本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體而言，涉及一種肺癌臨床用藥基因檢測標準品及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：靶向治療，是在細胞分子水平上，針對已經(jīng)明確的致癌位點(該位點可以是腫瘤細胞內(nèi)部的一個蛋白分子，也可以是一個基因片段)，來設(shè)計相應(yīng)的治療藥物，藥物進入體內(nèi)會特意地選擇致癌位點來相結(jié)合發(fā)生作用，使腫瘤細胞特異性死亡，而不會波及腫瘤周圍的正常組織細胞，所以分子靶向治療又被稱為“生物導(dǎo)彈”。靶向治療是指以標準化的生物標記物來識別是否存在某種疾病特定的控制腫瘤生長的基因或基因譜，以此確定針對特異性靶點的治療方法。但是，由于與腫瘤或癌癥相關(guān)的基因突變在不同的個體中是不同的，對于不同的基因或不同的位點突變，其對于某種藥物的敏感性是不同的，也就是說某些患者可能對某種藥物存在天然的耐藥性。另外，在靶向治療的過程，腫瘤有可能產(chǎn)生其他位點的基因突變，而抑制靶向藥物的治療作用，產(chǎn)生獲得性耐藥性。而耐藥性一旦產(chǎn)生，繼續(xù)用已經(jīng)不具備治療的作用的靶向藥物，對患者無任何好處，還會增加副作用。為了更好的指導(dǎo)臨床用藥，需要對患者的基因突變位點進行檢測。市場上已經(jīng)有很多基因突變位點的檢測試劑盒，但是，其檢測結(jié)果均可能出現(xiàn)假陽性或假陰性，目前并無統(tǒng)一的標準對其進行驗證或檢測。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在提供一種肺癌臨床用藥基因檢測標準品及其應(yīng)用，以解決現(xiàn)有技術(shù)中肺癌臨床用藥基因檢測試劑盒的檢測靈敏度無法進行標準化評估的技術(shù)問題。為了實現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種肺癌臨床用藥基因檢測標準品。該肺癌臨床用藥基因檢測標準品包括：最低檢出限參考品，最低檢出限參考品至少包括兩個不同級別的變異頻率的dna混合物，每個級別的變異頻率的dna混合物包括以下表1所示的突變位點：表1進一步地，最低檢出限參考品包括l1級別的變異頻率的dna混合物和l2級別的變異頻率的dna混合物，其中，l1級別的變異頻率的dna混合物中，各突變位點的變異頻率在2.1～4.6％之間，l2級別的變異頻率的dna混合物中，各突變位點的變異頻率在0.9～2.5％之間。進一步地，l1級別的變異頻率的dna混合物和l2級別的變異頻率的dna混合物中，各突變位點的變異頻率如下表2所示：表2進一步地，肺癌臨床用藥基因檢測標準品還包括l3級別的變異頻率的dna混合物，l3級別的變異頻率的dna混合物中各突變位點的變異頻率在0.5～1.4％；優(yōu)選的，l3級別的變異頻率的dna混合物中各突變位點的變異頻率如表3所示：表3進一步地，肺癌臨床用藥基因檢測標準品還包括l4級別的變異頻率的dna混合物，l4級別的變異頻率的dna混合物中各突變位點的變異頻率在0.09～0.39％；優(yōu)選的，l4級別的變異頻率的dna混合物中各突變位點的變異頻率如表4所示：表4進一步地，每個級別的變異頻率的dna混合物的濃度均為5ng/μl。進一步地，最低檢出限參考品中的dna混合物包括腫瘤細胞系的dna；優(yōu)選采用的腫瘤細胞系包括pc-9細胞系、nci-h1975細胞系、kyse450細胞系、sw48細胞系、nci-h2228細胞系、nci-h3122細胞系以及hcc78細胞系；更優(yōu)選地，腫瘤細胞系的dna是通過采用beas-2b細胞系dna進行突變頻率稀釋的。進一步地，肺癌臨床用藥基因檢測標準品還包括陰性參考品；優(yōu)選的，陰性參考品為最低限檢測參考品中的突變位點為陰性的dna；更優(yōu)選，陰性參考品中dna的濃度為5ng/μl；更優(yōu)選的，陰性參考品中dna為細胞系dna；進一步優(yōu)選，細胞系dna為beas-2b細胞系dna、amo-1細胞系dna、nci-h596細胞系dna和nci-h929細胞系dna。