本發(fā)明屬于分子生物學領(lǐng)域，涉及醫(yī)學和生物技術(shù)，具體涉及一種復發(fā)性流產(chǎn)易感基因檢測試劑盒，根據(jù)檢測結(jié)果從基因水平評估復發(fā)性流產(chǎn)發(fā)病的風險級別，并作為預防和治療復發(fā)性流產(chǎn)的方向指導。
背景技術(shù)：
復發(fā)性流產(chǎn)連續(xù)發(fā)生2次或2次以上的自然流產(chǎn)者稱為復發(fā)性流產(chǎn)(rsa)。流產(chǎn)是指妊娠28周以前終止、胎兒體重在1000克以下者。1977年，世界衛(wèi)生組織(who)將流產(chǎn)定義為妊娠20周以前終止、胎兒體重在500克以下者。
引起復發(fā)性流產(chǎn)的危險因素很多，復發(fā)性流產(chǎn)的患者中能夠識別其病因的僅占50％，主要包括染色體異常、母體生殖道異常、母體內(nèi)分泌異常、免疫功能異常、生殖道感染、宮頸機能不全及血栓形成傾向等。
最近的研究表明，復發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生與tnf-α、ctla4、mthfr三個遺傳易感基因密切相關(guān)。tnf-α基因編碼腫瘤壞死因子-α，它能顯著增強巨噬細胞抑制細菌生長的能力，還能誘導產(chǎn)生多種細胞因子，從而間接調(diào)節(jié)免疫細胞的活性，增強特異性免疫保護功能。tnf-α基因g308a突變能使得腫瘤壞死因子α含量增多，產(chǎn)生過強炎性反應，母-胎間免疫應答水平上升，對妊娠產(chǎn)生不良影響。
mthfr基因編碼亞甲基四氫葉酸還原酶，是葉酸代謝過程中的關(guān)鍵酶，維持正常的同型半胱氨酸水平。mthfr基因c677t和a1298c突變，使編碼的亞甲基四氫葉酸還原酶活性降低，葉酸代謝能力下降，血液中同型半胱氨酸水平上升，加重血栓形成傾向，損傷母體及胎兒。
ctla4編碼細胞毒性t淋巴細胞抗原，負向調(diào)節(jié)t淋巴細胞免疫應答，影響著多種自身免疫性疾病的易感性。該基因a49g突變編碼的蛋白量下降，對免疫信號的下調(diào)作用降低，導致免疫信號失控，引發(fā)母胎損傷。
綜上所述，鑒于tnf-α、ctla4、mthfr基因與復發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生有著重要的關(guān)聯(lián)關(guān)系，可以做為預測和篩查復發(fā)性流產(chǎn)的潛在指征，通過這些復發(fā)性流產(chǎn)易感基因的檢測，能在預防和治療復發(fā)性流產(chǎn)以及降低復發(fā)性流產(chǎn)發(fā)生率等方面起到不容忽視的重要作用。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明基于tnf-α基因上單核苷酸多態(tài)性位點g308a(rs1800629)，ctla4基因上單核苷酸多態(tài)性位點a49g(rs231775)，mthfr基因上單核苷酸多態(tài)性位點c677t(rs1801133)、a1298c(rs1801131)基因型可作為評估復發(fā)性流產(chǎn)發(fā)病的危險因子的基礎上，研制一種復發(fā)性流產(chǎn)易感基因檢測試劑盒。
該試劑盒包括：
檢測tnf-α基因上單核苷酸多態(tài)性位點g308a(rs1800629)，ctla4基因上單核苷酸多態(tài)性位點a49g(rs231775)，mthfr基因上單核苷酸多態(tài)性位點c677t(rs1801133)、a1298c(rs1801131)的4個單核苷酸多態(tài)性位點基因型的特異性引物對及dna測序引物；
pcr反應組件(包括taq酶、dntp混合液、反應緩沖液、ddh2o等)；
pcr產(chǎn)物純化組件(包括sap酶、exoi酶、ddh2o等)；
dna測序反應組件(包括bigdyemix，edta溶液、100％乙醇溶液、70％乙醇溶液、hidi溶液、ddh2o等)。
本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括：
pcr反應體系：10×pcr反應緩沖液2.5ul；25mmdntp混合液0.2ul；5u/ultaqdna聚合酶0.125ul；20um特異性引物對(每條引物各0.25ul)；ddh2o19.175ul。
pcr產(chǎn)物純化體系：1u/ulsap酶0.75ul；10u/ulexoi酶0.375ul；ddh2o3.875ul。
測序反應體系：25％bigdyemix1ul；3.2umdna測序引物1ul；125mmedta溶液1ul；100％乙醇溶液15ul；70％乙醇溶液30ul；hidi溶液8ul；ddh2o2ul。
本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20℃。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。
