本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，具體涉及一種動(dòng)物蛋白酶制備羊胎盤肽的方法。

背景技術(shù)：

羊胎盤是由羊的子宮粘膜和尿囊絨毛膜發(fā)生聯(lián)系所形成的，它是在母羊孕育胎兒時(shí)，胎兒血液和母體進(jìn)行養(yǎng)分交換的組織，胎兒不僅可以通過胎盤排除自身的代謝物質(zhì)，還可以從胎盤獲得其生長(zhǎng)發(fā)育所必須的氧氣和養(yǎng)分，因此胎盤中含有活性物質(zhì)以及豐富的營(yíng)養(yǎng)成分。羊胎盤富含各種營(yíng)養(yǎng)素，具有良好的免疫和抗氧化等功能活性，具有很高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值。大量臨床實(shí)驗(yàn)證明，胎盤能過起到強(qiáng)身健體的作用，能夠增加免疫器官指數(shù)，因此廣泛應(yīng)用于腫瘤、呼吸系統(tǒng)等引發(fā)機(jī)體免疫力降低上，但是主要以復(fù)方的形式存在，以羊胎盤為原材料的保健制品正處于開發(fā)階段，潛在著巨大的商業(yè)價(jià)值，對(duì)羊胎盤保健品的制備及主要功效進(jìn)行分析和探討，有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。但是大多數(shù)羊胎盤多作為廢棄物被處理，加工量不到3%，造成巨大的資源浪費(fèi)和污染環(huán)境，另一方面，羊的生殖期較為集中，導(dǎo)致羊胎盤資源在短期內(nèi)難以加工處理，迫切需要拓展羊胎盤的資源化利用途徑。

近年來活性肽的研究是食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)學(xué)方面的研究熱點(diǎn)，但國內(nèi)外有關(guān)制備羊胎盤肽的文獻(xiàn)報(bào)道還比較少。不同蛋白酶都具有相對(duì)的底物專一性，酶切作用位點(diǎn)也不一樣，有必要針對(duì)特定的羊胎盤原料進(jìn)行蛋白酶的篩選，并尋找能夠提高酶解獲得胎盤肽的預(yù)處理方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種動(dòng)物蛋白酶制備羊胎盤肽的方法，肽得率高。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種動(dòng)物蛋白酶制備羊胎盤肽的方法，包括如下步驟：

第一步：取新鮮健康羊胎盤，然后去除胎盤中的血水，冷藏，備用；

第二步：將第一步處理的羊胎盤打漿，然后加入相當(dāng)于漿液體積5倍的蒸餾水，攪拌，離心，收集沉淀；

第三步：第二步的沉淀用動(dòng)物蛋白酶a消化，滅酶10min，離心收集上清；

第四步：在0℃到-5℃之間，將第三步收集的上清液先用30000d的超濾膜進(jìn)行一次超濾，再用5000d的超濾膜進(jìn)行二次超濾，得到羊胎盤肽溶液，最后將羊胎盤溶液在35℃左右殺滅病毒5小時(shí)，即得到羊胎盤肽。

優(yōu)選的，第一步中，所述冷藏為-4℃下冷藏。

優(yōu)選的，第二步為，將第一步處理的羊胎盤用打漿機(jī)打漿，然后加入相當(dāng)于漿液體積5倍的蒸餾水，在磁力攪拌器中20℃攪拌2h，然后在離心杯中離心，收集沉淀。

優(yōu)選的，所述離心為以1000轉(zhuǎn)/分的速度離心35min。

優(yōu)選的，所述消化為在ph7.5～8溫度為37℃條件下并靜置5h；更優(yōu)選的，消化使用動(dòng)物蛋白酶b，添加量?jī)?yōu)選為300u/g。

優(yōu)選的，所述一次超濾膜孔徑為0.002um-0.003um，二次超濾膜孔徑為3-5納米，材料均為psf。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明公開了一種動(dòng)物蛋白酶制備羊胎盤肽的方法，操作方便，步驟簡(jiǎn)單，成本低廉，并且適用于大規(guī)模生產(chǎn)，便于工業(yè)化應(yīng)用，肽得率高，最高得率最高達(dá)45.15%。