進一步地，肺癌臨床用藥基因檢測標準品還包括陽性參考品；優(yōu)選的，陽性參考品為表1所示的突變位點的dna混合物；更優(yōu)選，陽性參考品中的dna混合物中各突變位點的變異頻率如表2的l1級別所示。進一步地，肺癌臨床用藥基因檢測標準品還包括至少兩個級別的變異頻率的重復(fù)性參考品；優(yōu)選的，重復(fù)性參考品為表1所示的突變位點的dna混合物；更優(yōu)選，重復(fù)性參考品為表2所示的l1級別的變異頻率的重復(fù)性參考品和l2級別的變異頻率的重復(fù)性參考品。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種肺癌臨床用藥基因檢測標準品在檢驗肺癌基因檢測試劑盒的檢測靈敏度方面的應(yīng)用。應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，肺癌臨床用藥基因檢測標準品中包括最低檢出限參考品，所述最低檢出限參考品至少包括兩個不同級別的變異頻率的dna混合物，采用不同廠家的試劑盒檢測該標準品，根據(jù)結(jié)果可以判斷該試劑盒能夠檢出基因突變及基因頻次，驗證現(xiàn)有試劑盒檢測結(jié)果的準確性，也為臨床用藥提供更準確的指導(dǎo)。具體實施方式需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特征可以相互組合。下面將結(jié)合實施例來詳細說明本發(fā)明。針對現(xiàn)有技術(shù)中肺癌臨床用藥基因檢測試劑盒的檢測靈敏度無法進行標準化評估的技術(shù)問題。根據(jù)本發(fā)明一種典型的實施方式，提供一種肺癌臨床用藥基因檢測標準品。該肺癌臨床用藥基因檢測標準品包括：最低檢出限參考品，最低檢出限參考品至少包括兩個不同級別的變異頻率的dna混合物，每個級別的變異頻率的dna混合物包括以下表1所示的突變位點：表1應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，肺癌臨床用藥基因檢測標準品(本申請中也簡稱為標準品)中包括最低檢出限參考品，所述最低檢出限參考品至少包括兩個不同級別的變異頻率的dna混合物，采用不同廠家的試劑盒檢測該標準品，根據(jù)結(jié)果可以判斷該試劑盒能夠檢出基因突變及基因頻次，驗證現(xiàn)有試劑盒檢測結(jié)果的準確性，也為臨床用藥提供更準確的指導(dǎo)。為了對能夠檢測不同變異頻率的試劑盒進行更好的驗證，最低檢出限參考品中dna混合物的變異頻率級別可以根據(jù)實際情況進行調(diào)整。根據(jù)本發(fā)明一種典型的實施方式，最低檢出限參考品包括l1級別的變異頻率的dna混合物和l2級別的變異頻率的dna混合物，其中，l1級別的變異頻率的dna混合物中，各突變位點的變異頻率在2.1～4.6％之間，l2級別的變異頻率的dna混合物中，各突變位點的變異頻率在0.9～2.5％之間。優(yōu)選的，l1級別的變異頻率的dna混合物和l2級別的變異頻率的dna混合物中，各突變位點的變異頻率如下表2所示：表2理論上，作為標準品的同一級別的變異頻率的dna混合物中，各突變位點的變異頻率最好一致，這樣各突變位點在相同檢測條件下被檢出的概率就越接近，標準品檢測結(jié)果就越可信。但在實際操作中，難以實現(xiàn)各突變位點的變異頻率完全一致這一理想的狀態(tài)。本申請經(jīng)過無數(shù)次的實驗驗證，同一級別的變異頻率的dna混合物中，各突變位點的變異頻率在上述范圍內(nèi)，也具有各突變位點在同樣檢測檢測條件下都能被檢出的優(yōu)勢。因而，將上述標準品用于檢驗各肺癌突變基因檢測試劑盒的準確性和靈敏度，結(jié)果更可靠。