本發(fā)明涉及分子生物學領域，具體涉及一種mtrr基因多態(tài)性快速檢測的引物、分子信標、試劑盒及其檢測方法。

背景技術(shù)：

葉酸(folicacid)屬于b組維生素,是合成核酸所必須的元素，是細胞生長和組織修復所必需的物質(zhì)，更是胚胎發(fā)育過程中不可缺少的營養(yǎng)素。近年來大量研究已經(jīng)證實，一旦發(fā)生葉酸缺陷或者葉酸代謝酶的缺陷，就會導致細胞周期不正常，dna、蛋白質(zhì)甲基化反應異常，dna堿基無法合成等，從而直接或間接導致新生兒或胎兒神經(jīng)管缺陷以及成年人心血管疾病發(fā)生。目前，研究表明和葉酸代謝密切相關(guān)的基因有5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(mthfr)和甲硫氨酸合成酶還原酶(mtrr)。其中mtrr主要作用是通過還原性的甲基化作用將失活的甲硫氨酸合成酶還原成有活性狀態(tài)，從而可以將5-甲基四氫葉酸和同型半胱氨酸(hcy)代謝為甲硫氨酸，維持細胞內(nèi)甲硫氨酸、葉酸和無毒hcy的水平。mtrr常見的突變位點為66a>g(rs1801394),蛋白質(zhì)水平表現(xiàn)為氨基酸第22位的異亮氨酸變?yōu)榧琢虬彼?，在中國的發(fā)生率為25.7％，其中66aa基因型的發(fā)生率為6.6％。mtrr基因突變會導致酶的表達或功能的差異，進而影響血漿hcy的水平。研究表明，mtrr基因發(fā)生改變時，在腦血管疾病(cvd)的風險中，66aa比66gg的hcy水平高4％，因此對mtrr的基因檢測不僅對補充葉酸可以起到指導作用，還可以對高同型半胱氨酸血癥患者及時補充葉酸，降低腦卒中發(fā)生風險也有一定的指導意義。

目前，已報道的用于snp(singlenucleotidepolymorphism)檢測的方法主要有rflp、測序、taqman探針法、hrm、snp芯片法和質(zhì)譜法等，它們之間各有優(yōu)劣勢，但大多都需要專業(yè)人士操作，操作復雜，耗費時間較長，花費昂貴。目前臨床用于檢測mtrr(66a>g)的方法主要為熒光探針法，都需要以提純的dna或血液作為擴增模板來確定基因分型。提取純化dna需要增加抽取血液和提取血液dna的步驟，完成整個過程需要4個小時，不僅造成了傷痛，還浪費了大量時間?，F(xiàn)有技術(shù)在pcr擴增后需要進行毛細管電泳分析，增加此操作步驟，需要花費至少1個小時。此外，目前市面上的試劑為多組分組成，使用時需要專業(yè)的操作者，并且需要根據(jù)試劑盒中的試劑組分和說明配制試劑然后才能使用，此過程容易造成試劑的污染，測試的成功率低,而且增加了檢測操作步驟，延長了檢測時間，得出檢測結(jié)果的整個過程至少需要8小時。因此，難以滿足臨床疾病的快速診斷，增加了患者疾病治療的風險。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種可在無痛環(huán)境下取樣，操作簡單、成本低且檢測快速、時間短、成功率高的mtrr基因多態(tài)性快速檢測所涉及的引物、分子信標、試劑盒及其檢測方法，從而為個體化用葉酸提供指導，減小胎兒畸形風險。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：mtrr基因多態(tài)性快速檢測的試劑盒，

包包括pcr反應液；pcr反應液的原料及終濃度為，

dna聚合酶0.04-0.09u/μl；

dntps0.1-0.5mm；

5xpcr緩沖液0.5-1.5x；

mgcl21-2.5mm；

十二烷基硫酸鈉0.0005-0.015％(w/v)；

聚乙二醇辛基苯基醚0.001-0.03％(w/v)；

上游引物0.2-1.0μm；

下游引物0.2-1.0μm；

突變型分子信標0.3-0.5μm；

野生型分子信標0.3-0.7μm；

且其用于檢測細胞樣品。

dntp是deoxy-ribonucleosidetriphosphate(脫氧核糖核苷三磷酸)的縮寫，dntps則是由四種脫氧核苷酸(datp、dgtp、dttp、dctp)以相同的比例混合而成，是dna復制的原料；mgcl2的作用是提供mg²⁺與dntp以及dna模板結(jié)合形成復合體，只有這種復合體才能被dna聚合酶識別；dna聚合酶為gotaqdnapolymerase，以dna為復制模板，從dna由5'端點開始復制到3'端的酶。上游引物、下游引物作為dna復制的起始點，因為在dna合成中dna聚合酶僅僅可以把新的核苷酸加到已有的dna鏈上，因此，在核酸合成反應時，引物作為每個多核苷酸鏈進行延伸的出發(fā)點而起作用。

