本發(fā)明涉及癌癥的診斷試劑盒及其治療用的藥物組合物，屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
甲狀腺惡性腫瘤中最常見的是甲狀腺癌(thyroidcarcinoma)，極少數(shù)可有惡性淋巴瘤及轉(zhuǎn)移瘤，甲狀腺癌占全身惡性腫瘤的1％。除髓樣癌外，絕大部分甲狀腺癌起源于濾泡上皮細(xì)胞。甲狀腺癌的發(fā)病率與地區(qū)、種族、性別有一定關(guān)系。美國(guó)的甲狀腺癌發(fā)病率較高，根據(jù)統(tǒng)計(jì)，1973-2002年間，美國(guó)甲狀腺癌的年發(fā)生率由十萬分之3.6增加到十萬分之8.7，大約增加了2.4倍(p<0.001),而且這種趨勢(shì)仍然在逐年增長(zhǎng)。國(guó)內(nèi)的甲狀腺癌發(fā)病率較低，據(jù)統(tǒng)計(jì)，其中男性約
0.8-0.9/10萬，女性約2.0-2.2/10萬。
甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)中發(fā)病率最高的惡性疾病，其發(fā)病率在近三十年內(nèi)上升了三倍。根據(jù)2012年中國(guó)國(guó)家癌癥中心登記處統(tǒng)計(jì)，我國(guó)甲狀腺癌的發(fā)病率約為十萬分之8.76，每年大約有11.8萬人被檢測(cè)出甲狀腺癌。從細(xì)胞起源和臨床病理上甲狀腺癌可分為以下幾種亞型:起源于甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞的高分化的乳頭狀癌和濾泡狀癌，低分化癌，未分化癌；以及起源于甲狀腺濾泡旁細(xì)胞的甲狀腺髓樣癌。其中乳頭狀癌占了所有甲狀腺癌85％的病例。目前的研究表明基因融合是甲狀腺癌發(fā)病的決定性因素之一，癌癥基因組計(jì)劃(thecancergenomeatlas)繪制的甲狀腺癌的遺傳圖譜提示，基因融合占據(jù)了甲狀腺癌驅(qū)動(dòng)突變的20％左右。因此鑒定出甲狀腺癌組織中的基因融合對(duì)于甲狀腺癌的精準(zhǔn)診斷和治療是必要的。
cn102844443b描述了用于檢測(cè)、診斷和監(jiān)測(cè)受試者的甲狀腺癌的方法，其包括測(cè)定在受試者的樣品中的包括ep-icd和β-聯(lián)蛋白在內(nèi)的標(biāo)志物。
cn102459636b中公開了組合物用于確定受試者中惡性甲狀腺病癥的可能性，其中所述試劑適于檢測(cè)所述受試者的dna樣品中iyd或其互補(bǔ)序列與正常樣品相比的一種或多種拷貝數(shù)變異，并且包含對(duì)應(yīng)于hd或其互補(bǔ)序列的一種或多種生物標(biāo)志物，并且其中所述甲狀腺病癥是異常細(xì)胞增殖，其中所述可能性如下確定：(a)提供所述受試者的dna樣品；(b)使用所述組合物分析所述dna樣品中iyd或其互補(bǔ)序列的一種或多種拷貝數(shù)變異的存在；和(c)基于步驟(b)的結(jié)果確定所述受試者是否患有或可能患有惡性甲狀腺病癥。
cn102272325b中公開了試劑在制備用于診斷受試者的甲狀腺狀態(tài)的組合物中的用途，其中所述試劑包含兩種對(duì)應(yīng)于兩種生物標(biāo)志物的基因，其中所述兩種生物標(biāo)志物選自aldh1b1、cfh、cfhr1、pkhd1l1、pygl、sema3d、stk32a，并且其中所述兩種生物標(biāo)志物中的一種是aldh1b1，所述甲狀腺狀態(tài)通過以下步驟診斷：(a)從所述受試者獲得甲狀腺組織樣品；(b)測(cè)定所述甲狀腺組織樣品中至少兩種基因表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)的表達(dá)水平，其中所述至少兩種基因表達(dá)產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于所述甲狀腺組織樣品中的所述至少兩種生物標(biāo)志物；和(c)通過將算法應(yīng)用于步驟(b)的表達(dá)水平數(shù)據(jù)而將所述甲狀腺組織樣品分類為良性或惡性的，其中所述算法的陰性預(yù)測(cè)值至少為95％，且其中所述分類基于對(duì)應(yīng)于所述至少兩種生物標(biāo)志物的至少兩種基因表達(dá)產(chǎn)物的所述表達(dá)水平。
現(xiàn)有技術(shù)的研究發(fā)現(xiàn)，針對(duì)甲狀腺癌的檢測(cè)方法比較復(fù)雜，存在這不準(zhǔn)確以及不穩(wěn)定的現(xiàn)象，需要本領(lǐng)域技術(shù)人員去追求和研究。