除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
實施例1.檢測試劑盒的使用
1、抽提dna模板
刮取受檢者口腔黏膜上皮細胞，用酚氯仿法抽提基因組dna。
2、pcr擴增反應
使用檢測試劑盒中的pcr反應組件，其中，含有下列引物對：
(1)tnf-α(g308a)正向引物：5′gaggcaataggttttgaggggcatg3′
tnf-α(g308a)反向引物：3′ggacggggttcagcctccagggtcc5′
(2)ctla4(a49g)正向引物：5′cagcggcacaaggctcagctgaacctggct3′
ctla4(a49g)反向引物：3′ccaggacctggccctgcactctcctgtttt5′
(3)mthfr(c677t)正向引物：5′ttgaaggagaaggtgtctgcgggag3′
mthfr(c677t)反向引物：3′cgatttcatcatcacgcagcttttc5′
(4)mthfr(a1298c)正向引物：5′tggggggaggagctgaccagtgaag3′
mthfr(a1298c)反向引物：5′aagtgtctttgaagtctttgttctt3′
pcr擴增的反應體系為：10×pcr反應緩沖液2.5μl；25mm的dntp混合液0.2μl、5u/ultaq酶0.125μl、dna模板1μl(12-15ng左右)、20um正向引物反向引物各0.25μl、ddh2o19.175μl；
反應條件為：94℃預變性5min，然后94℃變性1min，50℃1min退火，72℃延伸50s，35個循環(huán)后，72℃延伸10分鐘。
3、pcr擴增產(chǎn)物純化
使用檢測試劑盒中的pcr產(chǎn)物純化組件，反應體系為總體積25ul，包含pcr產(chǎn)物20ul，1u/ulsap酶0.75ul，10u/ulexoi酶0.375ul，去離子水3.875ul。在abi2720型pcr擴增儀上進行反應，反應條件為37℃、15min，72℃、20min。
4、dna測序反應
使用檢測試劑盒中的測序反應組件，其中，含有下列dna測序引物：
(1)tnf-α(g308a)測序引物：5′gaggcaataggttttgag3′
(2)ctla4(a49g)測序引物：5′cagcggcacaaggctcagctg3′
(3)mthfr(c677t)測序引物：5′ttgaaggagaaggtgtctg3′
(4)mthfr(a1298c)測序引物：5′tggggggaggagctgaccag3′
反應的體系為總體積5ul，包含pcr純化產(chǎn)物1ul，25％bigdyemix1ul，3.2umdna
測序引物1ul，去離子水2ul。
在abi2720型pcr擴增儀上進行反應，反應條件為98℃2min，進行25個循環(huán)的
96℃30s，55℃30s，60℃4min。
反應結(jié)束后加入125mmedta溶液1ul和100％乙醇溶液15ul，于室溫下沉淀15min；在4℃，3600rpm/min的轉(zhuǎn)速離心30min，輕輕倒去上清液；加入70％乙醇溶液30ul，3600rpm/min離心15min，輕輕倒去上清液；室溫放置20min后加入hidi溶液8ul，放入測序儀中。
5、基因型分析
熟悉dna測序技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過辨識dna測序圖譜確定所檢測的snp位點的基因型。
實施例2.篩查復發(fā)性流產(chǎn)風險人群的基因無創(chuàng)檢測服務
1.無創(chuàng)采樣
由醫(yī)院檢驗科醫(yī)師指導受檢者使用口腔采樣拭進行口腔粘膜上皮細胞取樣，樣本用細胞保存液常溫保存。
2.dna抽提
采用酚氯仿法對采集到的口腔粘膜細胞進行dna抽提。
3.基因型檢測
使用本發(fā)明提供的試劑盒，對受檢者基因組dna的tnf-α基因上單核苷酸多態(tài)性位點g308a(rs1800629)，ctla4基因上單核苷酸多態(tài)性位點a49g(rs231775)，mthfr基因上單核苷酸多態(tài)性位點c677t(rs1801133)、a1298c(rs1801131)的4個單核苷酸多態(tài)性位點分別進行dna測序，確定這4個snps位點的基因型。
4.復發(fā)性流產(chǎn)發(fā)病高危人群生物信息學分析及風險評估
通過對受檢者snps基因型的生物信息學分析和風險評估模型鑒定，出具復發(fā)性流產(chǎn)易感基因風險評估分析報告單。報告中詳細說明了受檢者tnf-α基因上單核苷酸多態(tài)性位點g308a(rs1800629)，ctla4基因上單核苷酸多態(tài)性位點a49g(rs231775)，mthfr基因上單核苷酸多態(tài)性位點c677t(rs1801133)、a1298c(rs1801131)的4個snp位點基因檢測信息、復發(fā)性流產(chǎn)風險評估結(jié)果和防治方案。根據(jù)受檢者的風險等級，由醫(yī)師向受檢者詳細說明并解讀復發(fā)性流產(chǎn)易感基因無創(chuàng)檢測報告單。