本發(fā)明屬于食品領(lǐng)域，具體地涉及一種南極磷蝦貯藏過程中導(dǎo)致其品質(zhì)劣化的優(yōu)勢菌群確定方法

背景技術(shù)：

南極磷蝦因其巨大的生物量、潛在的漁業(yè)資源以及在南極生態(tài)系統(tǒng)中的特殊地位而日益受到人們的關(guān)注。南極磷蝦含有營養(yǎng)價值極其豐富的蛋白質(zhì)、磷脂、不飽和脂肪酸等成分，在水產(chǎn)加工領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。受船舶條件、裝備以及加工技術(shù)等的限制，目前中國作業(yè)船捕撈的南極磷蝦原料，很大一部分在船上進(jìn)行凍結(jié)、保藏，之后運輸?shù)疥懙剡M(jìn)行二次加工。在此過程中，南極磷蝦在微生物和自身蛋白酶的作用下容易發(fā)生自溶，黑化，嚴(yán)重影響了南極磷蝦的品質(zhì)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種南極磷蝦貯藏過程中導(dǎo)致其品質(zhì)劣化的優(yōu)勢菌群的確定方法，所述方法考察了南極磷蝦在不同溫度(a：0℃；b：4℃；c：16℃；d：25℃)貯藏條件下的微生物多樣性，確定了導(dǎo)致其品質(zhì)劣化的優(yōu)勢菌群，為南極磷蝦加工的質(zhì)量控制及后期的保鮮技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。

本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的

一種南極磷蝦貯藏過程中導(dǎo)致其品質(zhì)劣化的優(yōu)勢菌群確定方法，所述方法包括如下步驟：

從-80℃取出南極磷蝦樣品，解凍后用無菌水沖洗磷蝦表面，然后分別置于0℃、4℃、16℃和25℃培養(yǎng)箱；24h后進(jìn)行高通量測序；

首先提取樣品總dna，分別用細(xì)菌引物v3/v4和真菌引物its1/its2擴(kuò)增，獲得條帶后上機測序；miseq測序序列中含有barcode序列，以及測序時加入的引物和接頭序列；首先需要去除引物接頭序列，再根據(jù)pereads之間的overlap關(guān)系，將成對的reads拼接成一條序列，然后按照barcode標(biāo)簽序列識別并區(qū)分樣品得到各樣本數(shù)據(jù)，最后對各樣本數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控過濾，得到各樣本有效數(shù)據(jù)。在otu聚類結(jié)果的基礎(chǔ)上，獲取每一個otu聚類中的代表性序列；計算ace/chao/shannon/simpson/coverage等物種多樣性指數(shù)，并制作所有樣品ace/chao/shannon/simpson/richness指數(shù)的箱形圖；基于物種分類分析，繪制物種分類條形圖，物種豐度餅圖，物種豐度熱圖；根據(jù)對已有測序微生物基因組的基因功能的構(gòu)成分析結(jié)果和測序獲得的物種構(gòu)成，推測樣本中的功能分類的構(gòu)成；根據(jù)功能分類豐度，繪制功能分類條形圖、豐度熱圖、豐度柱狀圖、豐度聚類樹圖。

進(jìn)一步，所述的細(xì)菌引物v3-v4

序列f：cctacgggnggcwgcag；序列r：gactachvgggtatctaatcc。所述的真菌引物its1-its2序列f：cttggtcatttagaggaagtaa；序列r：gctgcgttcttcatcgatgc。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果

本發(fā)明從不同溫度(a：0℃；b：4℃；c：16℃；d：25℃)貯藏條件下分析南極磷蝦中微生物多樣性，確定導(dǎo)致其品質(zhì)劣化的優(yōu)勢菌群。為南極磷蝦相關(guān)的食品加工條件提供參考依據(jù)。

本發(fā)明使用高通量測序的檢測南極磷蝦樣品中的微生物多樣性和豐度均顯著高于平板培養(yǎng)方法。

附圖說明

圖1是細(xì)菌多樣性chao指數(shù)箱形圖a：0℃(24h)；b：4℃(24h)；c：16℃(24h)；d：25℃(24h)；

圖2是細(xì)菌多樣性simpson指數(shù)箱形圖a：0℃(24h)；b：4℃(24h)；c：16℃(24h)；d：25℃(24h)；

圖3是不同貯存條件下細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成分布柱狀圖a：0℃(24h)；b：4℃(24h)；c：16℃(24h)；d：25℃(24h)；

