(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種賴氨酸分枝二聚多肽及其應(yīng)用。

(二)

背景技術(shù)：

自20世紀(jì)90年代從酵母蛋白中發(fā)現(xiàn)了自組裝多肽以來(lái)，自組裝多肽領(lǐng)域的研究得到了快速的發(fā)展，并已成功應(yīng)用于生物技術(shù)、納米材料、細(xì)胞工程、藥物控釋等領(lǐng)域(uspatentno.5670483,1997；no.5955343,1999；no.20020160471,2002；no.6548630,2003)。從天然蛋白衍生的自組裝多肽都是利用l型氨基酸進(jìn)行分子自組裝，具有較好的生物相容性，能夠被l型生物酶降解。

公開(kāi)號(hào)為cn101054409a的中國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)了一種兩親型短肽，此短肽命名為d-eak，是用d型氨基酸構(gòu)建的自組裝短肽。d型氨基酸的自組裝短肽，它一般不能被常規(guī)l型酶降解，體內(nèi)穩(wěn)定存在的時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)表明，d-eak短肽可在制備溫控型、酸堿性分子器件或者生物分子探針中應(yīng)用，可在制備保濕鎖水劑中應(yīng)用，可在細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)用，可在制備抑菌藥物中應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)還表明，d-eak短肽形成的納米纖維較短，使其的應(yīng)用范圍受到一定的限制。

公開(kāi)號(hào)為cn101337985a的中國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)了另一種兩親型d自組裝多肽，命名為d-rad16。實(shí)驗(yàn)表明，d-rad16自組裝多肽形成的水凝膠可在制備保濕鎖水劑中應(yīng)用并對(duì)創(chuàng)傷有快速止血功能，可以通過(guò)添加藥學(xué)上可接受的載體或者賦形劑制備成適合于臨床使用的止血藥物。d-rad16自組裝多肽形成的納米纖維支架支持多種細(xì)胞的生長(zhǎng)，可作為細(xì)胞的三維培養(yǎng)基質(zhì)材料，為新藥研發(fā)提供一種可模擬體內(nèi)環(huán)境的藥物篩選模式。但是d型氨基酸的自組裝短肽一般不能被常規(guī)l型酶降解，生物相容性較差，臨床應(yīng)用風(fēng)險(xiǎn)大。

(三)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種新型的兩親型自組裝多肽。通過(guò)賴氨酸分枝形成的二聚多肽，其分子間通過(guò)非共價(jià)鍵相互作用自發(fā)組合，由此而形成的自組裝結(jié)構(gòu)有更多的結(jié)構(gòu)靈活性和多樣性，促進(jìn)自組裝多肽在納米生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種式(1)所示賴氨酸分枝二聚多肽：

式(1)中，peptide1(多肽1)和peptide2(多肽2)均為8-20個(gè)氨基酸組成的多肽。peptide1通過(guò)氨基酸序列c-端的羧基與賴氨酸ε-氨基形成酰胺鍵，peptide2通過(guò)氨基酸序列c-端的羧基與賴氨酸α-氨基形成酰胺鍵。所述peptide1，peptide2的n-端可以連接任何一種天然氨基酸，小分子修飾或者乙?；舛?。

進(jìn)一步，所述peptide1和peptide2各自獨(dú)立為下列之一：(1)(aa⁺aaⁿaa^-aaⁿ)n；(2)(aa^-aaⁿaa⁺aaⁿ)n；(3)(aaⁿaa⁺aaⁿaa^-)n；(4)(aaⁿaa^-aaⁿaa⁺)n，其中，aa⁺為精氨酸或賴氨酸；aa^-為天門(mén)冬氨酸或谷氨酸；aaⁿ丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸或纈氨酸，n為2-5之間的任意正整數(shù)。

進(jìn)一步，所述peptide1和peptide2的氨基酸序列相同。

進(jìn)一步，所述賴氨酸分枝二聚多肽為下列之一：

(1)

氨基酸序列為：(acradaradarada)2k-nh2；

(2)

氨基酸序列為：(acakaeakaeakaea)2k-nh2；

(3)

氨基酸序列為：(aceikieikieiki)2k-nh2；

(4)

氨基酸序列為：aceikieikieiki-k(acradaradarada)-nh2；

其中ac為乙?；舛?。

本發(fā)明所述賴氨酸分枝形成的二聚多肽按如下方法制備：采用fmoc氨基樹(shù)脂和氨基酸以逐步偶聯(lián)的fmoc固相多肽合成法(fmocspps)進(jìn)行合成：從fmoc氨基樹(shù)脂首先連接fmoc-lys(fmoc)-oh或者fmoc-lys(dde)-oh，然后去除保護(hù)基和相應(yīng)的氨基酸逐步偶聯(lián)進(jìn)行合成。經(jīng)過(guò)切割反應(yīng)及反相制備色譜純化，凍干得到賴氨酸分枝二聚多肽。

