本發(fā)明涉及食源性致病菌檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種食源性致病菌可視化檢測探針及可視化檢測方法。

背景技術(shù)：

食源性致病菌的檢測手段多種多樣，可概括分為以下三大類：

1、傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，通過細(xì)菌的選擇性分離，將平板上肉眼可見的特征性菌落進(jìn)行確認(rèn)，并對該菌落分離物采用三糖鐵瓊脂、賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)、蛋白胨水、尿素瓊脂、氰化鉀等進(jìn)行生化試驗(yàn)和多價菌體抗原（o）、多價鞭毛抗原（h）等血清學(xué)檢測，以最終做出鑒定。一般全過程需時至少4～7天，才能得出明確的診斷結(jié)果。雖然，此方法耗時繁瑣，但因其成本較低且較為穩(wěn)定，已作為檢驗(yàn)檢疫行業(yè)的金標(biāo)準(zhǔn)。

2、基于免疫學(xué)的檢測方法，一般作為初篩方法，所檢測出的陽性樣品最終還需經(jīng)過傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法進(jìn)行進(jìn)一步確證，并且受到環(huán)境因素影響較大，批次之間的結(jié)果可能差異較大，其檢測靈敏度也往往較低。膠體金免疫層析技術(shù)在快速檢測上有自身的優(yōu)勢，其方法得到了美國官定分析化學(xué)家協(xié)會（aoacinternational）官方認(rèn)可，能夠?qū)悠分械纳抽T氏菌、大腸桿菌o157等進(jìn)行快速的檢測。該法比起傳統(tǒng)的培養(yǎng)法、elisa等更加地快捷，但其靈敏度不如pcr方法，且基于免疫學(xué)方法的檢測，受環(huán)境、樣品基質(zhì)等影響較大，只能作為一種初篩方法。

3、基于分子生物學(xué)的檢測方法，本方法首先需要對檢測樣品進(jìn)行核酸提取，即便有全自動核酸提取儀的應(yīng)用，在進(jìn)行大量樣品的前處理過程中仍然有些繁瑣，而且這種儀器價格昂貴，操作起來不夠簡單，應(yīng)用起來有諸多不便。pcr技術(shù)在食源性致病菌檢測是比較成功的，已開發(fā)出一系列商品試劑盒，如霍亂弧菌、沙門氏菌、志賀氏菌、蠟樣芽胞桿菌、大腸埃希氏菌等pcr檢測試劑盒，部分已經(jīng)得到aoac官方認(rèn)可。除常規(guī)pcr技術(shù)外，多重?zé)晒鈖cr技術(shù)的應(yīng)用也日漸增加。

目前，檢測食源性致病菌的方法雖有多種，但是在易操作、靈敏度等方面仍然存在一些不足：如需要貴重的儀器、繁瑣的操作步驟、復(fù)雜的樣品前處理、檢測周期比較長、較高的假陽性、實(shí)際樣品檢測存在靈敏度不足等。尤其對于基層實(shí)驗(yàn)室，還停留在傳統(tǒng)選擇性培養(yǎng)方法對致病菌進(jìn)行檢測，缺少一種簡便準(zhǔn)確、高靈敏的快速檢測技術(shù)。

因此，毋需繁瑣的樣品前處理，即能實(shí)現(xiàn)致病菌的快速、高靈敏、高特異性檢測，且不需要貴重的儀器，能在基層實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行推廣應(yīng)用的快速檢測方法成為了本領(lǐng)域研究的重點(diǎn)方向。若要解決上述問題需具備幾個因素：1）樣品的簡化處理，無需進(jìn)行核酸的提取與純化；2）檢測方法的高靈敏與高特異；3）能夠同時檢測多種致病菌；4）無需貴重儀器，能夠在基層實(shí)驗(yàn)室開展相關(guān)工作。