前期的研究發(fā)現(xiàn)mmset作為一種近期發(fā)現(xiàn)的新的腫瘤相關(guān)基因，研究者們?cè)诙喾N腫瘤中證實(shí)mmset在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化以及腫瘤的遷移、侵襲以及轉(zhuǎn)移等方面的作用，深入了解mmset對(duì)于了解腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，和判斷腫瘤的預(yù)后和指導(dǎo)治療方面均具有重要意義。因此，mmset基因有可能成為今后腫瘤的早期診斷和基因治療方面的研究熱點(diǎn)。但我們?nèi)詰?yīng)看到，mmset基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制、生物學(xué)功能和促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制現(xiàn)在還不清楚，有許多問題還有待于進(jìn)一步研究與探索。
基于上述的研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)明人通過研究發(fā)現(xiàn)，mmset基因與甲狀腺癌相關(guān)，同時(shí)提供一種快速的甲狀腺癌檢測(cè)的標(biāo)志物以及相應(yīng)的試劑盒顯得尤為重要。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
根據(jù)第一方面，本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供微小核苷酸mir-27a-3p在制備診斷甲狀腺癌的芯片中的應(yīng)用。
其中，mir-27a-3p的堿基序列為uucacaguggcuaaguuccgc。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是，提供微小核苷酸mir-27a-3p在制備甲狀腺癌預(yù)后的疾病進(jìn)展的試劑盒中的應(yīng)用。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是，提供微小核苷酸mir-27a-3p作為靶向降低mmset表達(dá)的試劑在制備治療甲狀腺癌的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了一種分離的寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述寡核苷酸具有如seqidno:1所示的序列。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，發(fā)明人確定了生物樣本存在甲狀腺癌的mirna生物標(biāo)志物，該mirna生物標(biāo)志物具有如seqidno:1所示的序列，并且確定了該mirna生物標(biāo)志物與甲狀腺癌的診斷/預(yù)后以及治療過程密切相關(guān)。
在本發(fā)明的最后一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于確定生物樣本存在甲狀腺癌的芯片以及相應(yīng)的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述試劑盒包含探針，所述探針特異性識(shí)別具有如seqidno:1所示序列的所述的寡核苷酸。利用根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的試劑盒，能夠有效地確定生物樣品是否存在甲狀腺癌。
一種用于早期甲狀腺癌診斷用試劑盒或生物芯片，包括上述特異表達(dá)mirnas的逆轉(zhuǎn)錄引物和檢測(cè)引物。逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如seqidno：2所示，前向檢測(cè)引物的序列如seqidno：3所示：反向檢測(cè)引物如seqidno：4所示：
seqidno:2：
5’-ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgaggcggaact-3’；
seqidno：3：5’-acactccagctgggttcacagtggctaagt-3'；
seqidno：4：5’-tggtgtcgtggagtcg-3’。
本發(fā)明可以直接將生物樣本中提取分離出完整無降解的rna，經(jīng)過熒光標(biāo)記，利用生物芯片雜交技術(shù)進(jìn)行芯片掃描和分析，從而確定生物體是否存在甲狀腺癌。
本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：
本發(fā)明收集甲狀腺癌患者和正常人的血漿對(duì)全基因組mir表達(dá)譜進(jìn)行研究。研究結(jié)果揭示了一系列mirs與甲狀腺癌相關(guān)，其中發(fā)現(xiàn)分子標(biāo)記物mir-27a-3p作為靶向降低mmset表達(dá)的分子在甲狀腺癌中具有顯著抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)的現(xiàn)象。為有效控制治療甲狀腺癌提供全新的治療靶點(diǎn)和藥物。