圖4是不同貯存條件下細(xì)菌樣本與物種關(guān)系圖a：0℃(24h)；b：4℃(24h)；c：16℃(24h)；d：25℃(24h)；

圖5是不同貯存條件下細(xì)菌物種豐度熱圖a：0℃(24h)；b：4℃(24h)；c：16℃(24h)；d：25℃(24h)；

圖6是不同貯存條件下細(xì)菌代謝通路差異蛋白豐度熱圖a：0℃(24h)；b：4℃(24h)；c：16℃(24h)；d：25℃(24h)；

圖7是真菌多樣性chao指數(shù)箱形圖a：0℃(24h)；b：4℃(24h)；c：16℃(24h)；d：25℃(24h)；

圖8是真菌多樣性simpson指數(shù)箱形圖a：0℃(24h)；b：4℃(24h)；c：16℃(24h)；d：25℃(24h)；

圖9是不同貯存條件下真菌群落結(jié)構(gòu)組成分布柱狀圖a：0℃(24h)；b：4℃(24h)；c：16℃(24h)；d：25℃(24h)；

圖10是不同貯存條件下真菌樣本與物種關(guān)系圖a：0℃(24h)；b：4℃(24h)；c：16℃(24h)；d：25℃(24h)；

圖11是不同貯存條件下真菌物種豐度熱圖a：0℃(24h)；b：4℃(24h)；c：16℃(24h)；d：25℃(24h)；

圖12是不同貯存條件下微生物平板培養(yǎng)群落結(jié)構(gòu)組成分布柱狀圖a：0℃(24h)；b：4℃(24h)；c：16℃(24h)；d：25℃(24h)；

圖13是不同貯存條件下微生物總菌落數(shù)柱狀圖a：0℃(24h)；b：4℃(24h)；c：16℃(24h)；d：25℃(24h)；

圖14是優(yōu)勢菌群的蛋白酶活性平板示意圖。

具體實施方式

下面通過實施例結(jié)合附圖來對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步解釋，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受實施例任何形式上的限制。

實施例

實施例1

一種南極磷蝦貯藏過程中導(dǎo)致其品質(zhì)劣化的優(yōu)勢菌群確定方法，所述方法包括如下步驟：

南極磷蝦由遼漁集團(tuán)提供，為2015年10月在南極海域捕獲，并在-80℃條件下冷凍保存。

從-80℃取出南極磷蝦樣品，解凍后用無菌水沖洗磷蝦表面，各取數(shù)只分別置于0℃、4℃、16℃和25℃培養(yǎng)箱；24h后各取樣品進(jìn)行高通量測序。首先提取樣品總dna，分別用細(xì)菌引物v3/v4和真菌引物its1/its2擴(kuò)增，獲得條帶后上機測序；miseq測序序列中含有barcode序列，以及測序時加入的引物和接頭序列；首先需要去除引物接頭序列，再根據(jù)pereads之間的overlap關(guān)系，將成對的reads拼接成一條序列，然后按照barcode標(biāo)簽序列識別并區(qū)分樣品得到各樣本數(shù)據(jù)，最后對各樣本數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控過濾，得到各樣本有效數(shù)據(jù)。在otu聚類結(jié)果的基礎(chǔ)上，獲取每一個otu聚類中的代表性序列；計算ace/chao/shannon/simpson/coverage等物種多樣性指數(shù)，并制作所有樣品ace/chao/shannon/simpson/richness指數(shù)的箱形圖；基于物種分類分析，繪制物種分類條形圖，物種豐度餅圖，物種豐度熱圖；根據(jù)對已有測序微生物基因組的基因功能的構(gòu)成分析結(jié)果和測序獲得的物種構(gòu)成，推測樣本中的功能分類的構(gòu)成；根據(jù)功能分類豐度，繪制功能分類條形圖、豐度熱圖、豐度柱狀圖、豐度聚類樹圖。

所述的細(xì)菌引物v3-v4序列為

序列f：cctacgggnggcwgcag；

序列r：gactachvgggtatctaatcc。

所述的真菌引物its1-its2序列為

its1f序列f：cttggtcatttagaggaagtaa；

its2r序列r：gctgcgttcttcatcgatgc。

結(jié)果如下：

1、16srdna(細(xì)菌)高通量測序結(jié)果分析

1.1細(xì)菌多樣性指數(shù)分析

群落生態(tài)學(xué)中研究微生物多樣性，通過單樣品的多樣性分析，可以反映微生物群落的豐度和多樣性，包括一系列統(tǒng)計學(xué)分析指數(shù)(chao、ace、simpson、coverage)估計環(huán)境群落的物種豐度和多樣性。