2007年，mitani等在《naturemethods》上報(bào)道了一種新型的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，即smartamp技術(shù)（smartamplificationprocesstechnology），它采用5條引物和dna錯配結(jié)合蛋白（muts）進(jìn)行目標(biāo)產(chǎn)物的擴(kuò)增，能保證擴(kuò)增產(chǎn)物的“絕對特異”，目前該技術(shù)主要用于單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphisms，snps）分型以及突變的檢測。2013年，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院劉雪林、宋宏彬等人發(fā)表了一篇介紹smartamp技術(shù)的綜述，該文指出在食物、環(huán)境中病原體檢測方法，雖然尚未見相關(guān)研究報(bào)道，但smartamp方法的原理同樣適用。smartamp技術(shù)從樣品的粗制備到擴(kuò)增的結(jié)束，整個檢測過程20～60分鐘，不會出現(xiàn)非特異性，只要有擴(kuò)增信號就表示目標(biāo)物的存在，而且smartamp技術(shù)的擴(kuò)增能力是普通pcr技術(shù)的100倍^[14,15]。其“絕對”特異性歸功于引物設(shè)計(jì)的獨(dú)特性（5條引物tp、fp、op1、op2、bp），而dna錯配結(jié)合蛋白（muts）更是加強(qiáng)了擴(kuò)增過程的絕對特異，而不會繼續(xù)擴(kuò)增造成非特異信號的出現(xiàn)。

smartamp技術(shù)與其他類型的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，如環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediatedisothermalamplification，lamp）、依賴核酸序列的擴(kuò)增（nucleicacidsequence-basedamplification，nasba）、鏈替代擴(kuò)增（stranddisplacementamplification，sda）、滾環(huán)擴(kuò)增（rollingcircleamplification，rca）等是完全不同的概念。和smartamp技術(shù)最為相似的就是lamp等溫?cái)U(kuò)增，smartamp技術(shù)最大的優(yōu)勢是可避免引物二聚體的出現(xiàn)，使背景信號降到最低，達(dá)到理論上的“絕對”特異，而lamp技術(shù)使用2個tp引物對，造成產(chǎn)生啞鈴狀的產(chǎn)物，易造成引物二聚體。當(dāng)前的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)已廣泛的應(yīng)用到基于核酸模板的各種類型的檢測技術(shù)中，但始終和常規(guī)pcr一樣就是對模板純度要求相對較高，同樣會產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增等問題，而smartamp技術(shù)對樣品質(zhì)量要求低，dna只需簡單純化，甚至不用純化，它能彌補(bǔ)對以上常規(guī)類型等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的不足。

傳統(tǒng)的smartamp技術(shù)是采用熒光染料，直接觀察檢測信號。雖然smartamp技術(shù)可以最大程度上避免引物二聚體的產(chǎn)生，但遇到復(fù)雜的樣品基體，采用熒光染料模式就易產(chǎn)生假陽，導(dǎo)致檢測結(jié)果準(zhǔn)確性不足。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明實(shí)施例要解決的技術(shù)問題在于，提供一種食源性致病菌可視化檢測探針，以簡化檢測流程，并提高檢測效率、靈敏度及準(zhǔn)確性。

本發(fā)明實(shí)施例進(jìn)一步要解決的技術(shù)問題在于，提供一種食源性致病菌可視化檢測方法，以簡化檢測流程，并提高檢測效率、靈敏度及準(zhǔn)確性。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明實(shí)施例采用的技術(shù)方案是：提供一種食源性致病菌可視化檢測探針，包括：

在預(yù)先選定的作為目標(biāo)菌候選檢測位點(diǎn)的基因的第一區(qū)域設(shè)計(jì)及合成的smartamp引物探針，所述引物探針的5’端引入有第一活性基團(tuán)并通過所述第一活性基團(tuán)連接金納米粒子以及預(yù)先確定的與所述目標(biāo)菌相對應(yīng)的熒光粒子；以及

