桿菌（bacillusaerophilus）zdxc-01的發(fā)酵培養(yǎng)基，其配方為玉米粉10g，豆粕粉10g，可溶性淀粉5g，磷酸二氫鉀1g，氯化鈉5g，蒸餾水定容至1000ml，ph為7.2-7.4。本發(fā)明第三方面的發(fā)酵培養(yǎng)基中的成分可以等比例地放大或縮小，例如其配方為玉米粉1g，豆粕粉1g，可溶性淀粉0.5g，磷酸二氫鉀0.1g，氯化鈉0.5g，蒸餾水定容至100ml，ph為7.2-7.4，這些也都在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了使用本發(fā)明第三方面的發(fā)酵培養(yǎng)基可以培養(yǎng)本發(fā)明第一方面的嗜氣芽孢桿菌（bacillusaerophilus）zdxc-01，而且培養(yǎng)獲得的發(fā)酵液具有防治根結(jié)線蟲的作用。因此，在第四方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第三方面的發(fā)酵培養(yǎng)基在培養(yǎng)本發(fā)明第一方面的嗜氣芽孢桿菌（bacillusaerophilus）zdxc-01中的應(yīng)用。
相應(yīng)地，在第五方面，本發(fā)明提供了嗜氣芽孢桿菌（bacillusaerophilus）zdxc-01的發(fā)酵液，其通過將本發(fā)明第一方面的嗜氣芽孢桿菌（bacillusaerophilus）zdxc-01接種于本發(fā)明第三方面的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)而得。
另外，在第六方面，本發(fā)明提供了嗜氣芽孢桿菌（bacillusaerophilus）zdxc-01的發(fā)酵液的制備方法，其是將本發(fā)明第一方面的嗜氣芽孢桿菌（bacillusaerophilus）zdxc-01接種于本發(fā)明第三方面的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)。
優(yōu)選在本發(fā)明第五或第六方面中，所述培養(yǎng)的條件是28-30℃（如，30℃）下振蕩培養(yǎng)3-5天。振蕩的條件是100-300rpm，優(yōu)選是150-250rpm，如200rpm。
也優(yōu)選在本發(fā)明第五或第六方面中，本發(fā)明第一方面的嗜氣芽孢桿菌（bacillusaerophilus）zdxc-01是經(jīng)過活化和/或種子培養(yǎng)的，優(yōu)選先活化然后種子培養(yǎng)以擴(kuò)大菌量。優(yōu)選其中，用2216e培養(yǎng)基或lb培養(yǎng)基進(jìn)行活化和/或種子培養(yǎng)的。通常活化是在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行的，其中培養(yǎng)基每1000ml另加瓊脂15-20g，種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)是在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行，其中無需加瓊脂。
在第七方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第一方面的嗜氣芽孢桿菌（bacillusaerophilus）zdxc-01或本發(fā)明第五方面的發(fā)酵液在防治農(nóng)作物根結(jié)線蟲中的應(yīng)用。
相應(yīng)地，在第八方面，本發(fā)明提供了防治農(nóng)作物根結(jié)線蟲的方法，向農(nóng)作物或種植其的土壤施用本發(fā)明第五方面的發(fā)酵液。
優(yōu)選在本發(fā)明第七或第八方面中，農(nóng)作物是番茄。
在第九方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第二方面的16srrna基因片段在鑒定本發(fā)明第一方面的嗜氣芽孢桿菌（bacillusaerophilus）zdxc-01中的應(yīng)用。通過測(cè)定待測(cè)菌株的16srrna基因的序列，將測(cè)序結(jié)果與本發(fā)明第二方面的16srrna基因片段相比較，由此可以進(jìn)行鑒定。
本發(fā)明的有益效果在于，發(fā)現(xiàn)了具有防治根結(jié)線蟲作用的嗜氣芽孢桿菌zdxc-01或其發(fā)酵液，該菌株生長速度快、產(chǎn)孢量大、抗逆性強(qiáng)，在植物根部能夠快速大量定殖，其防治線蟲的活性可以有效替代現(xiàn)有的化學(xué)農(nóng)藥，具有良好的應(yīng)用前景。
為了便于理解，以下將通過具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說明書的論述，本發(fā)明的許多變化、改變對(duì)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是顯而易見的。
另外，本發(fā)明引用了公開文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本文進(jìn)行參考，就好像它們的全文已經(jīng)在本文中重復(fù)敘述過一樣。
具體實(shí)施方式
以下通過實(shí)施例進(jìn)一步示例性地說明本發(fā)明。如未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉的，包括可以商業(yè)化委托鑒定，所用的器械和試劑也均可通過商業(yè)渠道購買。