附圖說明

圖1為不同酶添加量的水解度。

圖2為不同酶添加量肽得率。

圖3為不同處理酶解上清液中氨基氮質(zhì)量和酸沉后上清液中總氮的質(zhì)量。

具體實(shí)施方式

下面將對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。

本發(fā)明實(shí)施例中所用材料如下：新鮮羊胎盤：蘭州名德農(nóng)牧科技有限公司提供；動(dòng)物蛋白水解酶a、b：酶活單位1500u/g，廠家推薦適宜ph7.0-8.0，適宜溫度50℃,南寧龐博生物工程有限公司；中性蛋白酶：酶活單位200000u/g，廠家推薦適宜ph7.0-7.5，適宜溫度50℃,南寧龐博生物工程有限公司；堿性蛋白酶：酶活單位200000u/g，廠家推薦適宜ph7.5-9.0，適宜溫度50℃，南寧龐博生物工程有限公司；

試劑如下：磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯乙酸、濃鹽酸、濃硫酸、溴甲酚綠、甲基紅、硫酸銅、硫酸鉀、氫氧化鈉、硼酸、lh-n3試劑、lh-n2試劑，配置方法如下：

取49.93g的nah2p04?2h2o固體溶于1600ml的蒸餾水中，配成0.2mol/l的nah2p04溶液；稱取286.56g的na2hpo4?12h2o固體溶于4000ml的蒸餾水中，配成0.2mol/l的na2hpo4溶液。量取480ml的nah2p04溶液和2520ml的na2hpo4溶液，充分混合配成3000ml的ph為7.5的緩沖液；量取585ml的nah2po4溶液和915ml的na2hpo4溶液，充分混合配成1500ml的ph為7.0的緩沖液。(此過程中要用將固體充分溶解后再轉(zhuǎn)移至容量瓶中定容，一次無法溶解完的可以分多次進(jìn)行溶解定容。)

稱取100g三氯乙酸固體，溶于蒸餾水中，然后定容到1000ml，配置成0.1g/ml的三氯乙酸溶液用以酸化。

用移液管移取2ml的濃鹽酸（12mol/l）于燒杯中，加入478ml的蒸餾水，充分混合，配成0.05mol/l的鹽酸用以滴定。

稱取甲基紅和溴甲酚綠各0.1g，分別用無水乙醇溶解，待充分溶解后，移入100ml的容量瓶中定容到100ml。再用移液管移取10ml的甲基紅和50ml的溴甲酚綠于棕色指示劑瓶?jī)?nèi)充分混合，配成混合指示劑。（由于指示劑需要現(xiàn)配現(xiàn)用，此步驟在消化試驗(yàn)時(shí)進(jìn)行）

稱取氫氧化鈉固體400g溶解后定容到1000ml，在凱式定氮時(shí)使用。（由于氫氧化鈉固體溶于水時(shí)會(huì)放出大量的熱，而且有刺鼻味散出，所以我們要在通風(fēng)廚中進(jìn)行，而且要等氫氧化鈉充分溶解后再移入到容量瓶中定容）

稱取硼酸固體20g溶解后定容到1000ml,在凱式定氮儀時(shí)使用。

儀器與設(shè)備如下：fa25高剪切分散乳化機(jī)、fa2004電子分析天平、hx2002t電子天平、l-550臺(tái)式低速離心機(jī)、kq-600de型數(shù)控超聲波清洗器、ub-7酸度計(jì)、df-101s集熱式恒溫加熱攪拌器、gzx-9240mbe電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、sd-1602電磁爐、sh220n石墨消解儀、k9840自動(dòng)凱氏定氮儀、shz-82恒溫振蕩儀、化學(xué)需氧量（cod）快速測(cè)定儀。

分析與計(jì)算方法如下：

水分測(cè)定參照gb/t5009.3—2010食品中水分的測(cè)定方法；蛋白質(zhì)總氮和原料蛋白質(zhì)的測(cè)定方法為凱氏定氮法。

水解度（%）=上清液氨基氮/原料總氮*100%；

肽得率（%）=(上清液總氮-上清液氨基氮）/原料蛋白質(zhì)*100%

實(shí)施例1、羊胎盤的處理

用剪刀將附著在子宮壁上的胎盤逐個(gè)減下，注意盡量不要將胎盤剪碎，保持胎盤的完整性。將剪下的胎盤用大量的清水清洗，盡可能的去處胎盤中的血水。然后稱取一定量的羊胎盤放入冰箱冷藏中待用，將剩余的羊胎盤放入冰箱中冷凍起來，避免羊胎盤腐敗。由于羊胎盤中含有的營(yíng)養(yǎng)較高，因此不用的羊胎盤不可以放在冷藏上保存。

