本發(fā)明涉及干細(xì)胞培養(yǎng)基
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種胚胎干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
：胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcell，escs，簡稱es、ek或esc細(xì)胞。)胚胎干細(xì)胞是早期胚胎(原腸胚期之前)或原始性腺中分離出來的一類細(xì)胞，它具有體外培養(yǎng)無限增殖、自我更新和多向分化的特性。無論在體外還是體內(nèi)環(huán)境，es細(xì)胞都能被誘導(dǎo)分化為機(jī)體幾乎所有的細(xì)胞類型。胚胎干細(xì)胞研究在美國一直是一個頗具爭議的領(lǐng)域，支持者認(rèn)為這項研究有助于根治很多疑難雜癥，因為胚胎干細(xì)胞可以分化成多種功能的apsc多能細(xì)胞，被認(rèn)為是一種挽救生命的慈善行為，是科學(xué)進(jìn)步的表現(xiàn)。而反對者則認(rèn)為，進(jìn)行胚胎干細(xì)胞研究就必須破壞胚胎，而胚胎是人尚未成形時在子宮的生命形式。由胚胎來源的原始(未分化)細(xì)胞，它們具有分化成為眾多特異細(xì)胞類型的潛能。胚胎干細(xì)胞最誘人的前景和用途是生產(chǎn)組織和細(xì)胞，用于“細(xì)胞療法”，為細(xì)胞移植提供無免疫原性的材料。任何涉及喪失正常細(xì)胞的疾病，都可以通過移植由胚胎干細(xì)胞分化而來的特異組織細(xì)胞來治療。如用神經(jīng)細(xì)胞治療神經(jīng)退行性疾病(帕金森病、亨廷頓舞蹈癥、阿爾茨海默病等)，用胰島細(xì)胞治療糖尿病，用心肌細(xì)胞修復(fù)壞死的心肌等。胚胎干細(xì)胞還是基因治療最理想的靶細(xì)胞。這里的基因治療是指用遺傳改造過的人體細(xì)胞直接移植或輸入病人體內(nèi)，達(dá)到控制和治愈疾病的目的。這種遺傳改造包括糾正病人體內(nèi)存在的基因突變，或使所需基因信息傳遞到某些特定類型細(xì)胞。cn100465268c中公開了一種人胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)方法及其專用培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基配方為：n25-30ml，b2710-60ml，谷氨酰胺0.0146-0.73g，β-巰基乙醇5-10μl，非必需氨基酸中的一種或幾種共計：3-30ml，堿性成纖維細(xì)胞生長因子20-200mg，小牛血清白蛋白0.2-0.8g；用dmem/f12定容至1000ml，ph7.2-7.8。該培養(yǎng)基成分確定，且無任何動物來源的成分，使用安全性高。該方法并不能特異性的針對分化為心肌細(xì)胞的用途。cn102994446b中公開了一種誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，其特征在于，誘導(dǎo)劑由丹酚酸b和人參皂苷rgl組成；所述誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基通過以下方法制得：誘導(dǎo)劑加入用于胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的分化培養(yǎng)基；其中，所述誘導(dǎo)劑中的丹酚酸b在所述誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中的濃度為104-105m，人參皂苷rgl在所述誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中的濃度為104-105m；所述用于胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的分化培養(yǎng)基由如下成分配制而成：gmem培養(yǎng)基，胎牛血清，非必須氨基酸，100mm的丙酮酸鈉水溶液和10w的二巰基乙醇水溶液，其中g(shù)mem培養(yǎng)基：胎牛血清：非必需氨基酸：丙酮酸鈉水溶液：二巰基乙醇水溶液的體積比＝77.9:20:1:1:0.1。誘導(dǎo)劑的使用濃度過高，對于生產(chǎn)以及細(xì)胞的安全性都有很嚴(yán)重的影響。