本發(fā)明涉及微生物種質(zhì)資源的開發(fā)與利用領(lǐng)域，具體涉及一種用于防治植物灰霉病的解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：灰霉病又稱灰腐病、白點病，是作物生產(chǎn)中發(fā)生的主要病害之一，多由灰葡萄孢菌(botrytiscinereapers.)侵染所致?；移咸焰呔瞧咸焰邔?botrytis)真菌，有性態(tài)是富氏葡萄孢盤菌(botryotiniafuckelianawhetzel.)，自然狀態(tài)下不常見，可以引起200多種雙子葉植物的灰霉病，包括茄科(solanaceae)[番茄、辣椒(capsicumannuumlinn.)等]、葫蘆科(cucurbitaceae)[黃瓜(cucumissativuslinn.)、西葫蘆(cucurbitapepolinn.)等]、薔薇科(rosaceae)[草莓、海棠(malusspectabilisborkh.)等]、葡萄科(vitaceae)等，還能引起蠶豆(viciafabalinn.)赤斑病、花腐病、英腐病等。最近報道灰葡萄孢菌有1400多個寄主，其中大多數(shù)是雙子葉植物?；移咸焰呔梢栽谥参锷L的各個時期侵染，造成落花落果、果實腐爛等，對作物生產(chǎn)造成嚴(yán)重損失，并可以對采后果實的儲存和運輸?shù)仍斐芍匾獡p失，濕度適宜時在受害植物表面產(chǎn)生灰色霉層和孢子堆，有些受害部位還可以產(chǎn)生菌核?；移咸焰呔軌蛞跃恕⒎稚咦雍途z體隨病殘組織在土壤中越冬。其菌核和分生孢子的抗逆能力都很強，尤其菌核是主要的越冬器官，在土壤中可存活8～10個月。翌年環(huán)境適宜時，菌核萌發(fā)產(chǎn)生分生孢子梗和大量分生孢子，分生孢子成熟后脫落，靠雨水、氣流、農(nóng)事操作等進行傳播侵染，可以從自然孔口、傷口、衰老器官或幼嫩組織直接侵入。灰霉病是低溫、高濕病害，灰葡萄孢菌在5～30℃均能生長發(fā)育，適宜生長溫度在20-24℃，分生孢子在5～30℃均可萌發(fā)，萌發(fā)需要相對濕度在80％以上。隨著我國設(shè)施栽培面積的不斷擴大，蔬菜灰霉病有迅速發(fā)展蔓延的趨勢，特別是在環(huán)境條件適合時，可形成災(zāi)害性病害并造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。據(jù)四川省的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，灰霉病危害茄子，苗期發(fā)病率平均為22.4％，高的達78.3％；番茄、黃瓜、草莓等均有不同程度的損失，因該病減產(chǎn)達20％～50％?；颐共〔粌H能引起田間損失，甚至在果實的儲存和運輸中也會造成嚴(yán)重危害，使得果實的儲存期變短，品質(zhì)變差。目前，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中對灰霉病的防治以化學(xué)藥劑為主，主要有兩類，一類是治療性殺菌劑，另一類是保護劑。治療性殺菌劑主要有苯并咪唑類(如多菌靈、二甲酰亞胺類)和n-苯氨基甲酸酯類(如多霉靈)；保護劑有預(yù)防作用，如百菌清、大生、代森錳鋅、克菌丹等?；颐共【闹鞣秶鷱V，繁殖快，遺傳變異大，長期連續(xù)使用同一藥劑易產(chǎn)生抗藥性，國內(nèi)外均有抗性菌株出現(xiàn)，國內(nèi)江西、廣西、上海、山東、山西、北京、遼寧等省市的田間和大棚中的多種蔬菜上均有出現(xiàn)；國外西班牙、意大利、智利、加拿大等地的草莓和番茄等作物上均發(fā)現(xiàn)抗性菌株?；颐共∫褜Ρ讲⑦溥蝾?、二甲酰亞胺類、n-苯基氨基甲酸酯類和苯胺基嘧啶類殺菌劑產(chǎn)生抗性?；瘜W(xué)農(nóng)藥對環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品的污染直接影響人類的健康，為了保證農(nóng)產(chǎn)品的衛(wèi)生和安全，利用微生物之間的寄生、拮抗作用已成為防治灰霉病的大勢所趨。在種類繁多的微生物群體中芽孢桿菌是研究最多的生防菌候選菌，已證明芽孢桿菌屬中的許多種都具有合成抗菌活性物質(zhì)——抗菌多肽的能力，而且芽孢桿菌可以形成芽孢，細胞壁不含內(nèi)毒素，除個別種外絕大多數(shù)對人畜無害，具有較強的抗逆性和良好的環(huán)境適應(yīng)性及環(huán)境友好性，是最理想的微生物殺菌劑資源。雖然很多種芽孢桿菌都已被開發(fā)用于制備微生物殺菌劑，但由于芽孢桿菌種群即菌株的多樣性，不同芽孢桿菌乃至同一芽孢桿菌的不同菌株均具有不同的抗菌譜、抗菌活性和抗菌特點，篩選具有不同作用對象的高效芽孢桿菌生防菌劑仍是現(xiàn)在乃至今后相當(dāng)長一段時間內(nèi)各國科研工作關(guān)注的課題。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種用于防治植物灰霉病的解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng)用，對植物灰霉病菌具有持續(xù)高效拮抗作用。