實(shí)施例2、動(dòng)物蛋白酶的篩選

將稱取好的羊胎盤用打漿機(jī)打成漿，打漿的時(shí)候要用塑料燒杯盛放，不可用玻璃燒杯，避免打漿機(jī)高速轉(zhuǎn)動(dòng)的轉(zhuǎn)頭接觸到燒杯壁后發(fā)生炸裂。打漿的時(shí)候用保鮮膜將燒杯口封住，避免漿液迸濺。稱取打好的漿100g，剩余的放入冰箱中冷凍保藏。100g漿中加入500ml的蒸餾水，放在磁力攪拌器中20℃攪拌2h。然后放入離心杯中離心20min，倒去上清液，將離心杯的沉淀刮下來留用。

取9個(gè)150ml的錐形瓶，每個(gè)錐形瓶中加入2g沉淀，然后分別加入0.002g、0.004g、0.006g、0.02g、0.04g、0.06g、0.2g、0.4g、0.6g的動(dòng)物蛋白酶a，再每個(gè)錐形瓶中加入ph為7.5的緩沖液100ml，將錐形瓶用保鮮膜密封。再取9個(gè)150ml的錐形瓶，每個(gè)錐形瓶中加入2g沉淀，然后分別加入0.002g、0.004g、0.006g、0.02g、0.04g、0.06g、0.2g、0.4g、0.6g的動(dòng)物蛋白酶b，再每個(gè)錐形瓶加入ph為7.5的緩沖液100ml，將錐形瓶用保鮮膜密封。放入恒溫振蕩器中設(shè)置50℃，振蕩5h。振蕩完成后取出放入沸水浴中滅酶10min。然后將滅好酶的溶液分別放入離心杯中，離心15min，取上清液并定容到100ml,再倒入干凈的錐形瓶中，放入冰箱冷藏中備用。

打開化學(xué)需氧量（cod）快速測(cè)定儀，預(yù)熱30min，加5ml蒸餾水，加lh-n3試劑0.5ml，再加lh-n2試劑0.5ml，混勻靜置10分鐘，作為空白對(duì)照組。然后置零，取制備的上清液1各5ml分別加入lh-n3試劑0.5ml，再加lh-n2試劑0.5ml，放入化學(xué)所需氧（cod）快速測(cè)定儀中，測(cè)出酶解上清液中氨基氮質(zhì)量，每組做三個(gè)平行試驗(yàn)。

取配置好的樣液15ml，再加入15ml的三氯甲酸，酸沉10min，放入離心機(jī)中離心，取上清液留用。

取57個(gè)消化管，每個(gè)管中先加入0.2g的硫酸銅和3g的硫酸鉀固體，然后將之前配好的18組樣液，每組樣液取5ml加入消化管中，做三組平行，剩余三個(gè)消化管不加樣液作為空白對(duì)照試驗(yàn)，然后每個(gè)管中再加入8ml的濃硫酸，再放入石墨消解儀中進(jìn)行消化。剛開始用180℃消化30min，調(diào)溫到250℃消化30min，再調(diào)溫到320℃消化30min，最后用400℃消化30min，則消化完成。（注意由于濃硫酸具有強(qiáng)腐蝕性，在打開濃硫酸瓶和使用的過程中要小心）由于消化架上的位置只有20個(gè)，因此，我們要按順序分批完成消化過程。

