本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種多功能新型雙酶梭菌及其在發(fā)酵產(chǎn)氫、提高乙酸產(chǎn)量中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

雙酶梭菌是一種嚴(yán)格厭氧的發(fā)酵產(chǎn)氫菌，可以利用葡萄糖等發(fā)酵底物產(chǎn)生氫氣和揮發(fā)性短鏈脂肪酸，其革蘭氏染色為陽性。

隨著化石燃料使用帶來的氣候變化和空氣污染問題日益凸顯，生物氫因其清潔可再生且具有高燃燒熱(122kj/g)等特點(diǎn)，因此，具有巨大的應(yīng)用前景。生物氫主要由產(chǎn)氫微生物通過暗發(fā)酵產(chǎn)生，這類微生物主要有梭菌屬clostridium、腸桿菌屬enterobacter和芽孢桿菌屬bacillus等，其中梭菌屬因其底物多樣，易于培養(yǎng)，產(chǎn)氫量高等特點(diǎn)受到廣泛關(guān)注和研究。然而，氫氣產(chǎn)量低、速率慢仍是制約大規(guī)模生物制氫產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸，因此，新型高效產(chǎn)氫菌的分離是走出當(dāng)前困境的重要途徑。

異化鐵還原菌是一類具備將胞內(nèi)有機(jī)物氧化和胞外變價(jià)金屬礦物中高價(jià)金屬還原藕聯(lián)發(fā)生能力的微生物，在此藕聯(lián)過程中，胞外礦物作為電子受體接收來自胞內(nèi)有機(jī)物氧化產(chǎn)生的電子從而完成電子的傳遞過程。根據(jù)胞外傳遞的電子能否用于微生物的能量代謝，異化鐵還原菌可分為，呼吸型異化鐵還原菌和發(fā)酵型異化鐵還原菌，前者胞外電子傳遞過程藕聯(lián)呼吸鏈產(chǎn)生能量，而后者沒有能量的儲(chǔ)存。這種微生物氧化有機(jī)物產(chǎn)生的電子傳遞到胞外還原變價(jià)礦物中高價(jià)金屬離子的過程稱為胞外電子傳遞。相比革蘭氏陽性發(fā)酵型的異化鐵還原菌，革蘭氏陰性呼吸型的異化鐵還原菌胞外電子傳遞的機(jī)制研究已經(jīng)取得了重大進(jìn)展，而革蘭氏陽性菌因其具有較厚的細(xì)胞壁及莢膜結(jié)構(gòu)，胞外電子傳遞過程的研究相對(duì)困難。

電活性微生物是一類能夠產(chǎn)生電流或接收電流從而完成生命代謝活動(dòng)的微生物，已有的研究結(jié)果表明，盡管很多異化鐵還原菌具有電活性，但并不是所有的異化鐵還原菌都具有產(chǎn)生電流的能力。目前發(fā)現(xiàn)的電活性微生物主要集中于革蘭氏陰性地桿菌屬geobacter和希瓦氏菌屬shewanella,而具有電化學(xué)活性的革蘭氏陽性梭菌clostridium卻很少有報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種多功能雙酶梭菌及其應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為：

一種多功能雙酶梭菌，菌株為雙酶梭菌clostridiumbifermentansez-1，已于2017年3月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏號(hào)為cgmccno.13913。所述雙酶梭菌ez-1株，clostridiumbifermentansstrainez-1，分離自黃河三角洲土壤。

所述菌株厭氧培養(yǎng)于pyg培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基pyg成分為：蛋白胨：0.2～5g/l，胰蛋白胨：0.2～5g/l，酵母提取物：0.2～10g/l，葡萄糖：5～10g/l，cacl2：0.008g/l，mgso4·7h2o：0.016g/l，k2hpo4：0.04g/l，kh2so4：0.04g/l，nahco3：0.04g/l，nacl：5g/l，l-cysteine：0.25g/l；溫度：30℃；ph：6.3(±0.2)。

一種多功能雙酶梭菌的應(yīng)用，所述雙酶梭菌在發(fā)酵產(chǎn)生氫氣和揮發(fā)性短鏈脂肪酸中的應(yīng)用。

所述雙酶梭菌能夠利用葡萄糖為底物快速生長并產(chǎn)生氫氣、揮發(fā)性短鏈脂肪酸(乙酸和丁酸)。

一種多功能雙酶梭菌的應(yīng)用，所述雙酶梭菌在還原三價(jià)鐵中的應(yīng)用。所述三價(jià)鐵可為可溶性的(如，檸檬酸鐵)、無定形的(如，水鐵礦)、晶型的(如，磁鐵礦)三價(jià)鐵。