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：用于防治植物灰霉病的解淀粉芽孢桿菌，其特征在于：保藏名稱為解淀粉芽孢桿菌sw17(bacillusamyloliquefacienssw17)；保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號；保藏編號為cgmccno.：14365；保藏日期為2017年6月29日。含有所述解淀粉芽孢桿菌的生防菌劑，其特征在于：所述生防菌劑中解淀粉芽孢桿菌的濃度為1×109～1010cfu/ml。制備所述生防菌劑的方法，其特征在于：步驟一：將解淀粉芽孢桿菌sw17(bacillusamyloliquefacienssw17)cgmccno.：14365接種于培養(yǎng)液中培養(yǎng)至培養(yǎng)液od600為0.5～0.8，獲得種子液；步驟二：按照1～2％的接種量，將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，發(fā)酵溫度控制在35～37℃，發(fā)酵周期為36～48h；步驟三：發(fā)酵結(jié)束后，調(diào)節(jié)發(fā)酵液中解淀粉芽孢桿菌的濃度至1×109～1010cfu/ml，獲得所述生防菌劑。步驟二中，發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：蔗糖30.0g/l，牛肉膏5.0g/l，酵母粉3.0g/l，feso40.4g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，kh2po45.0g/l，nacl5.0g/l，余量為水，初始ph7.2。含有所述解淀粉芽孢桿菌的生防菌劑的應(yīng)用，其特征在于：所述生防菌劑作為植物灰霉病病菌的抑制劑。所述植物灰霉病包括由灰葡萄孢菌(botrytiscinereapers.)感染引起的草莓灰霉病、番茄灰霉病和黃瓜灰霉病。本發(fā)明具有以下優(yōu)點：本發(fā)明所述解淀粉芽孢桿菌來源于蘋果示范園區(qū)蘋果根際土壤，屬于環(huán)境有益菌，該菌種能夠較好地定植于果園環(huán)境，并對植物灰霉病菌具有持續(xù)高效拮抗作用，平板抑菌試驗表明：該生防菌對于由灰葡萄孢菌侵染引起的草莓灰霉病、番茄灰霉病、黃瓜灰霉病等具有較高的生物防治效果，防效分別達到60.82％、62.86％和71.38％；發(fā)酵液抑菌試驗表明：菌劑對三種植物的灰霉病菌的生物防效分別達到62％-74％，同比高于化學(xué)農(nóng)藥——多菌靈的防效；同時，組織離體試驗也證明，該生防菌對三種灰霉病具有較好的生物防效。附圖說明圖1：生防菌sw17的菌落形態(tài)圖。圖2：生防菌sw17對植物灰霉病的平板抑制試驗；a1:草莓灰霉病的對照平板；a2：生防菌sw17對草莓灰霉病的拮抗效果；b1:番茄灰霉病的對照平板；b2：生防菌sw17對番茄灰霉病的拮抗效果；c1：黃瓜灰霉病的對照平板；c2：生防菌sw17對黃瓜灰霉病的拮抗效果。圖3：生防菌sw1716srrna系統(tǒng)進化樹。圖4：生防菌sw17發(fā)酵液稀釋1000倍液對灰霉病菌的平板拮抗效果圖；a.生防菌sw17發(fā)酵液稀釋1000倍液對番茄灰霉病菌的平板拮抗效果圖；b.生防菌sw17發(fā)酵液稀釋1000倍液對草莓灰霉病菌的平板拮抗效果圖；c.生防菌sw17發(fā)酵液稀釋1000倍液對黃瓜灰霉病菌的平板拮抗效果圖；最左側(cè)為無菌水對照，中間為1000稀釋的多菌靈對照，右側(cè)為1000倍稀釋的sw17發(fā)酵液。圖5：生防菌sw17對灰霉葉片離體防效試驗；a.生防菌sw17對草莓灰霉葉片離體防效試驗；b.生防菌sw17對番茄灰霉葉片離體防效試驗；c.生防菌sw17對黃瓜灰霉葉片離體防效試驗；左側(cè)為生防菌菌懸液處理過的植物組織葉片，右側(cè)為對照組，不做任何處理。具體實施方式下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進行詳細的說明。本發(fā)明涉及的用于防治植物灰霉病的解淀粉芽孢桿菌，于2017年6月29日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏名稱為解淀粉芽孢桿菌sw17(bacillusamyloliquefacienssw17)，保藏編號為cgmccno.：14365。1、解淀粉芽孢桿菌sw17的分離、篩選與鑒定：(1)分離與篩選：從陜西省延安市洛川縣示范蘋果園中，采集健康蘋果根際土壤，用保鮮袋帶回；稱取土樣10g，加入裝有90ml無菌水的三角瓶中，三角瓶中裝有玻璃珠30顆，37℃、180rpm震蕩30min，靜置后獲得土壤懸液；將土壤懸液稀釋成10-5、10-6、10-7，吸取不同稀釋度的土壤懸液100μl涂布于na培養(yǎng)基上，置于37℃培養(yǎng)24h，挑取顏色、形態(tài)等不同的細菌單菌落純化、保存；采用平板對峙法測定分離到的細菌對植物病原真菌的抑菌活性。將草莓灰霉病菌、番茄灰霉病菌和黃瓜灰霉病菌分別在pda平板上活化3d，用打孔器在菌落邊緣打取菌塊(直徑5mm)，接種到pda平板中央。