帶消化管及其內(nèi)的物質(zhì)冷卻后，用凱式定氮儀進(jìn)行測(cè)氮。接口的錐形瓶中滴加兩到三滴混合指示劑。在測(cè)氮過程中，設(shè)定儀器上用蒸餾水40ml，氫氧化鈉20ml，硼酸10ml，測(cè)定時(shí)間為5分鐘。測(cè)定完后錐形瓶中溶液呈藍(lán)色。用0.05mol/l的鹽酸對(duì)錐形瓶中溶液進(jìn)行滴定，當(dāng)藍(lán)色變?yōu)闊o色時(shí)，滴定完成，記錄所用的鹽酸體積。（此過程中要注意，再準(zhǔn)備消化時(shí)，漏斗和消化管要放在烘箱中烘干，不可沾水。消化完后，要待消化管充分冷卻后再取下漏斗，不然揮發(fā)的蒸汽中會(huì)帶走部分氮，造成氮損失。使用凱式定氮儀時(shí)，要注意觀察蒸餾水、氫氧化鈉和硼酸桶中的剩余的量，當(dāng)溶液快達(dá)到警報(bào)線時(shí)要及時(shí)補(bǔ)充，還有蒸餾水桶內(nèi)的管要保持干凈，避免酸或堿進(jìn)入，破壞儀器。）

用化學(xué)需氧量（cod）快速測(cè)定儀，同樣的操作測(cè)出酸沉后上清液中總氮的質(zhì)量，每組做三個(gè)平行試驗(yàn)，結(jié)果如圖1和圖2所示。

從圖1可以看出動(dòng)物蛋白酶a和b的水解度都隨著酶活性的增加而增大，而且動(dòng)物蛋白酶b的水解度一直都高于動(dòng)物蛋白酶a的水解度，動(dòng)物蛋白酶b的水解效果好，綜合考慮選擇動(dòng)物蛋白酶b進(jìn)行復(fù)合實(shí)驗(yàn)。

由圖2可以看出，隨著酶添加量的增加，動(dòng)物蛋白酶b的肽得率和水解度始終處于增長(zhǎng)趨勢(shì)，但酶添加量高于45u/g后，肽得率增速放緩，甚至有下降趨勢(shì)；酶添加量高于300u/g后，水解度值下降，300u/g對(duì)應(yīng)的水解度最高，肽得率達(dá)到45.15%，達(dá)到較高值。綜合考慮經(jīng)濟(jì)成本，選擇動(dòng)物蛋白酶b的添加量為300u/g。

實(shí)施例3、動(dòng)物蛋白酶與中性蛋白酶、堿性蛋白酶木瓜蛋白酶和風(fēng)味酶復(fù)合水解

將上步實(shí)驗(yàn)中冷凍的羊胎盤漿解凍，稱取100g漿后做同樣的處理，得到沉淀；取6個(gè)150ml的錐形瓶，每個(gè)錐形瓶中加入2g沉淀，然后編號(hào)1-6號(hào)。1號(hào)和4號(hào)各加入0.4g的動(dòng)物蛋白酶b；2號(hào)加入中性蛋白酶0.08g；3號(hào)同時(shí)加入0.4g的動(dòng)物蛋白酶b和0.08g的中性蛋白酶；5號(hào)加入0.06g的堿性蛋白酶；6號(hào)同時(shí)加入0.4g動(dòng)物蛋白酶b和0.06g的堿性蛋白酶。1-3號(hào)錐形瓶加入ph為7.0的緩沖液，4-6號(hào)錐形瓶加入ph為7.5的緩沖液。然后將錐形瓶用保鮮膜密封，放入恒溫振蕩器中設(shè)置50℃，振蕩5h后1號(hào)加入0.08g的中性蛋白酶，2號(hào)和5號(hào)加入0.4g的動(dòng)物蛋白酶b，4號(hào)中加入0.06g的堿性蛋白酶，再放入恒溫振蕩器振蕩5h。振蕩完成后取出做同樣處理，得到所需的樣液2.