在細(xì)菌多樣性的指數(shù)分析中，chao指數(shù)常用來估計物種總數(shù)，數(shù)值越大，數(shù)量越多。由圖1結(jié)果可知，南極磷蝦樣品在4℃貯存24h時，細(xì)菌總數(shù)最多，0℃次之。這應(yīng)該與南極磷蝦的生存環(huán)境有關(guān)，低溫微生物數(shù)量較多。simpson指數(shù)通常用來定量描述一個區(qū)域的生物多樣性，simpson指數(shù)值越大，說明群落多樣性越低。由圖2結(jié)果可知，南極磷蝦樣品在4℃貯存24h時，細(xì)菌多樣性最低，0℃時細(xì)菌多樣性最高。結(jié)合chao指數(shù)結(jié)果，我們可推斷，由于南極的低溫環(huán)境，南極磷蝦體內(nèi)和體外細(xì)菌的數(shù)量和多樣性都更適于0℃-4℃生長和分布。

1.2.細(xì)菌結(jié)構(gòu)組成分析。

根據(jù)分類學(xué)分析結(jié)果，可以得知一個或多個樣品在各分類水平上的分類學(xué)比對情況。在結(jié)果中，包含了兩個信息:(1).樣品中含有何種微生物；(2).樣品中各微生物的序列數(shù)，即各微生物的相對豐度。因此，可以使用統(tǒng)計學(xué)的分析方法，觀測樣品在不同分類水平上的群落結(jié)構(gòu)。將多個樣品的群落結(jié)構(gòu)分析放在一起對比時，還可以觀測其變化情況。根據(jù)研究對象是單個或多個樣品，結(jié)果可能會以不同方式展示，通常使用較直觀的柱狀圖呈現(xiàn)。

由圖3結(jié)果可知，南極磷蝦在0℃貯存24h后，細(xì)菌中豐度較低的其它細(xì)菌(other)含量最高。表明在此條件下，雖然細(xì)菌多樣性比較高，但每種細(xì)菌的數(shù)量都很低，少量存在，但難以大量繁殖。除此之外，在0℃條件下，enterococcus(腸球菌)為第二大細(xì)菌組成，bacillus(芽孢桿菌)為第三大細(xì)菌組成；南極磷蝦在4℃貯存24h后，細(xì)菌組成發(fā)生了變化。bacillus(芽孢桿菌)成為含量最多的細(xì)菌，lactococcus(乳球菌)和enterococcus(腸球菌)次之；當(dāng)南極磷蝦的貯存溫度升至16℃和25℃時，優(yōu)勢菌群均為psychrobacter(嗜冷桿菌)，次優(yōu)勢菌分別為bacillus(芽孢桿菌)和enterococcus(腸球菌)。

上述不同貯存條件下南極磷蝦的細(xì)菌結(jié)構(gòu)組成結(jié)果表明，在0℃-4℃的低溫貯存環(huán)境中，enterococcus(腸球菌)和bacillus(芽孢桿菌)為優(yōu)勢菌群；當(dāng)貯存溫度上升至16℃-25℃時，psychrobacter(嗜冷桿菌)為優(yōu)勢菌群。

圖4更直觀地描述了樣本a、b、c、d與其對應(yīng)的優(yōu)勢菌群的共線性關(guān)系。右邊半圓表示樣本的物種豐度組成情況，左邊半圓表示在該分類水平下物種在不同樣本中的分布比例情況。

1.3細(xì)菌豐度熱圖。

細(xì)菌豐度熱圖，是用細(xì)菌豐度矩陣?yán)L制，圖中每一列代表一個樣本，行代表群落結(jié)構(gòu)，顏色塊代表相對物種豐度值，顏色越紅表示相對豐度越高，顏色越藍(lán)反之。另外熱圖對樣本做了聚類，樣本菌群分布越類似則樣本距離越近，在圖上方聚類樹中的位置越靠近。為了展示效果，只顯示豐度最高的前50個物種分類信息，剩余的物種分類合并成other，在圖上的上方。有顏色塊，來自同一組的樣本顏色相同。

由圖5可知，南極磷蝦樣品在16℃和25℃貯存時的樣本距離最近，說明在此條件下細(xì)菌菌群分布更相似。熱圖最上方，psychrobacter(嗜冷桿菌)、bacillus(芽孢桿菌)和enterococcus(腸球菌)的顏色最紅，說明這幾種細(xì)菌在南極磷蝦樣本中豐度最高。

1.4.細(xì)菌功能預(yù)測。

通過對已有測序微生物基因組的基因功能的構(gòu)成進(jìn)行分析后，我們可以通過16s測序獲得的物種構(gòu)成推測樣本中的功能基因的構(gòu)成，從而分析不同樣本和分組之間在功能上的差異。