采用本發(fā)明技術(shù)方案的mtrr基因多態(tài)性快速檢測的試劑盒，以細胞為樣本，以熒光基團信標法為基礎，結(jié)合細胞裂解液對mtrr進行檢測分析。用細胞裂解液(由十二烷基硫酸鈉、聚乙二醇辛基苯基醚組成)在反應過程中直接裂解細胞并釋放出細胞核中dna。在現(xiàn)有的pcr反應中，以細胞直接作為模板的pcr反應，通常無法徹底裂解細胞，并且裂解后的細胞碎片及一些細胞內(nèi)容物(如蛋白酶)對pcr反應有抑制，最終導致分型結(jié)果不穩(wěn)定，甚至失敗。因此，在未加裂解液的情況下，直接加入細胞作為模板，會造成細胞裂解不徹底，并且細胞裂解之后的細胞碎片以及一些蛋白酶會對pcr反應造成阻礙，造成實驗失敗。本發(fā)明的細胞裂解液可直接溶解細胞質(zhì)和細胞膜，破壞分子間許多微弱的化學鍵，分解一些蛋白酶，降低細胞裂解之后產(chǎn)生的雜質(zhì)對pcr反應的影響。因此在最大釋放dna的同時還消除了細胞中其他成分對pcr反應的部分阻礙作用。

由實驗可知，pcr反應液的原料、特異性引物及分子信標的終濃度范圍為上述范圍時檢測結(jié)果均正確。其中，5x反應緩沖液1x的原料為5x反應緩沖液，指的是初始濃度為5倍的反應緩沖液，1x是指的應用的終濃度。

本發(fā)明具有無需采取血液樣本，無痛操作，不需要抽取血液；無需提純dna；簡化操作，縮短檢測時間，無需專業(yè)人士操作；在為被測者減少痛苦的同時，也能為醫(yī)生盡早精準用藥爭取時間。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有無痛采樣、簡單快速、即時檢測，避免污染，成功率高等優(yōu)點。

進一步，所述的pcr反應液的原料終濃度為：

dna聚合酶0.09u/μl；

dntps0.2mm；

5xpcr緩沖液1x；

mgcl22.5mm；

十二烷基硫酸鈉0.005％(w/v)；

聚乙二醇辛基苯基醚0.01％(w/v)；

上游引物0.5μm；

下游引物0.5μm；

突變型分子信標0.3μm；

野生型分子信標0.5μm。

由實驗可知，pcr反應液的原料、特異性引物及分子信標的終濃度范圍為上述范圍時檢測結(jié)果最準確，成功率最高。

進一步，所述的細胞樣品為口腔黏膜脫落細胞。本發(fā)明以直接刮取的口腔黏膜脫落細胞為樣本，操作方便。

進一步，還包括有提純的人類基因組dna基因序列。試劑盒中包括質(zhì)控品，為提純的人類基因組dna基因序列，是在測定時為了做平行試驗，來測定試劑結(jié)果的有效性。

本申請還提出另一個技術(shù)方案，本發(fā)明試劑盒中的mtrr基因多態(tài)性快速檢測的引物，

上游引物5’-3’的基因序列為：atgctacacagcagggacag；

下游引物5’-3’的基因序列為：cactaatacagtgaagatctgcag。

本申請還提出另一個技術(shù)方案，試劑盒中引物檢測的mtrr基因多態(tài)性快速檢測的分子信標，

野生型分子信標的5’-3’的基因序列為：cgcgctttg+ctcac+a+t+atttcttctagcgcg；

突變型分子信標的5’-3’的基因序列為：cgcgctttg+ctcaca+c+atttcttctagcgcg；

+為鎖核酸修飾的堿基；

且野生型分子信標和突變型分子信標基因序列的5’端或3’端分別設有熒光基團和與熒光基團配合的淬滅基團。

本技術(shù)方案使用了分子信標分子信標，分子信標為一種在5’和3’末端可自身形成由5-8個堿基組成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙標記寡核苷酸分子信標。即為上述分子信標的基因序列和結(jié)構(gòu)。自由狀態(tài)時，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的兩個末端使熒光基團與淬滅基團靠近(約為7-10nm)。此時發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移,使熒光基團發(fā)出的熒光被淬滅基團吸收并以熱的形式散發(fā)，熒光幾乎完全被淬滅。當分子信標與細胞的基因序列完全互補的靶標序列結(jié)合形成雙鏈雜交體時，莖結(jié)構(gòu)互補區(qū)的堿基對被分開，熒光基團和淬滅基團之間距離增大，這時分子信標的熒光幾乎100％恢復。這種設計能有效地增加分子信標的特異性，提高對mtrr檢測的正確性。