附圖說明
圖1甲狀腺癌和正常細(xì)胞中mmset和mir-27a-3prna相對(duì)表達(dá)量變化圖
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1甲狀腺癌中差異mir分析
1、樣本的確定
研究對(duì)象的一般資料
本實(shí)驗(yàn)石蠟標(biāo)本均取自2005年9月至2011年3月在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦科接受手術(shù)治療的標(biāo)本，包括101例甲狀腺癌標(biāo)本，隨機(jī)選擇的41例同期因甲狀腺良性結(jié)節(jié)于我院行結(jié)節(jié)切除術(shù)的正常甲狀腺標(biāo)本作為對(duì)照。全部病例在術(shù)前均未接受放療、化療、激素治療及生物治療，病例對(duì)應(yīng)的臨床病理資料完整，病理診斷均由有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)生復(fù)核。
本課題在實(shí)施前，己獲哈爾濱醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。
我們將本研究的101例甲狀腺癌組織樣本制作成組織芯片，通過測(cè)序其中rna表達(dá)數(shù)據(jù)(rnaseq)，比較甲狀腺癌組織與正常組織mir表達(dá)水平上的差異。通過研究發(fā)現(xiàn)，mir-27a-3p在甲狀腺癌患者體內(nèi)低表達(dá)，而mmset蛋白在甲狀腺癌中高表達(dá)。而mir-27a-3p在正常人群中相對(duì)于患者體內(nèi)是高表達(dá)，而mmset蛋白在正常人群中相對(duì)于癌癥患者是低表達(dá)的。
表1mmset在正常組織和癌癥患者中的表達(dá)情況(p<0.001；χ2檢驗(yàn))
同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)mir-27a-3p能夠靶向mmset，從圖1的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),mir-27a-3p高表達(dá)時(shí),相應(yīng)的mmset低表達(dá)。
實(shí)施例2高表達(dá)mir-27a-3p對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞作用情況
將甲狀腺癌細(xì)胞株wro細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)；所用培養(yǎng)基為含10％胎牛血清、100u/ml青霉素和100wg/ml鏈霉素的高搪dmem培養(yǎng)基(dulbecco'smodifiedeagle'smedium,gibco-invitrogen,carlsbad,ca,usa)。細(xì)胞置于37℃,5％co2和飽和濕度的無菌恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。正常生長(zhǎng)情況下2-4天換一次培養(yǎng)液，通過0.25％胰酶(trypsin-edtasolution,gibco-invitrogen,carlsbad,ca,usa)將細(xì)胞1:3或1:4傳代。
構(gòu)建過表達(dá)mir-27a-3p載體：將mir-27a-3p序列及其側(cè)翼序列克隆至pmd19-t載體，由上海生工公司測(cè)序。結(jié)果顯示mir-27a-3p序列正確，將測(cè)序確認(rèn)的mir-27a-3p序列及其側(cè)翼序列做亞克隆，插入pcdh-cmv-mcs-efl-gfp+puro載體的ecori/bamhi之間。載體命名為pcdh-cmv-mir-27a-3p-efl-gfp+puro。將載體轉(zhuǎn)染入常用的載體細(xì)胞中，構(gòu)建慢病毒載體。