取配置好的樣液30ml，再加入30ml的三氯乙酸，酸化10min，放入離心機(jī)中離心15min，取上清液留用。

取18個(gè)消化管，每個(gè)管中先加入0.2g的硫酸銅和3g的硫酸鉀固體，然后將之前配好的18組樣液，每組樣液取10ml加入消化管中，做三組平行，然后每個(gè)管中再加入10ml的濃硫酸，再放入石墨消解儀中進(jìn)行消化。消化時(shí)要四次調(diào)溫，消化完成后，也用0.05mol/l的鹽酸滴定，記錄所用的鹽酸體積。

將制備的樣液2和酸沉后的樣液2也進(jìn)行同樣氨氮測(cè)定操作，測(cè)出酶解上清液中氨基氮質(zhì)量和酸沉后上清液中總氮的質(zhì)量，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可以看出，動(dòng)物蛋白酶b單獨(dú)作用時(shí)的肽得率為16.35%，動(dòng)物蛋白酶b與堿性蛋白酶同時(shí)添加的水解度為15.62%，先加中性蛋白酶、后加堿性蛋白酶的水解度為15.95%，三者均處于較高值。但從成本角度考慮，動(dòng)物蛋白酶單獨(dú)添加可以達(dá)到水解效果。

由上述實(shí)施例得出堿性蛋白酶b的作用效果由于動(dòng)物蛋白酶a，且單獨(dú)作用效果較好。適宜的酶添加量為300u/g，根據(jù)此結(jié)果得到羊胎盤肽的優(yōu)選工藝如下：

第一步：取新鮮健康羊胎盤，于低溫環(huán)境下進(jìn)行前處理過程，去除表面油污以及結(jié)締組織等，用水清洗干凈；

第二步：將第一步得到的羊胎盤與生理鹽水按1∶1的質(zhì)量比混合，混合后在絞肉機(jī)上絞磨，得到絞磨液；

第三步：利用鋪有滅菌紗布的托盤對(duì)絞磨液進(jìn)行粗濾，得到羊胎盤組織a和粗濾液b；本實(shí)施例中，托盤為特制托盤，被絞磨的羊胎盤組織a留在拖盤內(nèi)，而粗濾液b則會(huì)通過托盤收集至無菌容器；

第四步：將粗濾液b，調(diào)節(jié)ph值至3.5-4.5，并在-20～-25的低溫下保存3-5小時(shí)，之后再將粗濾液b升溫至36-38℃化凍，加入ca(oh)2調(diào)ph值至7.5～8，保持溫度37℃并靜置5小時(shí)，得到組織液c。

第五步：將組織液c，以1000轉(zhuǎn)/分的離心速度離心35分鐘離得上清液d；

第六步：在0℃到-5℃之間，將上清液d先用30000d的超濾膜進(jìn)行一次超濾，其目的是去除多余的大分子量物質(zhì)，之后再用5000d的超濾膜進(jìn)行二次超濾，得到羊胎盤肽溶液e，將e溶液在35℃左右殺滅病毒5小時(shí)，即得到羊胎盤肽。

單純的超濾可能會(huì)過濾掉許多肽分子，讓制取出的羊胎盤肽產(chǎn)量達(dá)不到要求，所以本工藝進(jìn)行了多次超濾過程，將不同分子量的物質(zhì)通過濾膜的孔徑進(jìn)行劃分，使羊胎盤肽的總體產(chǎn)量能夠得到保障。

最終的提取物不只含有肽，還有包括其他小分子物質(zhì)（如rna等），因?yàn)檠蛱ケP中對(duì)人體有益的成分可能還包括一些不屬于肽的小分子，本工藝最大程度的保留了羊胎盤內(nèi)的有效成分，這是多數(shù)方法做不到的。

本實(shí)施例步驟三中的羊胎盤組織a可以通過真空凍干工藝，加工制成羊胎盤凍干粉。相比其他工藝大都是固液混合離心，固體物多被棄置，造成原料物浪費(fèi)，而本工藝則最大化實(shí)現(xiàn)了對(duì)原材料的運(yùn)用。本工藝與羊胎盤凍干粉的加工生產(chǎn)過程有機(jī)地結(jié)合在一起，大大提高了原料利用率，擴(kuò)大了產(chǎn)品的總體價(jià)值，具有廣闊的商業(yè)前景。

本實(shí)施例中，所述步驟三中特制的托盤其規(guī)格為1200mm*800mm，底面開d=10mm的均布小孔。紗布選擇1205mm*805mm的過濾紗布，共兩層。

本實(shí)施例中，所述步驟六中使用的一次超濾膜孔徑為0.002um-0.003um，二次超濾膜孔徑為3-5納米，材料均為psf。

最后說明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。