cn104164402a中公開了一種人胚胎干細(xì)胞體外分化為功能性心肌細(xì)胞的新型培養(yǎng)方法，包括以下步驟:步驟i)擬胚體的形成:以濃度為(2～4)x15個/ml接種人胚胎干細(xì)胞至明膠包被的培養(yǎng)皿中，每天添加培養(yǎng)基并吹打,避免細(xì)胞貼壁,所用培養(yǎng)基為無血清擬胚體形成培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件是37℃、5％c02和95％飽和濕度，第3天可形成擬胚體并懸浮在培養(yǎng)液中，第5_7天形成大量的擬胚體；步驟2)心肌細(xì)胞分化培養(yǎng):收集擬胚體以i個/孔接種在12孔培養(yǎng)皿中，所用的心肌細(xì)胞分化培養(yǎng)基是以80％dmem培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加20％血清替代品，并添加了多種誘導(dǎo)物質(zhì)；每天更換一次分化培養(yǎng)基，并添加強(qiáng)化營養(yǎng)物質(zhì)，培養(yǎng)條件為37℃、5％c02和95％飽和濕度的條件下靜態(tài)培養(yǎng)；跳動心肌細(xì)胞在培養(yǎng)的第3天出現(xiàn)，大量的心肌細(xì)胞在培養(yǎng)的第5天出現(xiàn)跳動，當(dāng)大面積觀察到節(jié)律性搏動細(xì)胞團(tuán)的出現(xiàn)即完成了心肌細(xì)胞的分化。該方法實質(zhì)上只是步驟上的優(yōu)化，對于干細(xì)胞培養(yǎng)基并沒有特異性的優(yōu)化，使得最終培養(yǎng)得到的分化細(xì)胞個樹少，質(zhì)量差，不適于大規(guī)模使用。另外，在前期的研究發(fā)現(xiàn)懸浮培養(yǎng)誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞具有一定的優(yōu)勢，但是分化效率僅為20.8％，分化時間14d左右。誘導(dǎo)率以及分化時間都還有待進(jìn)一步提高?；谝陨戏椒ɑ蚺囵B(yǎng)基組成方面的不足，在利用培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞在過程中，生長速度慢，容易出現(xiàn)老化的特征，從而影響細(xì)胞的大量擴(kuò)增。而心肌細(xì)胞在用于臨床治療時對細(xì)胞數(shù)量有很大的要求，而且還必需在短時間內(nèi)得到足夠的細(xì)胞以滿足治療的需要，因此開發(fā)一種能夠使得商用的人胚胎干細(xì)胞高質(zhì)量的分化為心肌細(xì)胞變得迫在眉睫。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供培養(yǎng)人商業(yè)用的胚胎干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，能夠提高人胚胎干細(xì)胞地生長速度，提高分化擴(kuò)增速率，同時保證干細(xì)胞和心肌細(xì)胞生物學(xué)特性。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:提供一種商業(yè)用的人胚胎干細(xì)胞無血清分化培養(yǎng)基，其特征在于，由以下終濃度的各成分構(gòu)成：l-谷氨酰胺2mmol/l、l丙酮酸鈉0.2mmol/l、轉(zhuǎn)鐵蛋白6.5mg/l、亞硒酸鈉30mg/l和人表皮細(xì)胞生長因子:0.15mg/l，纖連蛋白:0.3mg/l，細(xì)胞活性促進(jìn)肽(序列如seqidno：1-2任一所示)濃度為50ppm，用dmem/f12(1：1)培養(yǎng)基進(jìn)行配置。dmem/f12(1：1)培養(yǎng)基采用dmem和f12按溶液體積比1:1混合而成。本發(fā)明另外提供一種培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的方法，首先制備mef；其次，人胚胎干細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)和傳代；再次，人胚胎干細(xì)胞懸浮法制備eb以及分化；最后檢測分化得到的心肌細(xì)胞狀況。