檢測的原理為：在mtrr(66a>g)基因突變位點兩側(cè)保守區(qū)域設計一對引物，并在突變位點序列處設計兩個分子信標，突變型分子信標、野生型分子信標，野生型分子信標與未突變序列結(jié)合，突變型分子信標與突變位點序列結(jié)合。野生型分子信標、突變型分子信標5’端用熒光基團標記，野生型分子信標、突變型分子信標的3’端用與熒光基團配合的淬滅基團標記。在pcr退火階段，野生型分子信標與未突變的序列結(jié)合，而突變型分子信標與有突變位點的序列結(jié)合，在結(jié)合后，熒光基團遠離淬滅基團，此時發(fā)出的熒光被實時熒光定量檢測儀記錄下來，從而通過熒光的顏色來判斷所檢測基因的基因型。

進一步，所述的熒光基團為alexafluor488、fam，淬滅基團為bhq1標記基團；

或者所述的熒光基團為alexafluor594、texasred標記基團，淬滅基團為bhq2標記基團。為本發(fā)明中所使用的熒光基團和淬滅基團，當然，也可用其他熒光基團和與其配合的淬滅基團代替，不影響檢測結(jié)果。

本申請還提出另一個技術(shù)方案，利用上述的引物、分子信標及試劑盒進行的mtrr基因多態(tài)性快速檢測方法，操作方法為，

(1)取樣前用水漱口2次，每次大于5秒，漱口后吞咽2-3次；

(2)取取樣裝置的取樣部近90°接觸口腔內(nèi)腮壁，均勻刮拭5次，上下為1次；

(3)取樣后將取樣裝置的取樣部插入pcr反應液中，混勻；

(4)取1μl提純的dna基因序列加入到另一支pcr反應液中，混勻；

(5)將完成加樣的pcr反應液放入定量pcr儀中，運行反應程序。

進一步，定量pcr儀的反應程序為：

a、預變性：溫度95℃，5min，1個循環(huán)；

b、變性：95℃，8s；

c、退火及延伸：58℃，35s；

d、b及c程序操作50個循環(huán)。

進一步，所述的定量pcr儀為雙通道，激發(fā)波長分別為450-500nm和550-600nm。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例一的第一個樣品檢測擴增曲線圖；

圖2是本發(fā)明實施例一的第一個樣品檢測擴增曲線圖；

圖3是本發(fā)明實施例一的第一個樣品檢測擴增曲線圖；

圖4是本發(fā)明實施例二的第二個樣品檢測擴增曲線圖；

圖5是本發(fā)明實施例二的第二個樣品檢測擴增曲線圖；

圖6是本發(fā)明實施例二的第二個樣品檢測擴增曲線圖；

圖7是本發(fā)明實施例三的第三個樣品檢測擴增曲線圖；

圖8是本發(fā)明實施例三的第三個樣品檢測擴增曲線圖；

圖9是本發(fā)明實施例三的第三個樣品檢測擴增曲線圖；

圖10是本發(fā)明實施例四的第一個樣品檢測擴增曲線圖；

圖11是本發(fā)明實施例四的第二個樣品檢測擴增曲線圖；

圖12是本發(fā)明實施例四的第三個樣品檢測擴增曲線圖；

圖13是本發(fā)明提純的mtrr突變雜合型人類基因組dna基因序列樣品檢測擴增曲線圖。

具體實施方式

以下是本發(fā)明mtrr基因多態(tài)性快速檢測試劑盒中的各實施例的原料終濃度，如表1所示：

表1

以下為本發(fā)明mtrr基因多態(tài)性快速檢測的具體操作方式：

一、細胞裂解液的配制

表1中的細胞裂解液組分濃度為pcr反應體系中的最終濃度，此濃度太小，會造成加樣的不準確性。因此在配置時，可將終濃度擴大，再稀釋。

所有試劑配制均在滅菌后的超凈工作臺進行。

(1)實施例一中200x細胞裂解液的配制

裂解液的配置方法：使用1.5ml的離心管，加入10ulsds和1.88ultritonx-100，再加入988.12ul無核酸酶的水至總體積1000ul，使sds的終濃度達到0.1％，使tritonx-100的終濃度達到0.2％，即為200x的細胞裂解液，然后震蕩混勻，-4℃保存。