為了進一步提高該標準品對不同試劑盒的檢測靈敏度，優(yōu)選的，標準品還包括l3級別的變異頻率的dna混合物，l3級別的變異頻率的dna混合物中各突變位點的變異頻率在0.5～1.4％；優(yōu)選的，l3級別的變異頻率的dna混合物中各突變位點的變異頻率如表3所示：表3上述標準品中，采用三個不同級別的變異頻率的dna混合物作為最低限檢測參考品，能夠?qū)⒆儺愵l率在0.5～1.4％的上述基因的突變都能檢測到，進而能夠進一步區(qū)分或驗證某些檢測靈敏度更低的檢測試劑盒。例如，某些檢測試劑盒的檢測靈敏度僅能達到1％以上，當采用該試劑盒檢測的樣本中，目的基因的突變頻率低于1％時，則可以確定是該試劑盒本身檢測局限性導(dǎo)致，而非該樣本為陰性。因而，不僅能夠判斷不同試劑盒的優(yōu)劣，而且能夠更準確地判斷相應(yīng)的檢測結(jié)果，從而為臨床用藥提供更可靠的指導(dǎo)。優(yōu)選的，標準品還包括l4級別的變異頻率的dna混合物，l4級別的變異頻率的dna混合物中各突變位點的變異頻率在0.09～0.39％；優(yōu)選的，l4級別的變異頻率的dna混合物中各突變位點的變異頻率如表4所示：表4更優(yōu)選的，每個級別的變異頻率的dna混合物的濃度均為5ng/μl。將dna混合物的濃度控制在該濃度范圍內(nèi)，能進一步確保各突變位點被檢出。根據(jù)本發(fā)明一種典型的實施方式，最低檢出限參考品中的dna混合物包括腫瘤細胞系的dna；優(yōu)選采用的腫瘤細胞系包括pc-9細胞系、nci-h1975細胞系、kyse450細胞系、sw48細胞系、nci-h2228細胞系、nci-h3122細胞系以及hcc78細胞系；更優(yōu)選地，腫瘤細胞系的dna是通過采用beas-2b細胞系dna進行突變頻率稀釋的。上述各腫瘤細胞系均為市售產(chǎn)品。通過采用采用含有上述突變位點的細胞系的dna來形成各級別的變異頻率的dna混合物，使得該標準品更接近于待檢樣品中dna的真實存在狀態(tài)，因而，檢測結(jié)果也較合成的dna更準確。根據(jù)本發(fā)明一種典型的實施方式，肺癌臨床用藥基因檢測標準品還包括陰性參考品；優(yōu)選的，陰性參考品為最低限檢測參考品中的突變位點為陰性的dna；更優(yōu)選，陰性參考品中dna的濃度為5ng/μl；更優(yōu)選的，陰性參考品中dna為細胞系dna，超聲打斷的產(chǎn)物；進一步優(yōu)選，細胞系dna為beas-2b細胞系dna、amo-1細胞系dna、nci-h596細胞系dna和nci-h929細胞系dna。采用上述幾種細胞系的dna來形成本申請的陰性參考品具有使參考品的dna存在狀態(tài)與待檢樣本的dna存在狀態(tài)更接近的優(yōu)勢。為了使本申請的標準品在使用時更便利，并進一步提高檢驗的準確性，根據(jù)本發(fā)明一種典型的實施方式，標準品還包括陽性參考品；優(yōu)選的，陽性參考品為表1所示的突變位點的dna混合物；更優(yōu)選，陽性參考品中的dna混合物中各突變位點的變異頻率如表2的l1級別所示。其具體使用濃度也可以根據(jù)實際需要進行合理設(shè)置。根據(jù)本發(fā)明一種典型的實施方式，標準品還包括至少兩個級別的變異頻率的重復(fù)性參考品；優(yōu)選的，重復(fù)性參考品為表1所示的突變位點的dna混合物；更優(yōu)選，重復(fù)性參考品為表2所示的l1級別的變異頻率的重復(fù)性參考品和l2級別的變異頻率的重復(fù)性參考品。通過上述重復(fù)性參考品能夠檢驗重復(fù)檢驗結(jié)果的準確性，是結(jié)果更可靠。根據(jù)本發(fā)明一種典型的實施方式，提供一種如上述任一種標準品在檢驗肺癌基因檢測試劑盒的檢測靈敏度方面的應(yīng)用。應(yīng)用本申請的標準品，不但可以根據(jù)結(jié)果判斷該試劑盒能夠檢出基因突變及基因頻次，驗證現(xiàn)有試劑盒檢測結(jié)果的準確性，也為臨床用藥提供更準確的指導(dǎo)。下面將結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明的有益效果。