所述雙酶梭菌作為異化鐵還原菌在代謝產(chǎn)乙酸中的應(yīng)用。

一種多功能雙酶梭菌的應(yīng)用，所述菌株在微生物燃料電池中的應(yīng)用。

進(jìn)一步的說是30℃，黑暗條件下，該菌在微生物燃料電池中具有電流輸出的能力，最大電流輸出密度可達(dá)6.3ma/m²。

一種產(chǎn)氫氣的方法，將雙酶梭菌clostridiumbifermentansez-1在利用葡萄糖于30～37℃厭氧發(fā)酵培養(yǎng)4～48h，即獲得氫氣和揮發(fā)性短鏈脂肪酸。

所述菌株以1～10％的接種量接種于pyg培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)。

一種產(chǎn)乙酸的方法，將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的雙酶梭菌clostridiumbifermentansez-1接種至含納米鐵氧化物的pyg培養(yǎng)基中于30～37℃下黑暗培養(yǎng)4～48h，即獲得乙酸。

所述納米鐵氧化物為磁鐵礦和水鐵礦，其中，培養(yǎng)基中磁鐵礦(fe3o4)終濃度為2.5～10mm/l；水鐵礦(feooh)終濃度為5.0～10mm/l；所述菌株(od600＝2)的接種量為1～10％。

本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明中分離得到的雙酶梭菌同時(shí)具備發(fā)酵產(chǎn)氫、產(chǎn)電和異化鐵還原能力，是一株多功能新型菌株，具有廣闊的應(yīng)用領(lǐng)域，并且通過添加納米鐵氧化物，從而可改變?cè)摼甏x途徑進(jìn)而增強(qiáng)發(fā)酵產(chǎn)物乙酸途徑；具體為：

1)本發(fā)明分離獲得的能快速生長產(chǎn)氫的革蘭氏陽性雙酶梭菌clostridiumbifermentansez-1，其特點(diǎn)在于易于培養(yǎng)，生長快且產(chǎn)氫速率高。同時(shí)具有異化鐵還原和產(chǎn)電能力，是研究胞外電子傳遞的合適材料。此外，將有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)換為電能具有廣闊的應(yīng)用前景。

2)本發(fā)明分離得到的雙酶梭菌在適當(dāng)濃度的金屬氧化物、磁鐵礦和水鐵礦的存在下，可以調(diào)節(jié)代謝途徑，增強(qiáng)發(fā)酵產(chǎn)物乙酸途徑，這種通過添加金屬氧化物來調(diào)節(jié)菌株代謝途徑進(jìn)而增強(qiáng)目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量的方法具有較強(qiáng)的應(yīng)用潛勢(shì)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明獲得菌株(cgmccno.13913)在pyg固體培養(yǎng)皿上形成的單菌落形態(tài)圖；

圖2為本發(fā)明獲得菌株(cgmccno.13913)在顯微鏡下(400×)形態(tài)圖；

圖3為本發(fā)明獲得菌株(cgmccno.13913)的生長曲線(od600)圖；

圖4為本發(fā)明獲得菌株(cgmccno.13913)發(fā)酵產(chǎn)氫圖；

圖5為本發(fā)明獲得菌株(cgmccno.13913)還原檸檬酸鐵中三價(jià)鐵圖；

圖6為本發(fā)明獲得菌株(cgmccno.13913)還原納米磁鐵礦和水鐵礦中的三價(jià)鐵生成二價(jià)鐵圖；

圖7為本發(fā)明獲得菌株(cgmccno.13913)在不同濃度鐵氧化物添加條件下，乙酸的生成情況圖；

圖8為本發(fā)明獲得菌株(cgmccno.13913)在微生物燃料電池中產(chǎn)生電流圖。

具體實(shí)施方式

通過附圖說明和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

實(shí)施例1

雙酶梭菌clostridiumbifermentansez-1的分離鑒定：

1)取富集的黃河三角洲土壤上清，按10-10⁶倍梯度稀釋，接種環(huán)蘸取稀釋10⁶倍的土壤上清，在含有2％瓊脂糖pyg培養(yǎng)皿上進(jìn)行分區(qū)劃線，30℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h～48h，得到單菌落，菌落呈圓形白色如圖1所示。

2)挑選單菌落移入20μl無菌水,取2μl菌懸液用于pcr擴(kuò)增，剩余的18μl接入10mlpyg液體培養(yǎng)基中于30℃條件下暗培養(yǎng)24～48h，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)如圖2所示。

3)pcr體系:2μlbuffer緩沖液；2μldntp底物；0.5μltaq酶；0.5μlba907r反向引物；0.5μlba27f正向引物；2μl單菌落懸濁液模板；2.5μl無菌水。

pcr程序：95℃，5min，細(xì)菌裂解，dna解鏈；55℃，30s，復(fù)性，引物及酶結(jié)合；72℃，1.5min，延伸；循環(huán)30次。

引物：反向引物ba907r：5’-agagtttgatcctggctcag-3’；正向引物ba27f：5’-ccgtcaattcctttragttt-3’。

4)16srdna測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在greengens上進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果顯示該菌與雙酶梭菌clostridiumbifermentans有97.99％的相似性。