通過(guò)賴氨酸分枝形成的二聚多肽作為自組裝多肽，其原理是分子間通過(guò)非共價(jià)鍵相互作用自發(fā)組合形成一種結(jié)構(gòu)靈活、構(gòu)造穩(wěn)定、具有某些理化性能的分子聚集體或超分子納米結(jié)構(gòu)。由于多肽1、多肽2與賴氨酸通過(guò)共價(jià)單鍵相連，多肽1和多肽2可以形成直鍵狀的二聚多肽或者任意角度的三維立體結(jié)構(gòu)。由此而形成的自組裝結(jié)構(gòu)有更多的結(jié)構(gòu)靈活性和多樣性。

本發(fā)明還提供一種所述賴氨酸分枝二聚多肽在制備納米纖維水凝膠中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)賴氨酸分枝二聚多肽作為自組裝多肽，在鹽離子、細(xì)胞培養(yǎng)基等生理環(huán)境下能自組裝形成納米纖維水凝膠，可在制備納米阻隔材料中應(yīng)用。

本發(fā)明提供一種所述賴氨酸分枝二聚多肽在制備鎖水保濕劑中的應(yīng)用。本分明所述的賴氨酸分枝二聚多肽能形成非常優(yōu)良的水凝膠，肽與水的質(zhì)量比可以低于1:99，因此這種賴氨酸分枝二聚肽是一種高效的鎖水性物質(zhì)，可在制備鎖水保濕劑中應(yīng)用。

本發(fā)明提供一種所述賴氨酸分枝二聚多肽在制備止血藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的賴氨酸分枝二聚多肽對(duì)創(chuàng)傷有快速止血功能，可制備成適合于臨床使用的快速止血藥物。

本發(fā)明中一些常用的縮寫(xiě)及術(shù)語(yǔ)具有以下含義：

fmoc:芴甲氧羰基

tbu:叔丁基

hobt：1-羥基苯并三氮唑

dic：n,n'-二異丙基碳二亞胺

tfa:三氟醋酸

meoh:甲醇

spps：固相多肽合成法

本發(fā)明室溫是指20-30℃。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：目前文獻(xiàn)報(bào)道的自組裝多肽均為單一直鏈的多肽分子。本發(fā)明提供了一種新型的兩親型自組裝多肽，通過(guò)賴氨酸分枝形成的二聚多肽，其分子間通過(guò)非共價(jià)鍵相互作用自發(fā)組合，由此而形成的自組裝結(jié)構(gòu)有更多的結(jié)構(gòu)靈活性和多樣性，促進(jìn)自組裝多肽在納米生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。本發(fā)明賴氨酸分枝二聚多肽在鹽離子、細(xì)胞培養(yǎng)基等生理環(huán)境下能自組裝形成納米纖維水凝膠，可在制備納米阻隔材料中應(yīng)用，是一種高效的鎖水性物質(zhì)，可在制備鎖水保濕劑中應(yīng)用；對(duì)創(chuàng)傷有快速止血功能，可制備成適合于臨床使用的快速止血藥物。

(四)附圖說(shuō)明

圖1：實(shí)施例1制備的賴氨酸分枝二聚多肽的高效液相色譜(hplc)檢測(cè)。

圖2：實(shí)施例1制備的賴氨酸分枝二聚多肽的質(zhì)譜檢測(cè)。

圖3：肝臟創(chuàng)傷出血模型(氯化鈉注射液參照)。

圖4：肝臟創(chuàng)傷出血模型(1％賴氨酸分枝二聚多肽(實(shí)施例1制備)溶液供試品)。

圖5：股四頭肌出血模型(氯化鈉注射液參照)。

圖6：股四頭肌出血模型(1％賴氨酸分枝二聚多肽(實(shí)施例1制備)溶液供試品)。

(五)具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

實(shí)施例1賴氨酸分枝二聚多肽1的制備

1、材料

fmoc-rinkamidembharesin(笏甲氧羰基-rink酰胺樹(shù)脂，購(gòu)自chem-impexinternational,inc.catalog#06752)

fmoc-lys(fmoc)-oh(笏甲氧羰基-ε-笏甲氧羰基-賴氨酸)

fmoc-ala-oh(笏甲氧羰基-丙氨酸)

fmoc-asp(otbu)-oh(笏甲氧羰基-o-叔丁基-天冬氨酸)

fmoc-arg(pbf)-oh(笏甲氧羰基-γ-2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺?；?精氨酸)

hobt(1-羥基苯并三氮唑)

dic(n,n-二異丙基碳二亞胺)