實施例1一、標準品的配制(1)原料從南京科佰生物科技有限公司購買7種腫瘤細胞系(pc-9、nci-h1975、kyse450、sw48、nci-h2228、nci-h3122、hcc78)作為肺癌用藥基因檢測試劑(可逆末端終止測序法)國家參考品的陽性參考品原料。從南京科佰生物科技有限公司購買了1種正常細胞系(beas-2b)和3種腫瘤細胞系(amo-1、nci-h596、nci-h929)作為肺癌用藥基因檢測試劑(可逆末端終止測序法)國家參考品的陰性參考品原料。對上述細胞進行培養(yǎng)后進行基因組dna提取，并于-20℃保存。(2)陰性參考品配制對beas-2b細胞系dna、amo-1細胞系dna、nci-h596細胞系dna和nci-h929細胞系dna分別進行qubit定量得到細胞系dna的濃度(ng/μl)，根據(jù)濃度，每種細胞系dna各取30μg進行超聲打斷，打斷后用ddh2o稀釋至5ng/μl作為陰性參考品n1、n2、n3、n4。(3)陽性參考品、重復(fù)性參考品、最低檢出限參考品配制將上述包含8種突變位點的7種細胞系dna進行qubit定量及ddpcr檢測。根據(jù)濃度及突變頻率檢測結(jié)果，將7種細胞系dna進行混合，使其混合后8個突變位點頻率相近。詳細信息如下表5：表5將上述7種細胞系dna按比例進行混合，配制53.94μg各位點頻率約為5.78％的陽性參考品母液，詳細信息如下表6：表6再用各位點均為野生型的beas-2b細胞系dna對各位點頻率約為5.78％的陽性參考品母液進行稀釋，將各位點的突變頻率分別稀釋成2％、1％、0.5％、0.1％，超聲打斷后再用ddh2o將dna濃度稀釋至5ng/μl。將理論頻率為2％的dna混合液作為陽性參考品p1、重復(fù)性參考品r1、最低檢出限參考品l1；將理論頻率為1％的dna混合液作為重復(fù)性參考品r2、最低檢出限參考品l2；將理論頻率為0.5％的dna混合液作為最低檢出限參考品l3；將理論頻率為0.1％的dna混合液作為最低檢出限參考品l4。使用0.5ml規(guī)格的螺口冷凍管分裝后貼好標簽于-20℃冷凍保存。二、對各標準品的突變頻次進行檢測對各標準品進行ddpcr檢測，檢測結(jié)果如下表7：表7三、標準品在檢驗肺癌基因檢測試劑盒的檢測靈敏度方面的應(yīng)用采用kapabiosystems公司生產(chǎn)的建庫試劑盒(kk8504)和康為公司生產(chǎn)的文庫構(gòu)建試劑盒(cw2585t)及羅氏公司生產(chǎn)的捕獲試劑盒(07145594001)進行檢驗進行實驗，步驟如下：1.末端修復(fù)及加a取處理后的dna樣品和試劑依次加入配制混合液1(見表8)，渦旋震蕩混勻后，于pcr儀中20℃孵育30分鐘，65℃孵育30分鐘。表8組分加入量dna樣品大于等于20ng末端修復(fù)&加a緩沖液7μl末端修復(fù)&加a酶3μl水補足至60μl2.添加接頭向末端修復(fù)&加a后的混合液1中依次加入試劑配制混合液2(見表9)，用移液器吹打混勻后，于pcr儀中20℃孵育15分鐘。表92接頭的使用濃度根據(jù)如下表10進行調(diào)整：表10模板dna量/ng接頭的濃度/μm1000155001525015100155015257.510351.52.50.7510.33.添加接頭后純化(1)將添加接頭后的110μl混合液轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中，向其中加入88μl純化磁珠，用移液器吹打混勻，室溫靜置5～15分鐘，使dna和磁珠充分結(jié)合。(2)將離心管置于磁力架上至溶液澄清后，用移液器吸去上清。(3)向離心管中加入200μl80％乙醇，室溫靜置30秒，用移液器吸去上清。(4)重復(fù)上一步，室溫靜置3～5分鐘至乙醇完全揮發(fā)。注：避免磁珠過干。(5)乙醇完全揮發(fā)后，從磁力架上取下離心管，每個離心管中分別依次加入22μl水，用移液器吹打混勻，室溫靜置2分鐘。(6)將離心管置于磁力架上至溶液上清澄清后，取1μl上清用于qubit定量。4.文庫富集(1)按表11要求依次加入試劑配制混合液3于pcr管中。