在預(yù)先選定的作為目標(biāo)菌候選檢測位點(diǎn)的基因的第二區(qū)域設(shè)計(jì)及合成的熒光編碼納米探針，所述熒光編碼納米探針的5’端引入有第二活性基團(tuán)并通過所述第二活性基團(tuán)連接金納米粒子以及預(yù)先確定的與所述目標(biāo)菌相對應(yīng)的熒光納米粒子。

進(jìn)一步地，在所述候選檢測位點(diǎn)的基因的設(shè)計(jì)熒光編碼納米探針的第二區(qū)域設(shè)計(jì)有多個熒光編碼納米探針結(jié)合位點(diǎn)，在每一個結(jié)合位點(diǎn)均設(shè)計(jì)及合成一個熒光編碼納米探針而構(gòu)成多位點(diǎn)熒光編碼納米探針。

進(jìn)一步地，所述第一活性基團(tuán)和第二活性基團(tuán)選自如下基團(tuán)：氨基、巰基或羧基。

進(jìn)一步地，所述多位點(diǎn)熒光編碼納米探針的堿基數(shù)為10-30個。

進(jìn)一步地，所述熒光納米粒子采用稀土熒光納米粒子。

另一方面，本發(fā)明實(shí)施例還提供一種食源性致病菌可視化檢測方法，包括：

預(yù)先選定作為目標(biāo)菌的食源性致病菌的候選檢測位點(diǎn)的基因；

在所述候選檢測位點(diǎn)的基因的不同區(qū)域分別設(shè)計(jì)及合成smartamp引物探針和熒光編碼納米探針獲得可視化檢測探針，所述smartamp引物探針的5’端借助于第一活性基團(tuán)連接金納米粒子以及預(yù)先確定的與所述目標(biāo)菌相對應(yīng)的熒光納米粒子，所述熒光編碼納米探針的5’端借助于第二活性基團(tuán)連接有金納米粒子以及預(yù)先確定的與所述目標(biāo)菌相對應(yīng)的熒光納米粒子；

利用可視化檢測探針對待檢樣品進(jìn)行smartamp擴(kuò)增，然后在紫外燈照射下進(jìn)行觀察，根據(jù)觀察到的熒光信號，確定所述待檢樣品中是否含有所述食源性致病菌；

在進(jìn)行擴(kuò)增后未能檢測出含有食源性致病菌時，進(jìn)一步利用所述可視化檢測探針與待檢樣品進(jìn)行雜交，然后再次在紫外燈照射下進(jìn)行觀察，根據(jù)觀察到的熒光信號，確定所述待檢樣品中是否含有所述食源性致病菌。

采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明實(shí)施例至少具有以下有益效果：本發(fā)明通過改進(jìn)smartamp技術(shù)，創(chuàng)新性引入熒光編碼納米探針，可實(shí)現(xiàn)食源性致病菌的超靈敏可視化檢測。通過在smartamp引物探針的5’端標(biāo)記熒光納米粒子，即作為引物也作為探針，這樣擴(kuò)增之后，其產(chǎn)物帶有熒光基團(tuán)，從而無需加入熒光染料即能通過紫外燈觀察結(jié)果。而在基因另一區(qū)域還設(shè)計(jì)熒光編碼納米探針，通過熒光編碼納米探針與待檢測樣品雜交，實(shí)現(xiàn)信號放大，可進(jìn)一步提高食源性致病菌檢測靈敏度以及檢測通量。本發(fā)明實(shí)施例通過兩次信號放大，建立一種新型的引物探針型smartamp-熒光編碼納米探針技術(shù)實(shí)現(xiàn)快速“pcr式”的信號放大，進(jìn)行超靈敏高特異的致病菌可視化檢測。

本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案能夠同步檢測食品中可能存在的多種食源性致病菌，可以將各致病菌對應(yīng)的探針分別在不同的反應(yīng)管實(shí)現(xiàn)檢測，也還可將各致病菌對應(yīng)的探針混在一起進(jìn)行檢測，由于無需繁瑣的樣本前處理過程，只需對檢測樣本進(jìn)行通用培養(yǎng)基的預(yù)擴(kuò)增，簡單處理即可進(jìn)行信號的放大，并且擴(kuò)增的過程即是檢測的過程，即該技術(shù)擴(kuò)增信號的“絕對特異”。因smartamp擴(kuò)增和可視化檢測無需貴重儀器，一般實(shí)驗(yàn)室的水浴鍋和紫外燈即可滿足，非常適合在基層實(shí)驗(yàn)室開展大量的致病菌篩查工作。