實(shí)施例2

雙酶梭菌clostridiumbifermentansez-1厭氧發(fā)酵及產(chǎn)物鑒定：

1)培養(yǎng)基pyg：蛋白胨：0.2～5g/l，胰蛋白胨：0.2～5g/l，酵母提取物：0.2～10g/l，葡萄糖：5～10g/l，cacl2：0.008g/l，mgso4·7h2o：0.016g/l，k2hpo4：0.04g/l，kh2so4：0.04g/l，nahco3：0.04g/l，nacl：5g/l，l-cysteine：0.25g/l；ph6.3(±0.2)

2)將上述pyg培養(yǎng)基分裝于25ml血清瓶中，每瓶10ml，加硅膠塞。除氧：抽真空6min，沖氮?dú)?0s；抽真空3min，沖氮?dú)?0s；抽真空1min，沖氮?dú)?0s。鋁蓋密封，121℃，20min高壓蒸汽滅菌。

3)向除氧注射器中接種雙酶梭菌clostridiumbifermentansez-1，接種量為1％，進(jìn)行生長情況測(cè)定，結(jié)果如圖3所示。取200μl頂部氣體進(jìn)行氣相色譜(gc)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖4所示；取100μl液體，去離子水稀釋10×后進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)(hplc)，檢測(cè)結(jié)果如圖5所示。

由上述各圖可見，該雙酶梭菌在pyg液體培養(yǎng)基37℃暗培養(yǎng)條件下，能快速發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生氫氣、乙酸和丁酸生物制品，相比已報(bào)道的暗發(fā)酵產(chǎn)氫梭菌，該菌可將發(fā)酵延滯期縮短到4h以內(nèi)。

實(shí)施例3

雙酶梭菌clostridiumbifermentansez-1異化鐵還原能力檢測(cè)：

1)向高壓蒸汽滅菌后的pyg培養(yǎng)基中分別添加：磁鐵礦(fe3o4)終濃度為2.5～10mm/l；水鐵礦(feooh)終濃度為5.0～10mm/l；檸檬酸鐵終濃度為10～40mm/l。

2)而后接種在pyg液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的雙酶梭菌，接種量為1％，30℃，黑暗培養(yǎng)48h。

3)用菲啰嗪法檢測(cè)培養(yǎng)前后培養(yǎng)基中二價(jià)鐵濃度的變化情況如圖6所示。

由上述各圖可見，該雙酶梭菌具有較強(qiáng)的鐵還原能力，不僅能將可溶性和無定形鐵還原，還能將納米磁鐵礦中的晶型鐵還原?？梢娫摼旮锾m氏陽性菌雙酶梭菌均有對(duì)三價(jià)鐵的還原能力，尤其是對(duì)晶型鐵納米磁鐵礦的還原能力顯著。

實(shí)施例4

納米鐵氧化物調(diào)節(jié)雙酶梭菌clostridiumbifermentansez-1代謝途徑，增強(qiáng)乙酸產(chǎn)量：

1)向高壓蒸汽滅菌后的pyg培養(yǎng)基中分別添加：磁鐵礦(fe3o4)終濃度為2.5～10mm/l；水鐵礦(feooh)終濃度為5.0～20mm/l。

2)而后接種在pyg液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的雙酶梭菌，接種量為1％，30℃，黑暗培養(yǎng)48h。

3)hplc檢測(cè)不同濃度鐵氧化添加對(duì)乙酸生成量的影響情況結(jié)果如圖7所示。

由上述各圖可見，納米鐵氧化物可以調(diào)節(jié)該雙酶梭菌的代謝途徑，在磁鐵礦(fe3o4)終濃度為2.5～10mm/l，水鐵礦(feooh)終濃度為5.0～20mm/l時(shí)，這兩種納米鐵氧化物可以增強(qiáng)產(chǎn)乙酸代謝途徑，從而提高乙酸的產(chǎn)量；而當(dāng)鐵氧化物的濃度過高時(shí)則會(huì)抑制雙酶梭菌的發(fā)酵過程，如添加20mm/l水鐵礦，48h后葡萄糖有殘留。

實(shí)施例5

雙酶梭菌clostridiumbifermentansez-1電化學(xué)活性檢測(cè)：

1)組建“h”型微生物燃料電池，以石墨片(30mm×25mm×3mm)作為電極，外電路連接1kω電阻，以質(zhì)子交換膜將陰陽兩室隔開，陽極為pyg液體培養(yǎng)基，陰極為鐵氰化鉀溶液。

2)微生物燃料電池陽極室接種1％的在pyg液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至指數(shù)期的雙酶梭菌，將連有多行掃描器的數(shù)字電壓表的正負(fù)極分別連接到微生物燃料電池的陽極和陰極，每30s記錄一次電壓，結(jié)果如圖8所示。

由圖8可見，該雙酶梭菌具有產(chǎn)電能力，最大電流輸出密度可達(dá)6.3ma/m²。可見菌株雙酶梭菌clostridiumbifermentans具有一定的電活性。