(2)實施例二、實施例四中200x細胞裂解液的配制

裂解液的配置方法：使用1.5ml的離心管，加入100ulsds和18.78ultritonx-100，再加入881.22ul無核酸酶的水至總體積1000ul，使sds的終濃度達到1％，使tritonx-100的終濃度達到2％，即為200x的細胞裂解液，然后震蕩混勻，-4℃保存。

(3)實施例三中200x細胞裂解液的配制

使用1.5ml的離心管，加入300ulsds和56.34ultritonx-100，再加入643.66ul無核酸酶的水至總體積1000ul，使sds的終濃度達到3％，使tritonx-100的終濃度達到6％，即為200x的細胞裂解液，然后震蕩混勻，-4℃保存。

上游引物5’-3’的基因序列為：atgctacacagcagggacag；

下游引物5’-3’的基因序列為：cactaatacagtgaagatctgcag。

野生型分子信標5’-3’的基因序列為：

alexafluor488標記-cgcgctttg+ctcac+a+t+atttcttctagcgcg-bhq1標記；

突變型分子信標5’-3’的基因序列為：

alexafluor594標記-cgcgctttg+ctcaca+c+atttcttctagcgcg-bhq2標記；

+為鎖核酸修飾的堿基。

上述原料，除特異性引物、分子信標、細胞裂解液外，均購自上海普洛麥格生物制品有限公司。特異性引物由上海占標生物科技有限公司合成；分子信標由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

二.pcr反應液配制

各原料的加入量如表2所示。所有配制均在滅菌后的超凈工作臺進行。

表2

三、mtrr基因型檢測；

mtrr基因型快速檢測試劑盒由9支分裝好的試劑管組成，每個被測者檢測3次重復(一次一支反應液)，每測試9支試劑，同時測試一次質(zhì)控品，質(zhì)控品即為提純的人類基因組dna基因序列，作為平行測試。該質(zhì)控品為mtrr突變雜合型，當結(jié)果如圖13所示時，表明試劑能有效地進行分型，表示其他試劑測試結(jié)果同樣可信。

每個實施例按照23.5ul的反應體系各配制36支試劑，以上所指的終濃度是指各組分在23.5ul體系中的濃度，ul/支是指各個組分在試劑管中的含量，-20℃避光保存；

(1)取樣前用清水漱口2次，每次不少于5秒，漱口后吞咽2-3次，盡量避免口腔內(nèi)壁殘留唾液；

(2)取出一次性使用無菌拭子(專利授權(quán)公告號：cn205359515u)及反應液，拔掉反應液塞子及拭子端蓋；

(3)使拭子端部近90°接觸口腔內(nèi)腮壁，實施例一、二、三、四均勻刮拭5次(上下為1次)，力度以腮部微突為宜；

(4)取樣后立即將拭子插入反應液中，按壓頂部使其與試劑管密封，避光暫存，而后輕彈試劑管使樣本與反應液充分混勻；

步驟(1)～(4)在20s內(nèi)完成操作，切勿中斷；

(5)用移液器取1μl質(zhì)控品加入到一支反應液中，輕彈試劑管并混勻；

(6)將完成加樣的反應液放入om-1000型熒光pcr儀器(專利授權(quán)公告號：cn103820306b)中，并運行表3中程序。

表3

(7)得到擴增曲線和熒光顏色，分析結(jié)果。

四、結(jié)果分析：

因為人類基因組為二倍體，每一基因座位上含有兩個等位基因。結(jié)果共有三種，分別是“gg”、“ga”或“aa”，其中陰性結(jié)果是“aa”，陽性結(jié)果是“ga”和“gg”。如圖1、圖2和圖3所示，圖中a線表示mtrr(66a>g)未突變基因擴增情況，g線表示mtrr(66a>g)突變基因擴增情況。

實施例一的結(jié)果為：

由圖1可知：只有a線有指數(shù)增長，而g線沒有指數(shù)增長，因此檢測結(jié)果是野生型aa，提示所檢測基因表達或活性可能正常，該基因型為正常代謝型；