此外，本發(fā)明實(shí)施例設(shè)計(jì)引物探針及熒光編碼納米探針用于smartamp擴(kuò)增體系，因二次信號放大策略，對于含量極低的致病菌以能夠?qū)崿F(xiàn)可視化檢測。而對于含量較高的致病菌，無需與熒光編碼納米探針雜交，因基于引物探針型smartamp擴(kuò)增即可實(shí)現(xiàn)可視化檢測。

本發(fā)明實(shí)施例還可進(jìn)一步采用多位點(diǎn)多標(biāo)記在檢測區(qū)域形成多個熒光編碼納米探針，通過雜交能夠?qū)崿F(xiàn)終點(diǎn)產(chǎn)物的定量分析，能夠進(jìn)一步提高檢測靈敏度與檢測通量。以此衍生出的多位點(diǎn)納米探針設(shè)計(jì)理念，可推廣應(yīng)用到其他檢測體系，進(jìn)一步提高檢測靈敏度。

附圖說明

圖1是本發(fā)明食源性致病菌可視化檢測探針一個實(shí)施例的設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2是本發(fā)明食源性致病菌可視化檢測方法一個實(shí)施例的流程示意圖。

圖3是本發(fā)明食源性致病菌可視化檢測探針在設(shè)計(jì)過程中篩選候選引物中效果比較好的引物的流程示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，以下的示意性實(shí)施例及說明僅用來解釋本發(fā)明，并不作為對本發(fā)明的限定，而且，在不沖突的情況下，本發(fā)明中的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征可以相互結(jié)合。

如圖1所示，本發(fā)明一個實(shí)施例提供一種食源性致病菌可視化檢測探針，包括：

在預(yù)先選定的作為目標(biāo)菌候選檢測位點(diǎn)的基因的第一區(qū)域設(shè)計(jì)及合成的smartamp引物探針，所述smartamp引物探針的5’端引入有第一活性基團(tuán)并通過所述第一活性基團(tuán)連接金納米粒子以及預(yù)先確定的與所述目標(biāo)菌相對應(yīng)的熒光粒子；以及

在預(yù)先選定的作為目標(biāo)菌候選檢測位點(diǎn)的基因的第二區(qū)域設(shè)計(jì)及合成的熒光編碼納米探針，所述熒光編碼納米探針的5’端引入有第二活性基團(tuán)并通過所述第二活性基團(tuán)連接金納米粒子以及預(yù)先確定的與所述目標(biāo)菌相對應(yīng)的熒光納米粒子。

在具體實(shí)施例，所述第一活性基團(tuán)和第二活性基團(tuán)選自如下基團(tuán)：氨基、巰基或羧基。所述第一活性基團(tuán)和第二活性基團(tuán)可以為相同的基團(tuán)從而可以構(gòu)建完整的熒光探針。而所述熒光納米粒子采用稀土熒光納米粒子，而且，可以通過調(diào)整eu/tb的混合比例，實(shí)現(xiàn)顏色調(diào)整功能。

本發(fā)明通過改進(jìn)smartamp技術(shù)，創(chuàng)新性引入熒光編碼納米探針，可實(shí)現(xiàn)食源性致病菌的超靈敏可視化檢測。通過在smartamp引物探針的5’端標(biāo)記熒光納米粒子，即作為引物也作為探針，這樣擴(kuò)增之后，其產(chǎn)物帶有熒光基團(tuán)，從而無需加入熒光染料即能通過紫外燈觀察結(jié)果。而在基因另一區(qū)域還設(shè)計(jì)熒光編碼納米探針，通過熒光編碼納米探針與待檢測樣品雜交，實(shí)現(xiàn)信號放大，可進(jìn)一步提高食源性致病菌檢測靈敏度以及檢測通量。本發(fā)明實(shí)施例通過兩次信號放大，建立一種新型的引物探針型smartamp-熒光編碼納米探針技術(shù)實(shí)現(xiàn)快速“pcr式”的信號放大，進(jìn)行超靈敏高特異的致病菌可視化檢測。