表11組分加入量(μl)上清202×hifi熱啟動酶緩沖液25pre-pcr引物5合計50(2)調(diào)整移液器至最佳量程上下吹打混勻液體并蓋好pcr管蓋，短暫離心。(3)將配制好的混合液3置于pcr儀，按以下表12反應(yīng)程序擴增：表123具體循環(huán)數(shù)可根據(jù)如下表13進行調(diào)整：表13pcr模板dna量/ng循環(huán)數(shù)0.512-13111-1259-11107-9505-61003-45001-2注：擴增后的產(chǎn)物于4℃或-20℃保存，但不超過72小時。(4)擴增后純化及片段大小分選①將50μl擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中，加入50μl純化磁珠，渦旋震蕩混勻。室溫靜置15分鐘。②將離心管置于磁力架上使磁珠進行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。③向離心管中加入200μl80％乙醇，室溫靜置30秒，用移液器吸去上清。④重復(fù)上一步，室溫靜置3～5分鐘至乙醇完全揮發(fā)。注：避免磁珠過干。⑤從磁力架上取下離心管，加50μl水，用移液器吹打混勻，室溫靜置2分鐘。⑥將離心管置于磁力架上使磁珠進行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器移取50μl上清至新的離心管中。⑦向上述50μl上清中加入35μl純化磁珠，渦旋震蕩混勻，室溫靜置10分鐘。⑧將離心管置于磁力架上使磁珠進行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸取上清約85μl于新的離心管中注：此步需小心留取上清，而非棄上清。⑨向上述85μl上清中，加入10μl純化磁珠，渦旋震蕩混勻，室溫靜置10分鐘。⑩將離心管置于磁力架上使磁珠進行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。向離心管中加入200μl80％乙醇，室溫靜置30秒，用移液器吸去上清。重復(fù)上一步，室溫靜置數(shù)秒至乙醇完全揮發(fā)。注：避免磁珠過干。乙醇完全揮發(fā)后，從磁力架上取下離心管，加52μl水，用移液器吹打混勻，室溫靜置2分鐘。將離心管置于磁力架上使磁珠進行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸取1μl進行qubit定量檢測，吸取50μl上清至新的離心管中。dna文庫樣品質(zhì)量分析：對文庫樣品進行qubit定量，濃度應(yīng)不小于2.5ng/μl；用2100生物分析儀分析文庫大小，應(yīng)在于150～500bp之間。注：純化后的文庫溶液應(yīng)在-20℃條件下保存，于7天內(nèi)完成后續(xù)處理。5.文庫雜交和捕獲(1)按表14要求依次加入試劑配制混合液4于新的1.5ml離心管中：表14組分加入量dna文庫混合樣品1μg4雜交通用引物1000pmol雜交index引物1000pmol5cotdna5μl4根據(jù)文庫樣品濃度計算樣本量，按下表15等質(zhì)量加入文庫樣本。1個捕獲樣本至少加入8個文庫，至多加入12個文庫：表15組分加入量dna文庫樣品1125dna文庫樣品2125dna文庫樣品3125dna文庫樣品4125dna文庫樣品5125dna文庫樣品6125dna文庫樣品7125dna文庫樣品81255應(yīng)加入與接頭相對應(yīng)的雜交index引物，加入量根據(jù)以下表16格調(diào)整：表16(2)用移液器吹打混勻后，用真空離心濃縮儀在60℃、1350r/min下進行干燥，直至液體完全蒸干。(3)待液體蒸干后，按下表17加入試劑配制混合液5：表17組分加入量(μl)2×雜交緩沖液7.5雜交組分a3合計10.5(4)向干燥后的混合液4中，加入10.5μl混合液5配成雜交混合液，渦旋震蕩混勻，短暫離心以去除管壁殘留。