2、具體合成步驟：

所述多肽的合成采用從fmoc氨基樹(shù)脂和氨基酸以逐步偶聯(lián)的固相多肽合成法進(jìn)行，工藝步驟如下：

步驟1.fmoc-rinkamidembha樹(shù)脂(8mmol，20g，取代度0.4mmol/g)置于一多肽合成反應(yīng)器中，用n,n-二甲基甲酰胺(300ml)溶脹30分鐘。懸浮液過(guò)濾，去除濾液，將體積濃度20％哌啶/n,n-二甲基甲酰胺(300ml)加入到樹(shù)脂中并攪拌30分鐘以除去fmoc保護(hù)基。fmoc去保護(hù)后，將樹(shù)脂用n,n-二甲基甲酰胺徹底洗滌，將洗滌后的肽樹(shù)脂置于多肽合成反應(yīng)器中，準(zhǔn)備用于步驟2偶聯(lián)。

步驟2.將11.2gfmoc-lys(fmoc)-oh(笏甲氧羰基-ε-笏甲氧羰基-賴氨酸)，3.67g1-羥基苯并三氮唑(hobt)和3.79mln,n-二異丙基碳二亞胺(dic)溶于200ml的n,n-二甲基甲酰胺中，使氨基酸在0-10攝氏度活化20分鐘?；罨?，將溶液加入到步驟1含有肽樹(shù)脂的多肽合成反應(yīng)器中，室溫下偶聯(lián)反應(yīng)1-4個(gè)小時(shí)，或直至茚三酮檢測(cè)結(jié)果為陰性。將反應(yīng)液過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺洗滌肽樹(shù)脂。然后肽樹(shù)脂在體積濃度20％哌啶/n,n-二甲基甲酰胺溶液中攪拌30分鐘以除去fmoc保護(hù)基。fmoc去保護(hù)后，將樹(shù)脂用n,n-二甲基甲酰胺徹底洗滌，去除洗滌液，將洗滌后的肽樹(shù)脂置于多肽合成反應(yīng)器中，并準(zhǔn)備用于步驟3偶聯(lián)。

步驟3.將14.9gfmoc-ala-oh(笏甲氧羰基-丙氨酸)，7.35g1-羥基苯并三氮唑(hobt)和7.57mln,n-二異丙基碳二亞胺(dic)溶于200ml的n,n-二甲基甲酰胺中，使氨基酸在0-10攝氏度活化20分鐘?；罨?，將溶液加入到步驟2含有肽樹(shù)脂的多肽合成反應(yīng)器中，室溫下偶聯(lián)反應(yīng)1-4個(gè)小時(shí)，或直至茚三酮檢測(cè)結(jié)果為陰性。將反應(yīng)液過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺洗滌肽樹(shù)脂。然后肽樹(shù)脂在體積濃度20％哌啶/n,n-二甲基甲酰胺溶液中攪拌30分鐘以除去fmoc保護(hù)基。fmoc去保護(hù)后，將樹(shù)脂用n,n-二甲基甲酰胺徹底洗滌，將洗滌后的肽樹(shù)脂置于多肽合成反應(yīng)器中，并準(zhǔn)備用于步驟4偶聯(lián)。

步驟4.將19.7gfmoc-asp(otbu)-oh(笏甲氧羰基-o-叔丁基-天冬氨酸)，7.35g1-羥基苯并三氮唑(hobt)和7.57mln,n-二異丙基碳二亞胺(dic)溶于200ml的n,n-二甲基甲酰胺中，使氨基酸在0-10攝氏度活化20分鐘?；罨?，將溶液加入到步驟3含有肽樹(shù)脂的反應(yīng)器中，室溫下偶聯(lián)反應(yīng)1-4個(gè)小時(shí)，或直至茚三酮檢測(cè)結(jié)果為陰性。將反應(yīng)液過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺洗滌肽樹(shù)脂。然后肽樹(shù)脂在體積濃度20％哌啶/n,n-二甲基甲酰胺溶液中攪拌30分鐘以除去fmoc保護(hù)基。fmoc去保護(hù)后，將樹(shù)脂用n,n-二甲基甲酰胺徹底洗滌，將洗滌后的肽樹(shù)脂置于多肽合成反應(yīng)器中，并準(zhǔn)備用于步驟5偶聯(lián)。

