本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體涉及一種提高巨大芽孢桿菌菌體密度的方法，以提高菌體酸耐受性，保護(hù)細(xì)胞活性，提高微生物活菌含量的方法。
背景技術(shù)：
巨大芽孢桿菌在土壤缺磷的情況下，能產(chǎn)生有機(jī)酸，產(chǎn)生的有機(jī)酸被釋放并積累到細(xì)胞外環(huán)境中，這些有機(jī)酸能夠降低ph值，與鋁、鐵、鎂、鈣、等離子結(jié)合，溶解難溶性的磷酸鹽。由于這個(gè)功能性特征，在高密度發(fā)酵中環(huán)境呈酸性極大地降低了其自身的活性，不容易獲得高密度發(fā)酵液，也使得酸脅迫成為了巨大芽孢桿菌高密度發(fā)酵生產(chǎn)的重點(diǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種能提高巨大芽孢桿菌菌體密度的方法，使其在弱酸環(huán)境下獲得高密度。
為實(shí)驗(yàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明所提出的技術(shù)方案為在培養(yǎng)的過(guò)程中，培養(yǎng)基ph＜6.8時(shí)，發(fā)酵罐自動(dòng)向培養(yǎng)基中加入添加濃度為3g/l的碳酸氫銨，ph調(diào)節(jié)至7.0-7.3。
其中，本發(fā)明中的芽孢桿菌是從養(yǎng)殖土壤中提取的芽孢桿菌，為巨大芽孢桿菌bacillusmegatherium，于2016年12月5日保藏于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏號(hào)為cgmccno.13418，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。
所述培養(yǎng)基配方為：玉米漿干粉3.0±0.2％、糖蜜5.0±0.5％、cacl20.06±0.01％、k2hpo40.25±0.05％；余量為水，ph調(diào)節(jié)至7.0-7.3。
微生物活菌的測(cè)定方法：參照國(guó)標(biāo)20287-2006農(nóng)用微生物菌劑。
有益效果：本發(fā)明提供的在培養(yǎng)基中添加碳酸氫銨后巨大芽孢桿菌在ph≥6.8條件下，比對(duì)照組(未添加碳酸氫銨)具有更好的生長(zhǎng)性能。本發(fā)明提供的方法，對(duì)操作人員專業(yè)素質(zhì)要求低，簡(jiǎn)單易行。
具體實(shí)施例
下面通過(guò)具體的實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例1
巨大芽孢桿菌在生長(zhǎng)過(guò)程中能夠產(chǎn)生具有分解有機(jī)磷、無(wú)機(jī)磷的有機(jī)酸，即酸解作用。將該菌株用于肥料行業(yè)，具有增加難溶性磷的利用率，提高肥效，促進(jìn)作物生長(zhǎng)的功效，是低投入高產(chǎn)出的可持續(xù)發(fā)展。本發(fā)明的芽孢桿菌是從養(yǎng)殖土壤中提取的芽孢桿菌，為巨大芽孢桿菌bacillusmegatherium，于2016年12月5日保藏于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏號(hào)為cgmccno.13418，本發(fā)明中的芽孢桿菌產(chǎn)酸能力比一般芽孢桿菌偏強(qiáng)，經(jīng)16srdna比對(duì)，與巨大芽胞桿菌的序列同源性為99％。經(jīng)liolog4.20微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)鑒定，該菌株與巨大芽孢桿菌(bacillusmegatherium)符合。
實(shí)施例2添加碳酸氫鈉提高微生物含菌量。
培養(yǎng)基配方為：玉米漿干粉3.0％、糖蜜5.0％、cacl20.06％、k2hpo40.25％，余量為水，ph調(diào)節(jié)至7.0。
對(duì)照組：將砂土管保藏的巨大芽孢桿菌接入固體培養(yǎng)基，在37℃靜置培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中后期，以5％的接種量將種子轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，在初始培養(yǎng)條件ph＝7.0的情況下，于37℃、250rpm條件下培養(yǎng)20h時(shí)，ph降至6.0，32h發(fā)酵結(jié)束后微生物活菌含量為4.0×108g/l。
添加組：將砂土管保藏的巨大芽孢桿菌接入固體培養(yǎng)基，在37℃靜置培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中后期，以5％的接種量將種子轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，初始培養(yǎng)條件ph＝7.0，在培養(yǎng)的過(guò)程中，培養(yǎng)基ph＜6.8時(shí)，發(fā)酵罐自動(dòng)向培養(yǎng)基中加入添加濃度為3g/l的碳酸氫銨，調(diào)節(jié)ph值至7.3。于37℃、250rpm條件下培養(yǎng)，28h發(fā)酵結(jié)束后，微生物活菌含量為6.3×108g/l，縮短發(fā)酵對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期4h。
與對(duì)照組相比，不同的是添加組在培養(yǎng)的過(guò)程中，培養(yǎng)基ph＜6.8時(shí)，發(fā)酵罐自動(dòng)向培養(yǎng)基中加入添加濃度為3g/l的碳酸氫銨，調(diào)節(jié)ph值至7.3。
發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定微生物活菌含量及終止ph，結(jié)果如表1所示。
表1微生物活菌含量及終止ph測(cè)定
結(jié)論：菌株bacillusmegatherium的最終活菌含量比對(duì)照組(未添加)提高了57.5％；終止ph也提高至7.8，縮短發(fā)酵對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期4h，抗酸能力顯著提高。
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