本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，更具體地，涉及一種抗高血壓活性肽citn-hyp-pro及應用，和一種抗高血壓的藥物組合物。

背景技術(shù)：

《中國心血管病報告2015》指出我國的心血管病患病率處于持續(xù)上升階段。高血壓是心血管疾病的主要危險因素已成共識，它是我國心血管疾病患病率持續(xù)上升的推動因素。2014年衛(wèi)生部統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明我國的高血壓病患率為25.5％，一些省份達到27.9％，全國高血壓患者數(shù)估計達2.7億。

目前，許多抗高血壓藥物被認為是臨床一線的治療藥物，其中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(acei)是臨床效果最好的藥物，如依那普利、卡托普利、苯那普利、賴諾普利、群多普利等。但它們?nèi)匀淮嬖谝欢ǖ母弊饔?，如干咳、皮疹、血管性水腫和腎損傷等。

acei類藥物是一類肽類和修飾氨基酸類物質(zhì)，而天然的蛋白是豐富的肽資源。因此，科學家們一直致力采用酶水解和發(fā)酵的方式制備獲得acei活性肽，以期使高血壓患者得益。如兩個具有抗高血壓生物活性三肽“vpp”(val-pro-pro，vpp)和“ipp”(ile-pro-pro，ipp)被鑒定出來。但是，這種制備方式成本高、重復性低、生物利用率低，迫切需要發(fā)展一種新的替代生產(chǎn)技術(shù)。這些研究都是基于蛋白質(zhì)中蘊含的肽信息，雖然隨著肽分子量的增大，其結(jié)構(gòu)將千差萬別，活性亦將愈加具有潛力，但是由于腸道黏膜的分子篩效應和其富含的肽酶，制約了利用天然蛋白活性資源開發(fā)acei肽類小分子物質(zhì)。因此，如何規(guī)避化學修飾肽類或氨基酸類acei小分子藥物的副作用和避免體內(nèi)肽酶的水解而完整吸收，成為開發(fā)安全無副作用的acei小分子藥物研究熱點。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種抗高血壓活性肽citn-hyp-pro及應用和藥物組合物。

本發(fā)明的第一方面是提供一種抗高血壓活性肽citn-hyp-pro，所述活性肽的氨基酸序列為：瓜氨酰-羥脯氨酰-脯氨酸，具有式i所示結(jié)構(gòu)。簡稱為citn-hyp-pro(citrulline(citn)-hydroxyproline(hyp)-proline(pro))。

本發(fā)明從定量構(gòu)效關系(qsar)出發(fā)，利用食源性稀有氨基酸，結(jié)合抗高血壓活性肽c末端pro耐受肽酶水解的構(gòu)效特點，設計一系列小分子物質(zhì)，通過clcdrugdiscoveryworkbench分析設計小分子物質(zhì)和ace的相互作用的化學特性，初步確定具有抗高血壓的肽分子，通過液相合成法制備，進一步通過體外和體內(nèi)生物活性驗證，篩選確定具有較強抗高血壓活性的合成肽。該抗高血壓活性肽可通過本領域的常規(guī)方法制得，例如液相合成法。

本發(fā)明的第二方面提供所述的抗高血壓活性肽citn-hyp-pro在制備抗高血壓的藥品和食品中的應用。

本發(fā)明的第三方面提供一種抗高血壓的藥物組合物，包括有效成分和輔料，所述的有效成分包括所述的抗高血壓活性肽citn-hyp-pro。

根據(jù)本發(fā)明，所述輔料可以為常規(guī)的各種藥用輔料或食品添加劑。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)勢：

本發(fā)明提出了一種不同的活性肽?，F(xiàn)有技術(shù)從天然蛋白中通過體外蛋白酶解或微生物發(fā)酵分離獲得活性肽，可以被腸道黏膜中富含的肽酶進一步水解，降低了其體內(nèi)實際作用。本發(fā)明的活性肽是由稀有氨基酸和常規(guī)氨基酸構(gòu)成，在天然蛋白中并不存在這樣序列構(gòu)成。因此，本發(fā)明的活性肽可以逃避體內(nèi)蛋白酶的進一步水解，保證了其吸收的完整性和體內(nèi)作用的穩(wěn)定性。