采用本發(fā)明提供的制備方法，具有以下有益效果:1、在分化培養(yǎng)基中由于不含有動物來源的血清，因此可以控制感染風(fēng)險；2、在分化培養(yǎng)基中加入了特異性促進(jìn)干細(xì)胞分化活性的小肽，使得細(xì)胞生長以及分化速度顯著提高；3、制備得到的心肌細(xì)胞的生物學(xué)特性保持不變；4、經(jīng)過試驗驗證的心肌細(xì)胞在保持了較長的時間內(nèi)的生物學(xué)特性不發(fā)生改變。而且細(xì)胞的分化效率以及成活率都較高。附圖說明圖1轉(zhuǎn)化率線圖。最上面虛線為實施例1的轉(zhuǎn)化率線；中間線為實施例2的轉(zhuǎn)化率線，最底部的線為對照的轉(zhuǎn)化率線具體實施方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述，但它們不是對本發(fā)明的進(jìn)一步限制。實施例1:第一種方法人胚胎干細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)；(1)取商業(yè)購買的人胚胎干細(xì)胞系(h9)，購買自江蘇斯坦福生物技術(shù)有限公司。在水浴鍋內(nèi)迅速融化(20s之內(nèi))，加入到含20ml人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基(由以下終濃度的各成分構(gòu)成：l-谷氨酰胺2mmol/l、l丙酮酸鈉0.2mmol/l、轉(zhuǎn)鐵蛋白6.5mg/l、亞硒酸鈉30mg/l和人表皮細(xì)胞生長因子:0.15mg/l，纖連蛋白:0.3mg/l，細(xì)胞活性促進(jìn)肽(序列如seqidno：1所示)終濃度為50pppm，用dmem/f12(1：1)培養(yǎng)基進(jìn)行定容)的50ml離心管中，自然沉淀30min，吸去上清，用3ml培養(yǎng)基輕輕重懸沉淀后將重懸液加入到已經(jīng)鋪好mef的0.1％明膠處理過的6cm培養(yǎng)皿中。當(dāng)人胚胎干細(xì)胞的克隆長滿后，用200u/ml膠原酶w，37℃處理lomin后，挑起克隆碎片到mef鋪好的6孔板中培養(yǎng)。(2)人胚胎干細(xì)胞懸浮法制備eb以及分化：人胚胎干細(xì)胞克隆用200u/ml膠原酶iv37℃處理lomin后，挑起克隆碎片轉(zhuǎn)移到低粘附性培養(yǎng)皿中，懸浮培養(yǎng)以形成eb，懸浮培養(yǎng)基為：l-谷氨酰胺2mmol/l、l丙酮酸鈉0.2mmol/l、轉(zhuǎn)鐵蛋白6.5mg/l、亞硒酸鈉30mg/l和人表皮細(xì)胞生長因子:0.15mg/l，纖連蛋白:0.3mg/l，細(xì)胞活性促進(jìn)肽(序列如seqidno：1所示)終濃度為50ppm，用dmem/f12(1：1)培養(yǎng)基進(jìn)行配置定容；4d后將eb轉(zhuǎn)移到基質(zhì)膠處理過的6孔板中貼壁培養(yǎng)(2ebs/cm2)(培養(yǎng)基成分同懸浮培養(yǎng)基)，每天觀察細(xì)胞跳動情況，大約5-10d后收獲心肌細(xì)胞。實施例2:第二種方法人胚胎干細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)；(1)取商業(yè)購買的人胚胎干細(xì)胞系(h9)，購買自江蘇斯坦福生物技術(shù)有限公司。在水浴鍋內(nèi)迅速融化(20s之內(nèi))，加入到含20ml人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基(由以下成分構(gòu)成：l-谷氨酰胺2mmol/l、l丙酮酸鈉0.2mmol/l、轉(zhuǎn)鐵蛋白6.5mg/l、亞硒酸鈉30mg/l和人表皮細(xì)胞生長因子:0.15mg/l，纖連蛋白:0.3mg/l，細(xì)胞活性促進(jìn)肽(序列如seqidno：2所示)終濃度為50ppm，用dmem/f12(1：1)培養(yǎng)基進(jìn)行定容)的50ml離心管中，自然沉淀30min，吸去上清，用3ml培養(yǎng)基輕輕重懸沉淀后將重懸液加入到已經(jīng)鋪好mef的0.1％明膠處理過的6cm培養(yǎng)皿中。當(dāng)人胚胎干細(xì)胞的克隆長滿后，用200u/ml膠原酶w，37℃處理lomin后，挑起克隆碎片到mef鋪好的6孔板中培養(yǎng)。