步驟5.將14.9gfmoc-ala-oh(笏甲氧羰基-丙氨酸)，7.35g1-羥基苯并三氮唑(hobt)和7.57mln,n-二異丙基碳二亞胺(dic)溶于200ml的n,n-二甲基甲酰胺中，使氨基酸在0-10攝氏度活化20分鐘?；罨螅瑢⑷芤杭尤氲讲襟E4含有肽樹(shù)脂的反應(yīng)器中，室溫下偶聯(lián)反應(yīng)1-4個(gè)小時(shí)，或直至茚三酮檢測(cè)結(jié)果為陰性。將反應(yīng)液過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺洗滌肽樹(shù)脂。然后肽樹(shù)脂在體積濃度20％哌啶/n,n-二甲基甲酰胺溶液中攪拌30分鐘以除去fmoc保護(hù)基。fmoc去保護(hù)后，將樹(shù)脂用n,n-二甲基甲酰胺徹底洗滌，將洗滌后的肽樹(shù)脂置于多肽合成反應(yīng)器中，并準(zhǔn)備用于步驟6偶聯(lián)。

步驟6.將31.1gfmoc-arg(pbf)-oh(笏甲氧羰基-γ-2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺?；?精氨酸)，7.35g1-羥基苯并三氮唑(hobt)和7.57mln,n-二異丙基碳二亞胺(dic)溶于200ml的n,n-二甲基甲酰胺中，使氨基酸在0-10攝氏度活化20分鐘?；罨?，將溶液加入到步驟5含有肽樹(shù)脂的反應(yīng)器中，室溫下偶聯(lián)反應(yīng)1-4個(gè)小時(shí)，或直至茚三酮檢測(cè)結(jié)果為陰性。將反應(yīng)液過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺洗滌肽樹(shù)脂。然后肽樹(shù)脂在體積濃度20％哌啶/n,n-二甲基甲酰胺溶液中攪拌30分鐘以除去fmoc保護(hù)基。fmoc去保護(hù)后，將樹(shù)脂用n,n-二甲基甲酰胺徹底洗滌，將洗滌后的肽樹(shù)脂置于多肽合成反應(yīng)器中，并準(zhǔn)備用于步驟7偶聯(lián)。

步驟7.將14.9gfmoc-ala-oh(笏甲氧羰基-丙氨酸)，7.35g1-羥基苯并三氮唑(hobt)和7.57mln,n-二異丙基碳二亞胺(dic)溶于200ml的n,n-二甲基甲酰胺中，使氨基酸在0-10攝氏度活化20分鐘?；罨螅瑢⑷芤杭尤氲讲襟E6含有肽樹(shù)脂的反應(yīng)器中，室溫下偶聯(lián)反應(yīng)1-4個(gè)小時(shí)，或直至茚三酮檢測(cè)結(jié)果為陰性。將樹(shù)脂懸浮液過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺洗滌肽樹(shù)脂。然后肽樹(shù)脂在體積濃度20％哌啶/n,n-二甲基甲酰胺溶液中攪拌30分鐘以除去fmoc保護(hù)基。fmoc去保護(hù)后，將樹(shù)脂用n,n-二甲基甲酰胺徹底洗滌，將洗滌后的肽樹(shù)脂置于多肽合成反應(yīng)器中，并準(zhǔn)備用于步驟8偶聯(lián)。

步驟8.將19.7gfmoc-asp(otbu)-oh(笏甲氧羰基-o-叔丁基-天冬氨酸)，7.35g1-羥基苯并三氮唑(hobt)和7.57mln,n-二異丙基碳二亞胺(dic)溶于200ml的n,n-二甲基甲酰胺中，使氨基酸在0-10攝氏度活化20分鐘?；罨?，將溶液加入到步驟7含有肽樹(shù)脂的反應(yīng)器中，室溫下偶聯(lián)反應(yīng)1-4個(gè)小時(shí)，或直至茚三酮檢測(cè)結(jié)果為陰性。將樹(shù)脂懸浮液過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺洗滌肽樹(shù)脂。然后肽樹(shù)脂在體積濃度20％哌啶/n,n-二甲基甲酰胺溶液中攪拌30分鐘以除去fmoc保護(hù)基。fmoc去保護(hù)后，將樹(shù)脂用n,n-二甲基甲酰胺徹底洗滌，將洗滌后的肽樹(shù)脂置于多肽合成反應(yīng)器中，并準(zhǔn)備用于步驟9偶聯(lián)。