本發(fā)明活性肽的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ace)活性抑制的ic50為69.54μmol/l，采用1.0mg/kg體重的劑量灌胃先天性高血壓大鼠3.5小時后血壓從224mmhg下降到最低點193mmhg，持續(xù)藥效時間為2小時。

本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將在隨后具體實施方式部分予以詳細說明。

附圖說明

通過結(jié)合附圖對本發(fā)明示例性實施方式進行更詳細的描述，本發(fā)明的上述以及其它目的、特征和優(yōu)勢將變得更加明顯。

圖1為citn-hyp-pro對先天性高血壓大鼠血壓作用分析實驗檢測結(jié)果圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進一步詳細的說明，但本發(fā)明不限于以下實施例。以下實施例中，在沒有特別說明時，“％”均指質(zhì)量百分比。

實施例1

citn-hyp-pro三肽的合成。本發(fā)明抗高血壓活性肽通過人工化學合成，具體操作如下：

采用液相多肽合成方法合成本發(fā)明多肽，將一定量的n-叔丁氧羰基瓜氨酸甲酯(boc-cit)和羥基丁二酰亞胺(hosu)置入圓底燒瓶中，加入四氫呋喃(thf)溶解至澄清，繼續(xù)加入二環(huán)己基碳二酰亞胺(dcc)，輕輕攪拌，反應過夜。

進一步地，將上述反應液進行真空抽濾，在濾液中加入丙烯酸乙酯(ea)和h2o進行層析。吸取上層液體，采用nahco3/h2o洗滌2次，再用檸檬酸/h2o洗滌2次，飽和nacl溶液洗滌2次，na2so4干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干獲得的油狀物為n-叔丁氧羰基瓜氨酰丁二酰亞胺(boc-citn-osu)。

進一步地，在n-叔丁氧羰基瓜氨酰丁二酰亞胺(boc-cit-osu)中加入叔丁基羥脯氨酸(hyp(tbu))，溶解于四氫呋喃水溶液(thf:h2o＝2：1)至澄清，堿性條件，室溫攪拌反應2小時。在反應液中邊攪拌邊加入6-8倍體積的無水乙醚，進行層析、4000rpm離心3分鐘。棄上清后用乙醚重復洗滌5次，析出得到白色固體物質(zhì)進行真空干燥得到n-叔丁氧羰基瓜氨酰羥脯氨酰叔丁酯(boc-citnhyp(tbu))。

進一步地，將一定量的n-叔丁氧羰基瓜氨酰羥脯氨酰叔丁酯(boc-citnhyp(tbu))和脯氨酸甲酯鹽酸鹽(pro-ome.hcl)置入圓底燒瓶中，加入二甲基甲酰胺(dmf)溶解至澄清，繼續(xù)加入二環(huán)己基碳二酰亞胺(dcc)，輕輕攪拌，反應過夜。

進一步地，通過薄層層析(tcl)確認反應是否完全。將上述反應液進行真空抽濾，在濾液中加入丙烯酸乙酯(ea)和h2o進行層析。吸取上層液體，采用nahco3/h2o洗滌2次，再用檸檬酸/h2o洗滌2次，飽和nacl溶液洗滌2次，na2so4干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干獲得的油狀物為n-叔丁氧羰基瓜氨酰叔丁基羥脯氨酰脯氨酸甲酯(boc-citn-hyp(tbu)-pro-ome)。

進一步地，在n-叔丁氧羰基瓜氨酰羥叔丁基脯氨酰脯氨酸甲酯(boc-citn-hyp(tbu)-pro-ome)中加入甲醇(meoh)和四氫呋喃(thf)(1:1)溶液進行攪拌反應，溶液澄清后加入氫氧化鋰(lioh)/h2o調(diào)節(jié)ph≈13，保持2小時，通過薄層層析(tcl)確認反應是否完全。將反應液置入分液漏斗，加入聚對苯二甲酸乙二醇酯(pet)反復洗滌2次，截取下層液體。在下層液體中加入丙烯酸乙酯，用2n的hcl調(diào)節(jié)溶液至酸性后，置于分液漏斗分層，通過薄層層析(tcl)確認，截取上層液體。將上層液體用檸檬酸/h2o洗滌2次，飽和nacl溶液洗滌2次，na2so4干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干獲得的油狀物為n-叔丁氧羰基瓜氨酰叔丁基羥脯氨酰脯氨酸(boc-citn-hyp(tbu)-pro-oh)。