于恒溫金屬浴儀95℃孵育10分鐘使dna變性，短暫離心以去除管壁殘留。(5)用移液器將雜交混合液轉(zhuǎn)移至新的pcr管中，加入4.5μl探針，渦旋震蕩混勻，短暫離心以去除管壁殘留。于pcr儀47℃孵育16～20小時，同時pcr儀加熱蓋溫度設(shè)置為57℃以上。6.文庫清洗(1)緩沖液的稀釋方法(見表18)：表18組分超純水加入量(μl)30μl-10×洗脫緩沖液i27020μl-10×洗脫緩沖液ii18020μl-10×洗脫緩沖液iii18040μl-10×洗脫緩沖液iv360200μl-2.5×磁珠洗脫緩沖液300(2)取100μl1×洗脫緩沖液i和400μl1×洗脫緩沖液iv在47℃預(yù)熱至少2小時。(3)取100μl捕獲磁珠于新的1.5ml離心管中，將離心管置于磁力架上使磁珠進行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。(4)從磁力架上取下離心管，加入200μl1×磁珠洗脫緩沖液，渦旋震蕩混勻。將離心管置于磁力架上使磁珠進行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。(5)重復(fù)上一步。(6)向離心管加入100μl1×磁珠洗脫緩沖液，渦旋震蕩混勻。將離心管置于磁力架上使磁珠進行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。(7)取雜交后的文庫樣品15μl，加入到磁珠離心管中，用移液器吹打混勻，于pcr儀47℃孵育45分鐘。每間隔15分鐘渦旋震蕩3秒，使磁珠處于懸浮狀態(tài)。(8)孵育結(jié)束后，向離心管中加入100μl47℃預(yù)熱的1×洗脫緩沖液i，渦旋震蕩混勻。(9)將離心管置于磁力架上使磁珠進行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。(10)從磁力架上取下離心管，加入200μl47℃預(yù)熱的1×洗脫緩沖液iv，用移液器吹打混勻。于恒溫金屬浴儀47℃孵育5分鐘。(11)重復(fù)一次(9)-(10)的步驟。(12)將離心管置于磁力架上使磁珠進行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。(13)從磁力架上取下離心管，每個離心管中分別依次加入200μl未加熱的1×洗脫緩沖液i，渦旋震蕩2分鐘。將離心管置于磁力架上使磁珠進行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。(14)從磁力架上取下離心管，每個離心管中分別依次加入200μl1×洗脫緩沖液ii，渦旋震蕩1分鐘。將離心管置于磁力架上使磁珠進行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。(15)從磁力架上取下離心管，每個離心管中分別依次加入200μl1×洗脫緩沖液iii，渦旋震蕩30秒。將離心管置于磁力架上使磁珠進行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。(16)從磁力架上取下離心管，加入40μl水，用移液器吹打混勻。將混勻后的液體標記為“1”。7.捕獲樣本富集及純化(1)按下表19要求配制混合液6表19(2)將混合液6與“1”混合，渦旋震蕩混勻。按50μl/管分裝量分裝到兩個新的pcr管中，按以下表20反應(yīng)程序擴增：表20注：擴增后的產(chǎn)物可于2～8℃保存，但不超過72小時。(3)將100μl擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中，加入180μl純化磁珠，渦旋震蕩混勻。室溫靜置15分鐘。(4)將離心管置于磁力架上使磁珠進行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。(5)向離心管中加入200μl80％乙醇，室溫靜置30秒，用移液器吸去上清。(6)重復(fù)上一步，室溫靜置3～5分鐘至乙醇完全揮發(fā)。