步驟9.將14.9gfmoc-ala-oh(笏甲氧羰基-丙氨酸)，7.35g1-羥基苯并三氮唑(hobt)和7.57mln,n-二異丙基碳二亞胺(dic)溶于200ml的n,n-二甲基甲酰胺中，使氨基酸在0-10攝氏度活化20分鐘?；罨?，將溶液加入到步驟8含有的肽樹(shù)脂的反應(yīng)器中，室溫下偶聯(lián)反應(yīng)1-4個(gè)小時(shí)，或直至茚三酮檢測(cè)結(jié)果為陰性。將樹(shù)脂懸浮液過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺洗滌肽樹(shù)脂。然后肽樹(shù)脂在體積濃度20％哌啶/n,n-二甲基甲酰胺溶液中攪拌30分鐘以除去fmoc保護(hù)基。fmoc去保護(hù)后，將樹(shù)脂用n,n-二甲基甲酰胺徹底洗滌，將洗滌后的肽樹(shù)脂置于多肽合成反應(yīng)器中，并準(zhǔn)備用于步驟10偶聯(lián)。

步驟10.將31.1gfmoc-arg(pbf)-oh(笏甲氧羰基-γ-2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰基-精氨酸)，7.35g1-羥基苯并三氮唑(hobt)和7.57mln,n-二異丙基碳二亞胺(dic)溶于200ml的n,n-二甲基甲酰胺中，使氨基酸在0-10攝氏度活化20分鐘?；罨螅瑢⑷芤杭尤氲讲襟E9含有肽樹(shù)脂的反應(yīng)器中，室溫下偶聯(lián)反應(yīng)1-4個(gè)小時(shí)，或直至茚三酮檢測(cè)結(jié)果為陰性。將樹(shù)脂懸浮液過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺洗滌肽樹(shù)脂。然后肽樹(shù)脂在體積濃度20％哌啶/n,n-二甲基甲酰胺溶液中攪拌30分鐘以除去fmoc保護(hù)基。fmoc去保護(hù)后，將樹(shù)脂用n,n-二甲基甲酰胺徹底洗滌，將洗滌后的肽樹(shù)脂置于多肽合成反應(yīng)器中，并準(zhǔn)備用于步驟11偶聯(lián)。

步驟11.將14.9gfmoc-ala-oh(笏甲氧羰基-丙氨酸)，7.35g1-羥基苯并三氮唑(hobt)和7.57mln,n-二異丙基碳二亞胺(dic)溶于200ml的n,n-二甲基甲酰胺中，使氨基酸在0-10攝氏度活化20分鐘。活化后，將溶液加入到步驟10含有肽樹(shù)脂的反應(yīng)器中，室溫下偶聯(lián)反應(yīng)1-4個(gè)小時(shí)，或直至茚三酮檢測(cè)結(jié)果為陰性。將樹(shù)脂懸浮液過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺洗滌肽樹(shù)脂。然后肽樹(shù)脂在體積濃度20％哌啶/n,n-二甲基甲酰胺溶液中攪拌30分鐘以除去fmoc保護(hù)基。fmoc去保護(hù)后，將樹(shù)脂用n,n-二甲基甲酰胺徹底洗滌，將洗滌后的肽樹(shù)脂置于多肽合成反應(yīng)器中，并準(zhǔn)備用于步驟12偶聯(lián)。

步驟12.將19.7gfmoc-asp(otbu)-oh(笏甲氧羰基-o-叔丁基-天冬氨酸)，7.35g1-羥基苯并三氮唑(hobt)和7.57mln,n-二異丙基碳二亞胺(dic)溶于200ml的n,n-二甲基甲酰胺中，使氨基酸在0-10攝氏度活化20分鐘?；罨?，將溶液加入到步驟11含有肽樹(shù)脂的反應(yīng)器中，室溫下偶聯(lián)反應(yīng)1-4個(gè)小時(shí)，或直至茚三酮檢測(cè)結(jié)果為陰性。將樹(shù)脂懸浮液過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺洗滌肽樹(shù)脂。然后肽樹(shù)脂在體積濃度20％哌啶/n,n-二甲基甲酰胺溶液中攪拌30分鐘以除去fmoc保護(hù)基。fmoc去保護(hù)后，將樹(shù)脂用n,n-二甲基甲酰胺徹底洗滌，將洗滌后的肽樹(shù)脂置于多肽合成反應(yīng)器中，并準(zhǔn)備用于步驟13偶聯(lián)。