實(shí)施例1嗜氣芽孢桿菌（bacillusaerophilus）zdxc-01的發(fā)現(xiàn)及鑒定
本發(fā)明人從海水中用稀釋涂布法分離單克隆菌株，具體分離方法為：稱取1ml海水樣品溶于99ml無菌水中，振蕩使其充分混合，即獲得10-2海水稀釋液。取1ml上述海水稀釋液至9ml無菌水中，搖勻即獲得10-3海水稀釋液。相同的方法配置10-4、10-5、10-6的海水稀釋液。取10-4、10-5、10-6的海水稀釋液100μl于加瓊脂的2216e培養(yǎng)基平板中，用涂布器將稀釋液均勻涂布，平板置于28-30℃的恒溫箱中培養(yǎng)24h，將培養(yǎng)基上的不同形態(tài)的菌落在空白2216e培養(yǎng)基平板中進(jìn)行劃線，純化獲得的菌株，并分別編號(hào)保存。其中，一菌株鏡檢特性為，菌體桿狀，大小為（0.2~0.3）μm×（1.0~1.7）μm，能運(yùn)動(dòng)，產(chǎn)芽孢，革蘭氏染色呈陽性；該菌株在lb培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)48h，菌落呈乳白色，凸起，邊緣規(guī)則，不透明，菌落直徑大小為1~1.5mm；對(duì)該菌株的16srrna基因測(cè)序，顯示其16srrna基因片段的核苷酸序列如seqidno：1所示。綜合鑒定結(jié)果，該菌株是現(xiàn)有技術(shù)未被公開的菌株，被命名為嗜氣芽孢桿菌（bacillusaerophilus）zdxc-01，于2017年5月5日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（簡(jiǎn)稱cgmcc，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所），保藏號(hào)為cgmccno.14104。
實(shí)施例2抗根結(jié)線蟲發(fā)酵液的制備
大量制備嗜氣芽孢桿菌zdxc-01的發(fā)酵過程如下：
（1）將保存在試管斜面中的嗜氣芽孢桿菌zdxc-01劃線于加瓊脂的2216e培養(yǎng)基或lb培養(yǎng)基進(jìn)行活化，置于28-30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天；
（2）將步驟（1）的嗜氣芽孢桿菌zdxc-01的孢子移植到2216e（酵母提取物1g，蛋白胨5g，過濾后的海水1000ml，ph7.2-7.4）或lb液體培養(yǎng)基（胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，蒸餾水1000ml，ph調(diào)至7.2-7.4）中，28-30℃搖床振蕩培養(yǎng)3天，得到種子液；
（3）按10%比例（體積比）將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基（玉米粉10g，豆粕粉10g，可溶性淀粉5g，磷酸二氫鉀1g，氯化鈉5g，蒸餾水1000ml，ph7.2-7.4）中，28-30℃下振蕩培養(yǎng)3-5天，得到嗜氣芽孢桿菌zdxc-01的抗根結(jié)線蟲發(fā)酵液。
實(shí)施例3抗番茄根結(jié)線蟲的室內(nèi)離體試驗(yàn)
1.1供試藥劑的準(zhǔn)備
按照實(shí)施例2新鮮制備的嗜氣芽孢桿菌zdxc-01的抗根結(jié)線蟲發(fā)酵液。
1.2供試線蟲的準(zhǔn)備
供試線蟲由番茄保護(hù)地的番茄病根上獲取。取番茄病根，用蒸餾水清洗表面土壤后，用解剖針挑取根結(jié)內(nèi)部卵塊，放入裝有無菌水的培養(yǎng)皿中，28℃靜置孵化24h；收集孵化的根結(jié)線蟲二齡幼蟲，于三角瓶中輕輕混勻，獲得線蟲懸液（約100條/ml），4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)
以采集的番茄根結(jié)線蟲為供試線蟲，采用24孔板液體浸漬法進(jìn)行抗根結(jié)線蟲活性室內(nèi)測(cè)定。在24孔板中分別加入100μl線蟲懸液、100μl抗根結(jié)線蟲發(fā)酵液和300μl無菌水，用移液器輕輕吹打均勻，試驗(yàn)設(shè)置三個(gè)重復(fù)，以空白發(fā)酵培養(yǎng)基代替發(fā)酵液作對(duì)照。于28℃放置24h后在倒置顯微鏡下觀察，蟲體僵直或卷曲的即視為擊倒，計(jì)算線蟲校正擊倒率。向24孔板中加入600μl無菌水，觀察恢復(fù)情況，不能恢復(fù)活性的記為死亡，計(jì)算校正死亡率。
1.4計(jì)算方法
校正擊倒率(%)=100%×(處理擊倒率-對(duì)照擊倒率)/(1-對(duì)照擊倒率)
校正死亡率(%)=（1-恢復(fù)率）×校正擊倒率
1.5試驗(yàn)結(jié)果
試驗(yàn)結(jié)果表明，嗜氣芽孢桿菌zdxc-01發(fā)酵液對(duì)根結(jié)線蟲的校正死亡率平均為78.3%。
實(shí)施例4測(cè)定番茄根結(jié)線蟲防效的盆栽試驗(yàn)
1.1供試藥劑
按照實(shí)施例2新鮮制備的嗜氣芽孢桿菌zdxc-01的抗根結(jié)線蟲發(fā)酵液；市售的1.8%阿維菌素乳油（作為陽性對(duì)照）。
1.2供試作物與防治對(duì)象：
供試作物：番茄，品種為“大明星”
防治對(duì)象：番茄根結(jié)線蟲
1.3供試土壤
供試沙壤土經(jīng)100℃高溫滅菌30min，經(jīng)檢查無線蟲存活后，向其中加入線蟲懸液，使土壤中根結(jié)線蟲濃度為5條/10g。加入線蟲懸液后的土壤稱為帶線土，每個(gè)花盆裝帶線土2kg。