在圖1中，示出有分別以腸出血性大腸桿菌（ecoli）o157:h7、沙門氏菌（salmonella）特異基因和單增李斯特菌（listeria）特異基因設(shè)計(jì)出對應(yīng)的可視化檢測探針的結(jié)構(gòu)示意圖。

結(jié)合圖1所示，在一個實(shí)施例中，在所述候選檢測位點(diǎn)的基因的設(shè)計(jì)熒光編碼納米探針的第二區(qū)域設(shè)計(jì)有多個熒光編碼納米探針結(jié)合位點(diǎn)，在每一個結(jié)合位點(diǎn)均設(shè)計(jì)及合成一個熒光編碼納米探針而構(gòu)成多位點(diǎn)熒光編碼納米探針。在具體實(shí)施時，所述多位點(diǎn)熒光編碼納米探針的堿基數(shù)可控制為10-30個，堿基數(shù)目具體根據(jù)與目的產(chǎn)物雜交溫度（45-60℃）來確定。堿基數(shù)少，可簡化探針的設(shè)計(jì)。

本實(shí)施例通過形成多個熒光編碼納米探針，在使用時通過雜交能夠?qū)崿F(xiàn)終點(diǎn)產(chǎn)物的定量分析，能夠進(jìn)一步提高檢測靈敏度與檢測通量。以此衍生出的多位點(diǎn)納米探針設(shè)計(jì)理念，可推廣應(yīng)用到其他檢測體系，進(jìn)一步提高檢測靈敏度。

另一方面，如圖2所示，本發(fā)明實(shí)施例還提供一種基于上述食源性致病菌可視化檢測探針的可視化檢測方法，包括：

s1，預(yù)先選定作為目標(biāo)菌的食源性致病菌的候選檢測位點(diǎn)的基因；

s2，在所述候選檢測位點(diǎn)的基因的不同區(qū)域分別設(shè)計(jì)及合成smartamp引物探針和熒光編碼納米探針獲得可視化檢測探針，所述smartamp引物探針的5’端借助于第一活性基團(tuán)連接金納米粒子以及預(yù)先確定的與所述目標(biāo)菌相對應(yīng)的熒光納米粒子，所述熒光編碼納米探針的5’端借助于第二活性基團(tuán)連接有金納米粒子以及預(yù)先確定的與所述目標(biāo)菌相對應(yīng)的熒光納米粒子；

s3，利用可視化檢測探針對待檢樣品進(jìn)行smartamp擴(kuò)增，然后在紫外燈照射下進(jìn)行觀察，根據(jù)觀察到的熒光信號，確定所述待檢樣品中是否含有所述食源性致病菌；

s4，在進(jìn)行擴(kuò)增后未能檢測出含有食源性致病菌時，進(jìn)一步利用所述可視化檢測探針與待檢樣品進(jìn)行雜交，然后再次在紫外燈照射下進(jìn)行觀察，根據(jù)觀察到的熒光信號，確定所述待檢樣品中是否含有所述食源性致病菌。

以下以實(shí)例方式說明本發(fā)明食源性致病菌可視化檢測探針的設(shè)計(jì)及合成過程以及進(jìn)行可視化檢測的方法步驟。

一、smartamp引物的設(shè)計(jì)與合成

1）選取常見食源性致病菌為研究對象，例如：沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌o157：h7、單增李斯特菌等，沙門氏菌參照gb/t4789.4、大腸桿菌o157:h7按照gb/t4789.6、單增李斯特菌按照gb/t4789.30方法進(jìn)行。