由圖6的kegg(代謝通路)數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果可知，貯存在0℃的南極磷蝦樣品中與代謝功能正相關(guān)的基因最多，25℃貯存條件下，與代謝功能負(fù)相關(guān)的基因最多。在所有的代謝功能中，氨基酸代謝是四個樣品中相關(guān)基因含量最高的，其次是碳水化合物的代謝，說明南極磷蝦在貯存過程中發(fā)生的自溶及腐敗與其體內(nèi)及體外細(xì)菌的作用正相關(guān)。

2.its(真菌)高通量測序結(jié)果分析

2.1真菌多樣性指數(shù)分析

由圖7、圖8結(jié)果可知，與細(xì)菌的chao指數(shù)相似，南極磷蝦樣品在4℃貯存24h時，細(xì)菌總數(shù)最多，0℃、16℃、25℃差異不顯著。由simpson指數(shù)值表征的最高的真菌多樣性樣品也與細(xì)菌一致，0℃貯存的南極磷蝦樣品真菌多樣性最高，而其他溫度的樣品的多樣性差異也不顯著。表明受南極低溫環(huán)境的影響，細(xì)菌和真菌都趨向于低溫生長繁殖。

2.2.真菌結(jié)構(gòu)組成分析

由圖9結(jié)果可知，南極磷蝦在0℃貯存24h后，與細(xì)菌相似，真菌中豐度較低的其它真菌(other)含量最高。表明在此條件下，雖然真菌多樣性比較高，但每種細(xì)菌的數(shù)量都很低，少量存在，但難以大量繁殖。除此之外，在0℃條件下，unclassified(未知真菌)為第二大細(xì)菌組成，unclassifiedsaccharomycete(未知酵母菌)為第三大細(xì)菌組成；而其他三種貯存條件(4℃、16℃、25℃)下，南極磷蝦的優(yōu)勢真菌群均為unclassifiedsaccharomycete(未知酵母菌)，次優(yōu)勢菌為unclassified(未知真菌)。此結(jié)果表明，由于南極的特殊生境，南極磷蝦中仍存在大量的有待開發(fā)的未知真菌資源。

圖10更直觀地描述了樣本a、b、c、d與其對應(yīng)的優(yōu)勢菌群的共線性關(guān)系。右邊半圓表示樣本的物種豐度組成情況，左邊半圓表示在該分類水平下物種在不同樣本中的分布比例情況。

2.3.真菌豐度熱圖。

由圖11可知，南極磷蝦樣品在4℃和25℃貯存時的樣本距離最近，說明在此條件下真菌菌群分布更相似。熱圖最上方，unclassifiedsaccharomycete(未知酵母菌)和unclassified(未知真菌)顏色最紅，說明這兩種細(xì)菌在南極磷蝦樣本中豐度最高，與真菌結(jié)構(gòu)組成圖結(jié)果一致。

由于目前針對真菌的保守序列所對應(yīng)的功能數(shù)據(jù)庫還沒有建立，因此我們尚不能通過its序列來預(yù)測樣品中真菌的功能基因。

實施例2

南極磷蝦由遼漁集團(tuán)提供，為2015年10月在南極海域捕獲，并在-80℃條件下冷凍保存。

從-80℃冰箱取出小塊南極磷蝦樣品，解凍后用無菌水沖洗磷蝦表面，各取數(shù)只分別置于0℃、4℃、16℃和25℃培養(yǎng)箱。24h后各取三只用勻漿器研磨，無菌水稀釋，涂布，分別用1.3中的6種培養(yǎng)基在0℃、4℃、16℃和25℃培養(yǎng)。

所述的6種培養(yǎng)基：zobell2216e細(xì)菌培養(yǎng)基，penssaybroth細(xì)菌培養(yǎng)基，lb細(xì)菌培養(yǎng)基，sc放線菌培養(yǎng)基，emerson真菌培養(yǎng)基，sabouraud真菌培養(yǎng)基，invitrogen基因組dna提取試劑盒，2×taqpcrmastermix,酪素(國藥)。

收集不同培養(yǎng)條件下不同培養(yǎng)基的平板，統(tǒng)計可培養(yǎng)菌落數(shù)量。提取菌落基因組dna，分別用細(xì)菌和真菌的保守引物擴(kuò)增，將pcr產(chǎn)物送測序公司測序。