在n-叔丁氧羰基瓜氨酰叔丁基羥脯氨酰脯氨酸(boc-citn-hyp(tbu)-pro-oh)中加入4n鹽酸氣/丙烯酸乙酯，溶解至澄清，室溫攪拌反應2小時。在反應液中邊攪拌邊加入6-8倍體積的無水乙醚，進行層析、4000rpm離心3分鐘。棄上清后用乙醚重復洗滌5次，析出得到白色固體物質(zhì)進行真空干燥得到瓜氨酰羥脯氨酰脯氨酸三肽(citn-hyp-pro)粗制品。

進一步地，粗制品通過半制備型反相高效液相色譜(反相柱：30×250毫米依利特c18柱；流動相(a液100％乙腈(acn)，b液100％h2o)，線性梯度14％～80％；流速3毫升/分鐘)分離收集洗脫峰，凍干后備用。

實施例2

體外血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ace)活性抑制試驗。

馬脲酰組氨酰亮氨酸(hippuryl-l-histidyl-l-leucine，hhl)在ace酶的催化下快速分解產(chǎn)生馬尿酸(hippuricacid，ha)和二肽histidyl-leucine(hl)，加入ace酶抑制劑后，ace酶的活性受到抑制，ha和hl的生成量減少，本實施例中ace通過兔肺提取，酶活力為3.19mu/ml，通過dab顯色，采用分光光度計法測定ha生成量，分析ace酶活。乙酸乙酯提取反應物中的馬尿酸，然后在乙酸酐中與含對二甲氨基苯甲醛的吡啶溶液(dab顯色劑)反應生成桔黃色的化合物，直接在459nm比色測定其od值，按下列公式評價ace酶抑制劑對ace酶的抑制率。以50％的ace酶活性受到抑制所需合成三肽的濃度(ic50)定義合成三肽的ace抑制活性。

ace抑制活性(％)＝[(odcontrol-odsample)/(odcontrol-odblank)]×100％

具體反應體系和條件見表1

表1

本實施例方法測得本發(fā)明的活性三肽對ace抑制活性ic50為69.54μmol/l。

實施例3

先天性高血壓大鼠(shr)體內(nèi)降壓試驗。

采用softronbp-98a型大鼠智能無創(chuàng)血壓儀，利用套尾法測定測定大鼠的收縮壓(sbp)。

在shr大鼠(自發(fā)性高血壓大鼠)清醒狀態(tài)下，首先將老鼠放在鼠袋中，保持恒溫，采用softronbp-98a型大鼠智能無創(chuàng)血壓儀進行套尾測定尾靜脈血壓的方法，測定大鼠的收縮壓(sbp)。于實驗前一周開始隔天測定大鼠的血壓，待大鼠穩(wěn)定適應后開始實驗記錄。先測定灌胃前的大鼠血壓，然后1.0mg/kg體重劑量進行樣品(實施例1的活性三肽，citn-hyp-pro)灌胃，空白對照組灌胃等體積生理鹽水(saline)，藥物對照組灌胃10mg/kg體重的抗高血壓藥物卡托普利(captopril)，連續(xù)進行血壓監(jiān)測5小時，樣品灌胃后每30分鐘連續(xù)記錄大鼠血壓。每個測試點均測定3次大鼠的血壓，每次測定的間隔時間約1分鐘，取3次測定值的平均值作為該測試點大鼠的血壓，結(jié)果如圖1所示。

圖1為合成活性肽組大鼠灌胃給藥后的血壓變化情況，其測得數(shù)據(jù)用spss系統(tǒng)軟件進行系統(tǒng)處理，采用t檢驗方法。由實驗結(jié)果可知，與藥物對照組相比，合成肽的降壓效應比藥物組遲滯90分鐘左右，同時效應時間相對較短，大約為2小時。合成活性肽灌胃3.5小時后，shr血壓顯著下降到最低點，在灌胃5小時后，血壓回升到初始壓值。說明本發(fā)明活性肽(citn-hyp-pro)具有較好的降血壓效果。

以上已經(jīng)描述了本發(fā)明的各實施例，上述說明是示例性的，并非窮盡性的，并且也不限于所披露的各實施例。在不偏離所說明的各實施例的范圍和精神的情況下，對于本技術(shù)領域的普通技術(shù)人員來說許多修改和變更都是顯而易見的。