根據(jù)文獻(xiàn)的報(bào)道及ncbi公布的上述食源性致病菌的特異基因，選擇出目標(biāo)菌的候選檢測位點(diǎn)，即靶基因，例如：腸出血性大腸桿菌o157:h7的rfbe基因（編碼產(chǎn)物：o157抗原，genbank序列號s83460）、hlya基因（編碼產(chǎn)物：溶血素，genbank序列號x94129）、slt1基因（編碼產(chǎn)物：志賀樣毒素1，genbank序列號m19473）、slt2基因（編碼產(chǎn)物：志賀樣毒素2，genbank序列號z37725）等。部分食源性致病菌的常見靶基因及其引物序列可如下表所示：

2）根據(jù)選定的靶基因，采用smartamp引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)出候選引物。根據(jù)軟件評分可以獲得多對引物，從高分到低分依次獲得多對引物后，進(jìn)行初步的篩選。篩選到的引物及其互補(bǔ)序列設(shè)計(jì)成引物探針，在其5’端引入第一活性基團(tuán)，例如：氨基、巰基、羧基等，再通過所述第一活性基團(tuán)與金納米、熒光納米、傳統(tǒng)熒光染料（例如：fam、texasred、tamra等）結(jié)合。

二、多位點(diǎn)熒光編碼納米探針的設(shè)計(jì)與合成

多位點(diǎn)熒光編碼納米探針設(shè)計(jì)與smartamp引物設(shè)計(jì)區(qū)域一致，在選定靶基因后，即可在此靶基因區(qū)域進(jìn)行設(shè)計(jì)，多位點(diǎn)熒光編碼納米探針的設(shè)計(jì)比傳統(tǒng)的分子信標(biāo)、taqman探針更加簡單，可選地，多位點(diǎn)熒光編碼納米探針堿基數(shù)控制在10-30之內(nèi)，具體根據(jù)與目的產(chǎn)物雜交溫度（45-60℃）來確定其堿基數(shù)目。獲得其序列及其互補(bǔ)序列后，進(jìn)行熒光編碼納米探針合成，并在熒光編碼納米探針的5’端引入第二活性基團(tuán)，并通過所述第二活性基團(tuán)連接金納米及熒光納米。熒光編碼功能的實(shí)現(xiàn)通過多色熒光納米與所設(shè)計(jì)的多位點(diǎn)核酸序列進(jìn)行結(jié)合。多色熒光納米采用稀土熒光納米，通過調(diào)整eu/tb的混合比例，實(shí)現(xiàn)多色功能，針對沙門氏菌、大腸桿菌o157:h7、單增李斯特菌等致病菌的專屬基因設(shè)計(jì)出特異熒光編碼納米探針，在靶基因區(qū)域設(shè)計(jì)多個探針結(jié)合位點(diǎn)。多位點(diǎn)熒光編碼納米探針與待檢測樣品經(jīng)過雜交后，既能分離出熒光報(bào)告序列，從而能夠在紫外燈照射下，實(shí)現(xiàn)二次放大，能夠用肉眼觀察到的熒光信號，實(shí)現(xiàn)可視化檢測。

三、免核酸提取直接擴(kuò)增體系的研究

smartamp技術(shù)的優(yōu)勢在于“擴(kuò)增過程即檢測結(jié)果”，并且smartamp體系對樣本的純度要求不高，這樣對于食源性致病菌的檢測尤其重要，能夠大大簡化檢測步驟，增強(qiáng)技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用潛力。在smartamp技術(shù)優(yōu)勢之上，本發(fā)明實(shí)施例改進(jìn)的smartamp技術(shù)相比文獻(xiàn)報(bào)道的smartamp技術(shù)具有更好的環(huán)境耐受性。主要從以下幾個方面著手：1）在對上述引物對進(jìn)行簡單的試驗(yàn)后，選取擴(kuò)增速度較快、產(chǎn)物量較大的那組引物（tp、fp）作為直接擴(kuò)增體系的優(yōu)化引物，對每次試驗(yàn)采取經(jīng)純化的菌液dna及未經(jīng)純化的菌液dna分別進(jìn)行對比試驗(yàn)；2）以不同的pcr添加劑進(jìn)行分組，分為dmso組、betaine組、mgcl2組、海藻糖組、甲酰胺組、tween20組等，分別配制系列的稀釋濃度，進(jìn)行同步擴(kuò)增；3）取經(jīng)純化的菌液dna、未經(jīng)純化的菌液、經(jīng)簡單離心的菌液以及純水組進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)合上述的pcr添加劑，在簡單的tp、fp引物對條件下，采用正交法進(jìn)行試驗(yàn)的優(yōu)化。