1.4試驗(yàn)設(shè)計(jì)及安排
將番茄種子用1%次氯酸鈉表面消毒10min后，用無菌水沖洗3遍，于培養(yǎng)皿中催芽后播種。待番茄幼苗達(dá)到5葉齡時(shí)，將長勢(shì)一致的苗子移栽到裝有帶線土的花盆中，每盆3株。試驗(yàn)共有4處理，①加入50ml抗根結(jié)線蟲發(fā)酵液；②加入100ml抗根結(jié)線蟲發(fā)酵液；③加入50ml稀釋2000倍的1.8%阿維菌素乳油；④對(duì)照（加入100ml發(fā)酵培養(yǎng)基）。每個(gè)處理3盆番茄幼苗，試驗(yàn)重復(fù)3次。
1.5試驗(yàn)調(diào)查及計(jì)算方法
試驗(yàn)30天及45天后檢查試驗(yàn)結(jié)果。檢查時(shí)將番茄苗與土全部取出，用流水緩緩沖洗根部，直至將泥土全部沖掉，每株番茄幼苗根部分東、西、南、北、中五個(gè)方位隨機(jī)采樣，每個(gè)方位選取2個(gè)完整根，共計(jì)10個(gè)。統(tǒng)計(jì)番茄根部根瘤發(fā)生的嚴(yán)重程度，進(jìn)行病情分級(jí)，計(jì)算防治效果。
番茄根結(jié)線蟲病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：
0級(jí)：無可見根瘤或卵塊；
1級(jí)：根瘤長度占總根長度的1-10%；
3級(jí)：根瘤長度占總根長度的11-30%；
5級(jí)：根瘤長度占總根長度的31-50%；
7級(jí)：根瘤長度占總根長度的51-70%；
9級(jí)：根瘤長度占總根長度的71%以上；
按下列公式計(jì)算病情指數(shù)和防治效果：
病情指數(shù)=100×(∑(各病級(jí)植株數(shù)×病級(jí)數(shù)值))/(調(diào)查總數(shù)值×9)
防治效果(%)=100%×(空白對(duì)照區(qū)病指-處理區(qū)病指)/空白對(duì)照區(qū)病指
2.結(jié)果
供試藥劑對(duì)番茄根結(jié)線蟲的防治效果如表1所示。
表1嗜氣芽孢桿菌zdxc-01抗根結(jié)線蟲發(fā)酵液對(duì)番茄根結(jié)線蟲的盆栽試驗(yàn)
試驗(yàn)結(jié)果表明，嗜氣芽孢桿菌zdxc-01抗根結(jié)線蟲發(fā)酵液對(duì)番茄根結(jié)線蟲有可持續(xù)的較好防治效果，可以代替阿維菌素使用。番茄幼苗移栽30天后，嗜氣芽孢桿菌zdxc-01抗根結(jié)線蟲發(fā)酵液對(duì)番茄根結(jié)線蟲的防效為65.24-69.52%，嗜氣芽孢桿菌zdxc-01發(fā)酵液50ml與阿維菌素乳油的處理在防效上已經(jīng)無顯著性差異。番茄幼苗移栽45天后，嗜氣芽孢桿菌zdxc-01抗根結(jié)線蟲發(fā)酵液100ml的防效為74.12%，嗜氣芽孢桿菌zdxc-01抗根結(jié)線蟲發(fā)酵液50ml與阿維菌素乳油的處理仍然無顯著性差異。
序列表
<110>青島中達(dá)農(nóng)業(yè)科技有限公司
<120>嗜氣芽孢桿菌及其殺根結(jié)線蟲應(yīng)用
<130>cn
<160>1
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>1509
<212>dna
<213>bacillusaerophilus
<400>1
ctcaggacgaacgctggcggcgtggctaatacatgcaagtcgagcggacagaagggagct60
tgctcccggatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagact120
gggataactccgggaaaccggagctaataccggatagttccttgaaccgcatggttcaag180
gatgaaagacggtttcggctgtcacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggt240
gaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacac300
tgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatg360
gacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctc420
tgttgttagggaagaacaagtgcaagagtaactgcttgcaccttgacggtacctaaccag480
aaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtcc540
ggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccg600
gctcaaccggggagggtcattggaaactgggaaacttgagtgcagaagaggagagtggaa660
ttccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgact720
ctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagatacc780
ctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtg840
ctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaa900
ggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaa960
gaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaaccctagagatagggctttcccttcgggg1020
acagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagt1080
cccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtg1140
actgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatga1200
cctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggctgcgagaccgcaaggtttag1260
ccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagct1320
ggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtaca1380
caccgcccgtcacaccacgagagtttgcaacacccgaagtcggtgaggtaacctttatgg1440
agccagccgccgaaggtggggcagatgattggggtgaagtcgtaacaaggtagccgtatc1500
ggaaggtgc1509
序列表
<110>青島中達(dá)農(nóng)業(yè)科技有限公司
<120>嗜氣芽孢桿菌及其殺根結(jié)線蟲應(yīng)用
<130>cn
<160>1
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>1509
<212>dna
<213>bacillusaerophilus
<400>1
ctcaggacgaacgctggcggcgtggctaatacatgcaagtcgagcggacagaagggagct60
tgctcccggatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagact120
gggataactccgggaaaccggagctaataccggatagttccttgaaccgcatggttcaag180
gatgaaagacggtttcggctgtcacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggt240
gaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacac300
tgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatg360
gacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctc420
tgttgttagggaagaacaagtgcaagagtaactgcttgcaccttgacggtacctaaccag480
aaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtcc540
ggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccg600
gctcaaccggggagggtcattggaaactgggaaacttgagtgcagaagaggagagtggaa660
ttccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgact720
ctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagatacc780
ctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtg840
ctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaa900
ggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaa960
gaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaaccctagagatagggctttcccttcgggg1020
acagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagt1080
cccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtg1140
actgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatga1200
cctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggctgcgagaccgcaaggtttag1260
ccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagct1320
ggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtaca1380
caccgcccgtcacaccacgagagtttgcaacacccgaagtcggtgaggtaacctttatgg1440
agccagccgccgaaggtggggcagatgattggggtgaagtcgtaacaaggtagccgtatc1500
ggaaggtgc1509