步驟13.將14.9gfmoc-ala-oh(笏甲氧羰基-丙氨酸)，7.35g1-羥基苯并三氮唑(hobt)和7.57mln,n-二異丙基碳二亞胺(dic)溶于200ml的n,n-二甲基甲酰胺中，使氨基酸在0-10攝氏度活化20分鐘。活化后，將溶液加入到步驟12含有肽樹(shù)脂的反應(yīng)器中，室溫下偶聯(lián)反應(yīng)1-4個(gè)小時(shí)，或直至茚三酮檢測(cè)結(jié)果為陰性。將樹(shù)脂懸浮液過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺洗滌肽樹(shù)脂。然后肽樹(shù)脂在體積濃度20％哌啶/n,n-二甲基甲酰胺溶液中攪拌30分鐘以除去fmoc保護(hù)基。fmoc去保護(hù)后，將樹(shù)脂用n,n-二甲基甲酰胺徹底洗滌，將洗滌后的肽樹(shù)脂置于多肽合成反應(yīng)器中，并準(zhǔn)備用于步驟14偶聯(lián)。

步驟14.將31.1gfmoc-arg(pbf)-oh(笏甲氧羰基-γ-2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺?；?精氨酸)，7.35g1-羥基苯并三氮唑(hobt)和7.57mln,n-二異丙基碳二亞胺(dic)溶于200ml的n,n-二甲基甲酰胺中，使氨基酸在0-10攝氏度活化20分鐘?；罨?，將溶液加入到步驟13含有肽樹(shù)脂的反應(yīng)器中，室溫下偶聯(lián)反應(yīng)1-4個(gè)小時(shí)，或直至茚三酮檢測(cè)結(jié)果為陰性。將樹(shù)脂懸浮液過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺洗滌肽樹(shù)脂。然后肽樹(shù)脂在體積濃度20％哌啶/n,n-二甲基甲酰胺溶液中攪拌30分鐘以除去fmoc保護(hù)基。fmoc去保護(hù)后，將樹(shù)脂用n,n-二甲基甲酰胺徹底洗滌，將洗滌后的肽樹(shù)脂置于多肽合成反應(yīng)器中，并準(zhǔn)備用于步驟15偶聯(lián)。

步驟15.將體積濃度10％醋酸酐/5％n-甲基嗎啉/85％n,n-二甲基甲酰胺溶液(300ml)加入到步驟14含有肽樹(shù)脂的反應(yīng)器中進(jìn)行多肽乙?；舛耍覝叵屡悸?lián)反應(yīng)0.5-1小時(shí)，或直至茚三酮檢測(cè)結(jié)果為陰性。將樹(shù)脂懸浮液過(guò)濾并用n,n-二甲基甲酰胺洗滌五次，甲醇洗滌兩次。室溫真空下干燥后，得到肽樹(shù)脂。

將所得的肽樹(shù)脂懸浮在三氟醋酸切割液中，在室溫(25℃)下攪絆反應(yīng)2-5小時(shí)。過(guò)濾后，收集濾液并在乙醚中沉淀。將粗肽離心收集，用乙醚洗滌，并在室溫真空下干燥，得到多肽粗品。經(jīng)高效制備液相色譜純化，冷凍干燥即得式(1)所示的賴氨酸分枝二聚多肽(acradaradarada)2k-nh2)。高效液相色譜(hplc)檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1，根據(jù)圖1中的譜峰面積確定其純度達(dá)到了95％。質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果可確定其分子量為2709.8。

高效液相色譜(hplc)檢測(cè)：美國(guó)安捷倫公司agilent1200型高效液相色譜儀。采用水和乙腈混合溶劑作流動(dòng)相，c18分析色譜柱進(jìn)行反相色譜檢測(cè)。

質(zhì)譜檢測(cè)：美國(guó)熱電公司tsq型質(zhì)譜儀，esi電噴霧電離離子源。

實(shí)施例2賴氨酸分枝二聚多肽2

實(shí)施例2多肽的合成采用和實(shí)施例1相同的固相多肽合成法方法，從fmoc氨基樹(shù)脂首先連接fmoc-lys(fmoc)-oh，然后去除fmoc保護(hù)基和相應(yīng)的氨基酸逐步偶聯(lián)進(jìn)行合成，經(jīng)過(guò)相同的切割反應(yīng)及反相制備色譜純化，凍干得到賴氨酸分枝二聚多肽2。所采用的樹(shù)脂、氨基酸原料、偶聯(lián)試劑如下：

fmoc-rinkamidembharesin(笏甲氧羰基-rink酰胺樹(shù)脂，購(gòu)自chem-impexinternational,inc.catalog#06752)

fmoc-lys(fmoc)-oh(笏甲氧羰基-ε-笏甲氧羰基-賴氨酸)

fmoc-lys(boc)-oh(笏甲氧羰基-ε-叔丁氧羰基-賴氨酸)

fmoc-ala-oh(笏甲氧羰基-丙氨酸)