病毒感染及抗性篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株:在六孔板中無抗完全培養(yǎng)基中接種2.0x106個(gè)wro細(xì)胞，37℃、5％co2過夜，稀釋病毒:稀釋液(靶細(xì)胞維持液培養(yǎng)基)1000ul+終濃度5μg/mlpolybrene，將慢病毒原液(100ul)加入到稀釋液中(此時(shí)細(xì)胞個(gè)數(shù)按1x106計(jì)，即μ0ι＝10)；移去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入稀釋后的病毒液，同時(shí)建立對(duì)照(blank、negative)，37℃、5％co2過夜(感染時(shí)細(xì)胞融合度為70-80％)，移去細(xì)胞侵染后的病毒液，加入2ml完全培液，37℃、5％co2過夜；根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)，進(jìn)行常規(guī)傳代，傳代同時(shí)(感染后72h)，換用含嘌呤霉素(puro終濃度lμg/ml)的完全培養(yǎng)基以進(jìn)行抗性篩選；以后每隔兩天換用新的含puro的培養(yǎng)基，直至blank組細(xì)胞全部死亡；將存活下來的細(xì)胞換用含一半篩選濃度藥物的培養(yǎng)基培養(yǎng)，進(jìn)行為期一周的抗性維持。最后采用熒光定量pcr的實(shí)驗(yàn)方法篩選過表達(dá)細(xì)胞。通過pcr以及提取質(zhì)粒鑒定，陽性細(xì)胞的mir表達(dá)量可以提高184％左右。
為了鑒定靶向蛋白mmset的表達(dá)情況，采用熒光定量pcr以及westernblot法進(jìn)行檢查：
通過實(shí)時(shí)定量熒光pcr法對(duì)上述轉(zhuǎn)染甲狀腺癌中mmset基因的mrna表達(dá)水平進(jìn)行再次驗(yàn)證，通過比較，發(fā)現(xiàn)以mmset在空白甲狀腺癌細(xì)胞為參照物，轉(zhuǎn)染了mirna的甲狀腺癌細(xì)胞中的mmsetmrna表達(dá)水平降低了94％。
另外，通過細(xì)胞生長(zhǎng)曲線分析同樣也發(fā)現(xiàn)過表達(dá)mir的甲狀腺癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)速度明顯低于只轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞株，生長(zhǎng)速度下降了84％。這說明mir-27a-3p可以靶向降低mmset的表達(dá)，進(jìn)而抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖。
通過western-blot法檢測(cè)了mmset在空白甲狀腺癌細(xì)胞以及導(dǎo)入了mir的甲狀腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平，為了排除蛋白上樣量不一致所導(dǎo)致的誤差，本實(shí)驗(yàn)采用β-actin作為內(nèi)參。mmset蛋白在導(dǎo)入了mir癌細(xì)胞中的表達(dá)量相對(duì)于未導(dǎo)入mir的癌細(xì)胞相對(duì)表達(dá)量為0.12，也就是說mmset蛋白的表達(dá)絕大部分被抑制。
實(shí)施例3甲狀腺癌細(xì)胞的檢測(cè)
新選取40例甲狀腺癌患者以及20例正常人群的血清2ml，通過mirnas的逆轉(zhuǎn)錄引物和檢測(cè)引物進(jìn)行定量pcr檢測(cè)，核酸提取以及相應(yīng)的pcr步驟和條件為本領(lǐng)域常規(guī)的。其中，逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如seqidno：2所示，前向檢測(cè)引物的序列如seqidno：3所示：反向檢測(cè)引物如seqidno：4所示：通過檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中39例癌癥患者的mirna表達(dá)量顯著低于20例正常人的表達(dá)量，這說明通過mir的表達(dá)量分析可以用于甲狀腺癌的初步診斷。
盡管本發(fā)明的具體實(shí)施方式已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解。根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對(duì)那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。
序列表
〈110〉申永智
〈120〉一種癌癥診斷試劑盒以及治療用藥物組合物
〈210〉1
<212>rna
<213>人工序列
<400>mir-27a-3p
uucacaguggcuaaguuccgc
〈210〉2
<212>dna
<213>人工序列
<400>逆轉(zhuǎn)錄引物
ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgaggcggaact
〈210〉3
<212>dna
<213>人工序列
<400>f
acactccagctgggttcacagtggctaagt
〈210〉4
<212>dna
<213>人工序列
<400>r
tggtgtcgtggagtcg