由圖2可知：a線和g線都有指數(shù)增長，表示檢測結(jié)果是突變雜合型ga，提示所檢測基因活性可能下降，該基因型屬于中等代謝型；

由圖3可知：只有g(shù)線有指數(shù)增長，而a線沒有指數(shù)增長，表示檢測結(jié)果是純合突變型gg，提示所檢測基因活性明顯下降或可能喪失，其活性下降或喪失可能導致藥物活性成分血藥濃度降低；

由此，可從圖1、圖2和圖3中分析得出mtrr(66a>g)的基因型，從而可得出，患者對藥物的代謝類型。

實施例二的結(jié)果為：

由圖4可知：只有a線有指數(shù)增長，而g線沒有指數(shù)增長，因此檢測結(jié)果是野生型aa，提示所檢測基因表達或活性可能正常，該基因型為正常代謝型；

由圖5可知：a線和g線都有指數(shù)增長，表示檢測結(jié)果是突變雜合型ga，提示所檢測基因活性可能下降，該基因型屬于中等代謝型；

由圖6可知：只有g(shù)線有指數(shù)增長，而a線沒有指數(shù)增長，表示檢測結(jié)果是純合突變型gg，提示所檢測基因活性明顯下降或可能喪失，其活性下降或喪失可能導致藥物活性成分血藥濃度降低；

由此，可從圖4、圖5和圖6中分析得出mtrr(66a>g)的基因型，從而可得出，患者對藥物的代謝類型。

實施例三的結(jié)果為：

由圖7可知：只有a線有指數(shù)增長，而g線沒有指數(shù)增長，因此檢測結(jié)果是野生型aa，提示所檢測基因表達或活性可能正常，該基因型為正常代謝型；

由圖8可知：a線和g線都有指數(shù)增長，表示檢測結(jié)果是突變雜合型ga，提示所檢測基因活性可能下降，該基因型屬于中等代謝型；

由圖9可知：只有g(shù)線有指數(shù)增長，而a線沒有指數(shù)增長，表示檢測結(jié)果是純合突變型gg，提示所檢測基因活性明顯下降或可能喪失，其活性下降或喪失可能導致藥物活性成分血藥濃度降低；

由此，可從圖7、圖8和圖9中分析得出mtrr(66a>g)的基因型，從而可得出，患者對藥物的代謝類型。

通過上述三個實施例結(jié)果可看出，三個實施例均能正確分析出mtrr(a66g，rs1801394)的基因型，但實施例二的雜合基因型gr-ratio明顯優(yōu)于實施例一和實施例三。故確定實施例二中的pcr反應系統(tǒng)為最優(yōu)。

實施例四的結(jié)果為：

由圖10可知：在三次重復測試中，均只有a線有指數(shù)增長，而g線沒有指數(shù)增長，三次檢測結(jié)果一致，均為野生型；

由圖11可知：在三次重復測試中，a線和g線都有指數(shù)增長，三次檢測結(jié)果一致，均為雜合型；

由圖12可知：在三次重復測試中，均只有g(shù)線有指數(shù)增長，而a線沒有指數(shù)增長，三次檢測結(jié)果一致，均為突變型。

由此，可以從圖10、圖11和圖12中分析得出mtrr三種基因型的分型正確率均為100％，表示實施例四分型結(jié)果穩(wěn)定，能夠準確報告出患者的代謝類型，指導患者精準用藥。

核苷酸序列表如下：

<110>重慶京因生物科技有限責任公司

<120>mtrr基因多態(tài)性快速檢測的引物、分子信標、試劑盒及其檢測方法

<160>4

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<400>1

atgctacacagcagggacag

<210>2

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<400>2

cactaatacagtgaagatctgcag

<210>3

<211>35

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_binding

<400>3

cgcgctttg+ctcac+a+t+atttcttctagcgcg

<210>4

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_binding

<400>4

cgcgctttg+ctcaca+c+atttcttctagcgcg。

對于本領域的技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的前提下，還可以作出若干變形和改進，這些也應該視為本發(fā)明的保護范圍，這些都不會影響本發(fā)明實施的效果和專利的實用性。

<110>重慶京因生物科技有限責任公司

<120>mtrr基因多態(tài)性快速檢測的引物、分子信標、試劑盒及其檢測方法

<160>4

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<400>1

atgctacacagcagggacag

<210>2

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<400>2

cactaatacagtgaagatctgcag

<210>3

<211>35

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_binding

<400>3

cgcgctttg+ctcac+a+t+atttcttctagcgcg

<210>4

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_binding

<400>4

cgcgctttg+ctcaca+c+atttcttctagcgcg。