采用酪素平板法檢測優(yōu)勢菌群的蛋白酶活性。將酪素溶于ph8.0tris-hcl緩沖液中，加入2％瓊脂，高溫高壓滅菌，配制酪素平板。取可培養(yǎng)菌株的液體發(fā)酵液50ul加入已打孔的酪素平板，16℃培養(yǎng)48h。

在設(shè)置了不同的貯存條件將南極磷蝦樣品進(jìn)行高通量測序的同時，我們將平行樣品在不同的培養(yǎng)基中進(jìn)行了平板培養(yǎng)，實驗結(jié)果及分析如下。

從-80℃超低溫冰箱取出的磷蝦樣品呈粉紅的新鮮狀態(tài)，在0℃

貯存24h后，蝦頭輕微變綠；在4℃貯存24h后，蝦頭由綠色變微黑狀態(tài)；當(dāng)溫度升至16℃和25℃時，不止蝦頭已完全黑化，蝦體的顏色也逐漸加深。表明隨著貯存溫度的升高，南極磷蝦的品質(zhì)逐漸劣化。追朔其原因，其一是南極磷蝦自身蛋白質(zhì)含量高，組織內(nèi)存在大量的高活性的蛋白酶，自溶迅速，因此易于腐敗變質(zhì)。其二，南極磷蝦體表和體內(nèi)存在著來自南極海域的微生物，微生物的繁殖及產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物均容易導(dǎo)致磷蝦的品質(zhì)發(fā)生改變。

分別采用了lb、zobell2216e及penssaybroth三種細(xì)菌培養(yǎng)基，pda、eerson和sabouraud三種真菌培養(yǎng)基以及sc放線菌培養(yǎng)基對上述南極磷蝦樣品的勻漿液進(jìn)行平板涂布，分別置于4℃、16℃和25℃培養(yǎng)。實驗結(jié)果如下：

由圖12和圖13可知，不同貯存條件的南極磷蝦樣品在不同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，隨著溫度升高，微生物的豐度和多樣性都逐漸增多，且psychrobacter(嗜冷桿菌)均為優(yōu)勢菌群，說明南極磷蝦的腐敗與嗜冷桿菌相關(guān)。

由圖14顯示優(yōu)勢菌群psychrobacter(嗜冷桿菌)有明顯的蛋白酶活性，另外planococcus(動球菌屬)亦有蛋白酶活性。

由兩個實施例可以看出：

1.本發(fā)明方法通過高通量測序檢測南極磷蝦樣品中的微生物多樣性和豐度均顯著高于平板培養(yǎng)方法。

2.南極磷蝦體內(nèi)和體外微生物的數(shù)量和多樣性都更適于0℃-4℃生長和分布，因此在南極磷蝦食品加工過程中避免在0℃-4℃長期保存。

3.本發(fā)明方法16srdna高通量測序結(jié)果顯示，0℃-4℃的低溫貯存環(huán)境中，enterococcus(腸球菌)和bacillus(芽孢桿菌)為優(yōu)勢菌群；當(dāng)貯存溫度上升至16℃-25℃時，psychrobacter(嗜冷桿菌)為優(yōu)勢菌群，與平板培養(yǎng)法的結(jié)果相同，說明南極磷蝦的腐敗與嗜冷桿菌相關(guān)。

4.本發(fā)明方法its高通量測序結(jié)果顯示，南極磷蝦的優(yōu)勢真菌群為unclassifiedsaccharomycete(未知酵母菌)此結(jié)果表明，由于南極的特殊生境，南極磷蝦中仍存在大量的有待開發(fā)的未知真菌資源。

5.各種貯存條件的南極磷蝦樣品中，與氨基酸代謝和碳水化合物代謝的功能基因最多，說明南極磷蝦在貯存過程中發(fā)生的自溶及腐敗與其體內(nèi)及體外細(xì)菌的作用正相關(guān)。

7.優(yōu)勢菌群具有蛋白酶活性，說明南極磷蝦的微生物與其貯存過程中的腐敗過程相關(guān)。

sequencelisting

<110>中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所

<120>南極磷蝦貯藏過程中導(dǎo)致其品質(zhì)劣化的優(yōu)勢菌群確定方法

<130>無

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

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<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>細(xì)菌引物v3-v4序列f

<220>

<221>misc_feature

<222>(9)..(9)

<223>nisa,c,g,ort

<400>1

cctacgggnggcwgcag17

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<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>細(xì)菌引物v3-v4r

<400>2

gactachvgggtatctaatcc21

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<213>artificial

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cttggtcatttagaggaagtaa22

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<212>dna

<213>artificial

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<400>4

gctgcgttcttcatcgatgc20