培養(yǎng)1d后，在距離灰霉病菌塊2cm處的2個對稱點處接種待測細菌，25℃培養(yǎng)，隨時觀察抑菌結(jié)果。采用下列公式計算：抑菌率(％)＝(各對照菌落半徑－各處理菌落半徑)/各對照菌落半徑×100％。試驗結(jié)果如圖2和表1所示，由此可以看出：sw17菌株對各種灰霉病菌有較好的拮抗作用。表1sw17對多種灰霉病病菌的抑制率病原真菌番茄灰霉草苺灰霉黃瓜灰霉抑菌率(％)62.8660.8271.38(2)鑒定:將篩選到的抑菌效果較好的sw17菌株進行形態(tài)學(xué)和16srdna序列鑒定。形態(tài)學(xué)觀察:將sw17菌株在na培養(yǎng)基平板上劃線接種，37℃培養(yǎng)18h，觀察菌落特征。菌落呈白色、半透明、稍隆起、圓形扁平、光滑濕潤有粘性(見圖1)。16srdna序列測定：采用takaraminibestuniversalgenomicdnaextractionkit，提取sw17菌株的基因組dna，根據(jù)細菌通用引物27f(5’-agagtttgatcctggctcag-3’)和1492r(5’-ggttaccttgttacgactt-3’)進行pcr擴增。pcr擴增反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸lmin30s，共30個循環(huán)；最后72℃延伸1omin。pcr擴增產(chǎn)物送去華大基因有限公司進行測序。經(jīng)測序，sw17菌株的16srdna序列長度為1458bp，具體序列為seqidno：1。將測序結(jié)果在ncbigenbank上進行序列比對，發(fā)現(xiàn)其與解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciensfzb42)的16srdna序列相似性高達99％，初步確定sw17菌株為解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)。利用mega4.1軟件進行聚類分析，構(gòu)建進化樹。結(jié)果表明，sw17與bacillusamyloliquefaciensfzb42處于一個小分支。由此，結(jié)合形態(tài)特征，進一步說明sw17菌株為解淀粉芽抱桿菌。2、生防菌劑的制備：(1)將sw17菌株接種到lb培養(yǎng)液中，于37℃下，180rpm振蕩培養(yǎng)12～16小時后在超凈工作臺中分別取樣測600nm處的od值，測定過程中以未接菌的培養(yǎng)液來調(diào)零；lb培養(yǎng)液的配方為：氯化鈉10g/l，胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，調(diào)節(jié)ph值為7.0；(2)當(dāng)培養(yǎng)至od600值在0.5～0.8之間時，將種子液以1：100體積比加入裝有70l發(fā)酵培養(yǎng)液的100l發(fā)酵罐中，37℃250rpm振蕩培養(yǎng)20～24小時，發(fā)酵液ph值維持在7.0，溶氧量20％，通氣量1vvm，罐壓0.05-0.1kpa。發(fā)酵液出罐后梯度稀釋涂板檢測并調(diào)節(jié)菌懸液濃度約為1×109cfu/ml，獲得生防菌劑。發(fā)酵培養(yǎng)液的配方為(g/l)：蔗糖30.0，牛肉膏5.0，酵母粉3.0，feso40.4，mgso4·7h2o0.2，kh2po45.0，nacl5.0，初始ph7.2；最佳發(fā)酵條件為：37℃，ph7.0，180rpm搖床培養(yǎng)24h。3、解淀粉芽孢桿菌sw17發(fā)酵液的抑菌效果(與多菌靈比較)：解淀粉芽孢桿菌sw17菌株對各種灰霉病菌(botrytiscinerea)的拮抗作用均采用抑菌圈法進行測定。將sw17發(fā)酵液和多菌靈分別稀釋1000倍，每個皿中加入1ml的稀釋液，然后倒入20ml融化的pda培養(yǎng)基，混合搖勻，冷卻后待用；將草莓灰霉病菌、番茄灰霉病菌和黃瓜灰霉病菌在pda平板上活化3d，用打孔器在菌落邊緣打取菌塊(直徑5mm)，接種到含有sw17和多菌靈稀釋液的pda平板中央，以加無菌水的pda為對照，25℃培養(yǎng)，隨時觀察測量菌落半徑，計算sw17菌株對病原真菌生長的抑菌率，每個處理重復(fù)3次。采用下列公式計算抑菌率：對病菌生長的抑菌率(％)＝(各對照菌落半徑－各處理菌落半徑)/各對照菌落半徑×100％。試驗結(jié)果見圖4和表2，結(jié)果顯示：sw17菌株對各供試病原菌抑菌率在62％-74％之間。表2sw17發(fā)酵液與多菌靈對灰霉病菌的抑菌效果比較病原真菌sw17多菌靈番茄灰霉69.70％21.21％草苺灰霉62.63％12.50％黃瓜灰霉74.55％9.09％4、解淀粉芽孢桿菌sw17對離體葉片防效測定：選取枝條前端的健康植物葉片，清洗干凈表面浮塵，而后置于0.6％的次氯酸鈉溶液中，表面消毒5min，再用無菌水沖洗2-3次，自然晾干，用無菌水浸濕的已滅菌的脫脂棉包裹住葉柄基部，25℃保濕備用。