四、smartamp技術(shù)檢測食源性致病菌單重體系

采用引物探針型smartamp檢測體系進(jìn)行初步驗(yàn)證，并檢測相對應(yīng)的致病菌：

1）對設(shè)計(jì)出的引物探針，進(jìn)行系列的試驗(yàn)，篩選出候選引物中效果比較好的引物進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)，如圖3所示，篩選的步驟包括：

a、候選目標(biāo)引物的篩選；

b、合成和試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的引物探針，在沒有taqmuts存在情況下，先對fp和tp引物進(jìn)行試驗(yàn)，之后測試所有引物，包括bp、op1、op2；

c、選擇產(chǎn)率和速度最快的引物進(jìn)行試驗(yàn)；

d、進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)條件，如果有必要從步驟(b)從新開始；

e、使用taqmuts，測試反應(yīng)體系的特異性；

f、回到步驟(d)，進(jìn)一步優(yōu)化體系的特異性。

2）結(jié)合直接擴(kuò)增體現(xiàn)試驗(yàn)的結(jié)果，把其優(yōu)化出較為理想的添加劑加入到smartamp體系中，包括所有的對引物存在的情況下，進(jìn)行初步的試驗(yàn)，并根據(jù)情況微調(diào)相應(yīng)的濃度。

五、多重同步檢測體系

通過引物探針及多位點(diǎn)熒光編碼納米探針?biāo)鶚?biāo)記的納米顏色不同，來實(shí)現(xiàn)不同種類致病菌的識別。如對于大腸桿菌o157:h7，其引物探針及多位點(diǎn)熒光編碼納米探針上均標(biāo)記有綠色熒光的納米粒子，而猝滅基團(tuán)均為金納米。不管是引物探針還是多位點(diǎn)熒光編碼納米探針，當(dāng)在靜態(tài)體系中時，因金納米與熒光納米距離較近而發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，綠色熒光被金納米猝滅。當(dāng)體系中產(chǎn)物擴(kuò)增，其產(chǎn)物結(jié)合能力更強(qiáng)于引物探針及多位點(diǎn)熒光編碼納米探針，從而使金納米脫離探針，使探針發(fā)光，實(shí)現(xiàn)檢測。

六、實(shí)際樣品檢測評價

對于所建立體系意在能夠用于實(shí)際工作之中，對樣品的實(shí)際檢測從驗(yàn)證靈敏度、特異性、重現(xiàn)性、準(zhǔn)確度等方面著手，采用經(jīng)典的選擇性培養(yǎng)法、熒光pcr法、自動熒光酶標(biāo)測定法mini-vidas進(jìn)行比對試驗(yàn)。與以往基于核酸擴(kuò)增的檢測技術(shù)不同，本發(fā)明實(shí)施例提供的smartamp引物探針結(jié)合多位點(diǎn)熒光編碼納米探針的技術(shù)方案能大大簡化樣品的前處理過程，在對樣品進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，進(jìn)行增菌之后無需進(jìn)行核酸的提取，只需簡單的離心處理，即能進(jìn)行樣品的smartamp擴(kuò)增。簡化處理的樣品操作程序，能夠在實(shí)際樣品檢測中節(jié)約人力、物力成本，大大提高檢測效率。

盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求及其等同范圍限定。