fmoc-glu(otbu)-oh(笏甲氧羰基-o-叔丁基-谷氨酸)

hobt(1-羥基苯并三氮唑)

dic(n,n-二異丙基碳二亞胺)。

實(shí)施例3賴氨酸分枝二聚多肽3

實(shí)施例3多肽的合成采用和實(shí)施例1相同的固相多肽合成方法，從fmoc氨基樹(shù)脂首先連接fmoc-lys(fmoc)-oh，然后去除fmoc保護(hù)基和相應(yīng)的氨基酸逐步偶聯(lián)進(jìn)行合成，經(jīng)過(guò)相同的切割反應(yīng)及反相制備色譜純化，凍干得到賴氨酸分枝二聚多肽3。所采用的樹(shù)脂、氨基酸原料、偶聯(lián)試劑如下：

fmoc-rinkamidembharesin(笏甲氧羰基-rink酰胺樹(shù)脂，購(gòu)自chem-impexinternational,inc.catalog#06752)

fmoc-lys(fmoc)-oh(笏甲氧羰基-ε-笏甲氧羰基-賴氨酸)

fmoc-lys(boc)-oh(笏甲氧羰基-ε-叔丁氧羰基-賴氨酸)

fmoc-ile-oh(笏甲氧羰基-異亮氨酸)

fmoc-glu(otbu)-oh(笏甲氧羰基-o-叔丁基-谷氨酸)

hobt(1-羥基苯并三氮唑)

dic(n,n-二異丙基碳二亞胺)。

實(shí)施例4賴氨酸分枝二聚多肽4

實(shí)施例4多肽的合成采用和實(shí)施例1相同的固相多肽合成方法，從fmoc氨基樹(shù)脂首先連接fmoc-lys(dde)-oh，然后去除fmoc保護(hù)基和相應(yīng)的氨基酸的逐步偶聯(lián)進(jìn)行合成。在樹(shù)脂上首先完成aceikieikieiki的連接后，用2％水合并肼的dmf溶液攪拌脫去賴氨酸側(cè)鏈氨基上的dde保護(hù)基，然后再逐個(gè)偶聯(lián)相應(yīng)的氨基酸完成acradaradarada的連接。經(jīng)過(guò)相同的切割反應(yīng)及反相制備色譜純化，凍干得到賴氨酸分枝二聚多肽4。所采用的樹(shù)脂、氨基酸原料、偶聯(lián)試劑如下：

fmoc-rinkamidembharesin(笏甲氧羰基-rink酰胺樹(shù)脂，購(gòu)自chem-impexinternational,inc.catalog#06752

fmoc-lys(dde)-oh(笏甲氧羰基-ε-dde-賴氨酸)

fmoc-lys(boc)-oh(笏甲氧羰基-ε-叔丁氧羰基-賴氨酸)

fmoc-ala-oh(笏甲氧羰基-丙氨酸)

fmoc-ile-oh(笏甲氧羰基-異亮氨酸)

fmoc-asp(otbu)-oh(笏甲氧羰基-o-叔丁基-天冬氨酸)

fmoc-glu(otbu)-oh(笏甲氧羰基-o-叔丁基-谷氨酸)

fmoc-arg(pbf)-oh(笏甲氧羰基-γ-2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺?；?精氨酸)

hobt(1-羥基苯并三氮唑)

dic(n,n-二異丙基碳二亞胺)。

實(shí)施例5賴氨酸分枝二聚肽不同條件下形成水凝膠及其鎖水性能

1、在不同鹽作用下形成水凝膠

(1)將實(shí)施例1所得賴氨酸分枝二聚肽1用18.2mω·cm的純凈水制備成質(zhì)量濃度為1％的賴氨酸分枝二聚多肽溶液。

(2)稱取氯化鈉或氯化鉀或磷酸鈉加入到純凈水中配制成0.15mol/l鹽溶液，鹽溶液的濃度范圍在0.01-1mol/l皆可。

(3)加入等體積的鹽溶液到賴氨酸分枝二聚多肽溶液中，自組裝時(shí)間24小時(shí)。同樣條件下，將實(shí)施例2-4制備的賴氨酸分枝二聚肽替換賴氨酸分枝二聚肽1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，實(shí)施例1-4制備的賴氨酸分枝二聚肽均能形成水凝膠，在肉眼下為透明膠體。

2、賴氨酸分枝二聚肽在細(xì)胞生長(zhǎng)的生理環(huán)境下形成水凝膠

(1)取含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基滴入96孔板，每孔100μl。

(2)將實(shí)施例1所得賴氨酸分枝二聚肽1用18.2mω·cm的純凈水制備成質(zhì)量濃度為1％的賴氨酸分枝二聚多肽溶液，取100μl加入步驟(1)的96孔板中，并快速混勻；