將解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液浸潤葉片表面，定殖過夜，在處理好的每個葉片的相同部位制造針刺傷口(3-5針)后，將培養(yǎng)3d的病原真菌菌餅(d＝5mm)接種于針刺傷口處，無菌水處理作為對照。25℃保濕，觀察離體葉片上的發(fā)病情況。結(jié)果見圖5，可見sw17能較好的抑制灰霉病菌的發(fā)病，具有微生物農(nóng)藥開發(fā)潛質(zhì)。本發(fā)明的內(nèi)容不限于實施例所列舉，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過閱讀本發(fā)明說明書而對本發(fā)明技術(shù)方案采取的任何等效的變換，均為本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。sequencelisting<110>陜西省微生物研究所<120>用于防治植物灰霉病的解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng)用<130>2017<160>1<170>patentinversion3.5<210>1<211>1458<212>dna<213>解淀粉芽孢桿菌sw17（bacillusamyloliquefacienssw17）<400>1actttttggtcaagttgtcggcggctggctcctaaaaggttacctcaccgacttcgggtg60ttacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcg120gcatgctgatccgcgattactagcgattccagcttcacgcagtcgagttgcagactgcga180tccgaactgagaacagatttgtgggattggcttaacctcgcggtttcgctgccctttgtt240ctgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatc300cccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaactgaatgctggca360actaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctg420acgacaaccatgcaccacctgtcactctgcccccgaaggggacgtcctatctctaggatt480gtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgct540ccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtactccc600caggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactaaggggcggaaaccccctaacactta660gcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctt720tcgctcctcagcgtcagttacagaccagagagtcgccttcgccactggtgttcctccaca780tctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccactctcctcttctgcactcaagttcc840ccagtttccaatgaccctccccggttgagccgggggctttcacatcagacttaagaaacc900gcctgcgagccctttacgcccaataattccggacaacgcttgccacctacgtattaccgc960ggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttaggtaccgtcaaggkgccgcccta1020tttgaacggcacttgttcttccctaacaacagagctttacgatccgaaaaccttcatcac1080tcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccattgcggaagattccctactgctgcctc1140ccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggct1200acgcatcgtcgccttggtgagccgttacctcaccaactagctaatgcgccgcgggtccat1260ctgtaagtggtagccgaagccaccttttatgtctgaaccatgcggttcaaacaaccatcc1320ggtattagccccggtttcccggagttatcccagtcttacaggcaggttacccacgtgtta1380ctcacccgtccgccgctaacatcagggagcaagctcccatctgtccgctcgacttgcatg1440tatagcacgcgccctcac1458當(dāng)前第1頁12