注：避免磁珠過干。(7)乙醇完全揮發(fā)后，從磁力架上取下離心管，分別加入52μl水。用移液器吹打混勻，室溫靜置2分鐘。(8)將離心管置于磁力架上使磁珠進行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器轉(zhuǎn)移50μl上清于新的離心管中。此時捕獲的文庫樣品處于上清中。注：純化后的文庫溶液應(yīng)在-20℃以下保存7天。8.上機測序使用illumina公司生產(chǎn)的nextseq500測序儀及相關(guān)配套試劑進行上機測序。經(jīng)過生物信息學(xué)分析，得出下列結(jié)論：對陰性參考品進行ngs測序，結(jié)果如表21：表21陽性參考品ngs檢測結(jié)果如表22：表22陽性參考品符合率：對p1進行檢測，egfrg719s/e746_a750del/s768i/t790m/l858r、eml4基因6號外顯子和alk基因20號外顯子融合、eml4基因13號外顯子和alk基因20號外顯子融合、slc34a2基因4號外顯子和ros1基因32號外顯子融合8個位點均可檢出。陰性參考品符合率：對n1、n2、n3、n4分別進行檢測，egfrg719s/e746_a750del/s768i/t790m/l858r、eml4基因6號外顯子和alk基因20號外顯子融合、eml4基因13號外顯子和alk基因20號外顯子融合、slc34a2基因4號外顯子和ros1基因32號外顯子融合8個位點均為陰性。重復(fù)性：對r1和r2重復(fù)檢測10次，egfrg719s/e746_a750del/s768i/t790m/l858r、eml4基因6號外顯子和alk基因20號外顯子融合、eml4基因13號外顯子和alk基因20號外顯子融合、slc34a2基因4號外顯子和ros1基因32號外顯子融合8個位點均可檢出。最低檢出限：對l1、l2、l3進行檢測，egfrg719s/e746_a750del/s768i/t790m/l858r、eml4基因6號外顯子和alk基因20號外顯子融合、eml4基因13號外顯子和alk基因20號外顯子融合、slc34a2基因4號外顯子和ros1基因32號外顯子融合8個位點均可檢出；對l4進行檢測，egfrg719s/e746_a750del/s768i/t790m/l858r、eml4基因6號外顯子和alk基因20號外顯子融合、eml4基因13號外顯子和alk基因20號外顯子融合、slc34a2基因4號外顯子和ros1基因32號外顯子融合8個位點可檢出或全檢不出。而且，對上述兩個公司的檢測試劑盒中的各突變位點的檢測結(jié)果如下：kapa建庫試劑盒+羅氏捕獲試劑盒的檢測結(jié)果見下表23：表23康為建庫試劑盒+羅氏捕獲試劑盒檢測結(jié)果見表24：表24綜上所述，kapa建庫試劑盒+羅氏捕獲試劑盒對于l1～l3的8個位點均能夠穩(wěn)定檢出，l4中egfrg719s、egfrl8589r及三個融合突變未檢出，因此認為該試劑盒針對上述5個位點的檢出能力在l3水平?？禐榻◣煸噭┖?羅氏捕獲試劑盒對于l1～l2的8個位點均能夠穩(wěn)定檢出，l3及l(fā)4各位點均未檢出因此認為該試劑盒的8個位點檢出能力在l2水平。比較兩種試劑盒對于標準品檢測結(jié)果能夠發(fā)現(xiàn)，kapa建庫試劑盒檢測限低于康為建庫試劑盒。從以上的描述中，可以看出，本發(fā)明上述的實施例實現(xiàn)了如下技術(shù)效果：本申請的上述肺癌臨床耐藥基因檢測的標準品，通過包含上述肺癌突變相關(guān)的多個基因突變位點的dna混合物作為最低檢測限參考品，且該標準品中包括至少兩個級別的變異頻率的dna混合物，能夠檢驗不同廠家的試劑盒在檢測相應(yīng)基因突變時，是否能檢測出突變，以及所能檢測的突變頻率，從而能夠驗證各試劑盒的檢測結(jié)果的準確性和可靠性，進而為臨床用藥提供相對準確的指導(dǎo)意義。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當前第1頁12