(3)置于37攝氏度，5％體積比的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。同樣條件下，將實(shí)施例2-4制備的賴氨酸分枝二聚肽替換賴氨酸分枝二聚肽1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，實(shí)施例1-4制備的賴氨酸分枝二聚肽均能形成水凝膠，在肉眼下為透明膠體。

3、鎖水性能

取10mg實(shí)施例1制備的賴氨酸分枝二聚多肽1溶于1ml18.2mω·cm的純凈水中，可形成穩(wěn)定水凝膠，其中多肽與水的質(zhì)量比為1:99，因此是一種高效的鎖水性物質(zhì)。

同樣條件下，實(shí)施例2-4制備的賴氨酸分枝二聚多肽替換賴氨酸分枝二聚肽1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，實(shí)施例1-4制備的賴氨酸分枝二聚肽均能形成穩(wěn)定的水凝膠。

實(shí)施例6:賴氨酸分枝二聚肽對(duì)大鼠肝創(chuàng)傷出血以及股四頭肌損傷出血的止血效果

1、供試品

由實(shí)施例1所得賴氨酸分枝二聚肽1

2、對(duì)照品

名稱:氯化鈉注射液

規(guī)格:250ml:2.25g

3、溶媒及供試品配制方法

溶媒名稱：超純水，現(xiàn)制現(xiàn)用

溶媒質(zhì)量要求：取水時(shí)電阻率為18.2mω·cm

供試品溶液：精密稱取供試品50mg，用移液器加入5ml超純水，配制成質(zhì)量濃度為1％的賴氨酸分枝二聚多肽溶液。

4、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

大鼠，crl:cd(sd)，spf級(jí)

體重范圍:250-400g

周齡：約10-12周

來(lái)源：北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司

5、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法

大鼠以3％戊巴比妥鈉溶液(45mg/kg)腹腔注射麻醉。

肝臟創(chuàng)傷出血造模：腹部近劍突部位剃毛，消毒后用剪刀在手術(shù)區(qū)域切開(kāi)腹部，暴露肝臟。用10號(hào)手術(shù)刀在肝臟左葉做一字型切口，切口長(zhǎng)約1cm，深約0.5cm，造成肝臟創(chuàng)傷出血模型。

股四頭肌損傷出血造模：大鼠右側(cè)股四頭肌剃毛，消毒后用剪刀在手術(shù)區(qū)域切開(kāi)皮膚，分離皮膚和肌肉，暴露股四頭肌(外側(cè)頭部分)。用10號(hào)手術(shù)刀沿股骨下緣在股四頭肌上做一字型接口，切口長(zhǎng)約2cm，深約1cm，切口以切破股靜脈為限，造成股四頭肌損傷出血模型。

給藥：切開(kāi)創(chuàng)口后，迅速將供試品溶液或氯化鈉注射液均勻涂敷于創(chuàng)口處，用于創(chuàng)口出血控制。給藥后，計(jì)時(shí)器記錄完全止血時(shí)間。完全止血時(shí)間以靜置狀態(tài)下創(chuàng)口不再滲血為限。

本動(dòng)物試驗(yàn)選擇肝臟創(chuàng)傷出血模型和股四頭肌出血模型作為供試品(由實(shí)施例1所得賴氨酸分枝二聚肽1)的止血效果探索，同時(shí)選用氯化鈉注射液作為對(duì)照。試驗(yàn)結(jié)果表明，質(zhì)量濃度為1％的賴氨酸分枝二聚多肽溶液在肝臟創(chuàng)傷出血模型和股四頭肌出血模型中均有快速止血效果，完全止血時(shí)間均少于10秒，止血時(shí)間短。氯化鈉注射液參照組出血時(shí)間均大于150秒。

同樣條件下，將實(shí)施例1所得賴氨酸分枝二聚肽1分別替換為實(shí)施例2-4制備的賴氨酸分枝二聚肽，試驗(yàn)結(jié)果表明，質(zhì)量濃度為1％的賴氨酸分枝二聚多肽溶液在肝臟創(chuàng)傷出血模型和股四頭肌出血模型中均有快速止血效果，完全止血時(shí)間均少于10秒，止血時(shí)間短。氯化鈉注射液參照組出血時(shí)間均大于150秒。

因此，本發(fā)明所述的賴氨酸分枝二聚多肽對(duì)創(chuàng)傷有快速止血功能，可制備成適合于臨床使用的快速止血藥物。