(2)人胚胎干細(xì)胞懸浮法制備eb以及分化：人胚胎干細(xì)胞克隆用200u/ml膠原酶iv37℃處理lomin后，挑起克隆碎片轉(zhuǎn)移到低粘附性培養(yǎng)皿中，懸浮培養(yǎng)以形成eb，懸浮培養(yǎng)基為：l-谷氨酰胺2mmol/l、l丙酮酸鈉0.2mmol/l、轉(zhuǎn)鐵蛋白6.5mg/l、亞硒酸鈉30mg/l和人表皮細(xì)胞生長因子:0.15mg/l，纖連蛋白:0.3mg/l，細(xì)胞活性促進(jìn)肽(序列如seqidno：2所示)終濃度為50ppm，用dmem/f12(1：1)培養(yǎng)基進(jìn)行配置定容；4d后將eb轉(zhuǎn)移到基質(zhì)膠處理過的6孔板中貼壁培養(yǎng)(2ebs/cm2)(培養(yǎng)基成分同懸浮培養(yǎng)基)，每天觀察細(xì)胞跳動情況，大約5-10d后收獲心肌細(xì)胞。對照例采用文獻(xiàn)：“懸浮培養(yǎng)誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的研究中方法，李獻(xiàn)帥等，心肺血管病雜志，第33卷，第1期，2014年1月，p93-97”的方法作為對照，具體實施步驟按照該文章記載的步驟和條件進(jìn)行，其中干細(xì)胞來源與實施例1和2中的相同。實施例3分化轉(zhuǎn)化效率分析從分化的第5天開始，每天鏡下觀察和記錄克隆跳動的情況，以及跳動的頻率，最后統(tǒng)計繪圖如(圖1)所示。可以看到，實施例1和實施例2所示的培養(yǎng)基能夠使得跳動細(xì)胞在較短的時間內(nèi)實現(xiàn)了干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化達(dá)到了50％以上，而對照的方法在5天內(nèi)沒有心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，直到第13天才實現(xiàn)9.9％的轉(zhuǎn)化率，而實施例1和2實現(xiàn)了96.4％的轉(zhuǎn)化率，具有非常顯著高的轉(zhuǎn)化率。通過統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)實施例1和2得到的心肌細(xì)胞大多數(shù)跳動克隆的頻率分布在55-75次/min之間，跳動克隆的平均跳動頻率為(67.86)次/min，具有較好的細(xì)胞活性。表1轉(zhuǎn)化率表格實施例4心肌細(xì)胞凋亡檢測采用本領(lǐng)域常用的凋亡試劑盒檢測各組心肌細(xì)胞凋亡比例。實施例1和2以及對照的方法制備得到的心肌細(xì)胞，分別將跳動的心肌細(xì)胞經(jīng)24h缺氧處理后hoechst33258染色，正常細(xì)胞的細(xì)胞核呈正常的藍(lán)色，而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核會呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，顏色有些發(fā)白。隨機(jī)選擇10個高倍鏡視野(x100)進(jìn)行統(tǒng)計，缺氧24h后跳動心肌細(xì)胞的凋亡比例結(jié)果如下：實施例1實施例2對照凋亡比例3.1±0.2％3.4±0.2％8.4±0.4％從檢測結(jié)果可以看出，實施例1和2的方法得到的心肌細(xì)胞具有較好的細(xì)胞活性。另外，采用細(xì)胞耐久性試驗，實施例1和2制備的人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)出現(xiàn)跳動的心肌細(xì)胞持續(xù)跳動的時間在體外可以維持4.5個月以上。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受實施例的限制，其它任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所做的改變、修飾、組合、替代、簡化均應(yīng)為等效替換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。序列表〈110〉朱猛〈120〉一種人胚胎干細(xì)胞分化專用的無血清培養(yǎng)基〈160〉2〈210〉1〈211〉26〈212〉prt〈213〉人工序列〈400〉細(xì)胞活性促進(jìn)肽1pvqmrsfrhpkdyysfspnppyphwr〈160〉2〈210〉1〈211〉24〈212〉prt〈213〉人工序列〈400〉細(xì)胞活性促進(jìn)肽2rqdqfafgddhgscqesithynas當(dāng)前第1頁12