本發(fā)明屬于單細(xì)胞捕捉與配對
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種基于介電電泳的微流控芯片及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：細(xì)胞融合，也被稱為細(xì)胞雜交，是通過誘導(dǎo)和培養(yǎng)等方法，使兩個或兩個以上的同源或異源細(xì)胞在離體條件下形成雜合細(xì)胞的過程。目前已經(jīng)成為現(xiàn)代生物工程技術(shù)研究中的一項重要手段。細(xì)胞融合技術(shù)在遺傳學(xué)、免疫醫(yī)學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、藥物或基因傳輸、雜交育種等研究領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。精準(zhǔn)的單細(xì)胞捕獲和配對是開展細(xì)胞融合研究的前提，因此需要設(shè)計和構(gòu)建行之有效的單細(xì)胞捕獲與配對實驗平臺。介電電泳(dielectrophoresis，dep)是一種在非均勻電場中根據(jù)微粒的介電性質(zhì)對微粒進(jìn)行操縱的技術(shù)。通過改變施加電壓的頻率等條件，能夠控制微粒受正介電電泳力作用向高電場或者受負(fù)介電電泳力作用向低電場運動，從而實現(xiàn)對微粒的操縱。因此，基于dep的方法可以實現(xiàn)有效的高通量的細(xì)胞捕捉與配對的過程。日本兵庫大學(xué)的yasukawa課題組報道了一種基于介電電泳方法的垂直配對細(xì)胞的微流控裝置，此裝置主要利用頂部的ito電極和底部的圖案化的微電極產(chǎn)生的正介電電泳力將兩種細(xì)胞依次捕獲在微腔陣列內(nèi)，實現(xiàn)垂直的高通量細(xì)胞配對的過程。日本東北大學(xué)的matsue課題組報道了一種基于介電電泳方法的細(xì)胞配對的微流控芯片，此芯片中包含有微型的叉指電極和葫蘆形的微腔陣列，細(xì)胞配對的過程是利用頂部的ito電極與底部的叉指電極產(chǎn)生的正介電電泳力依次捕獲兩種細(xì)胞，進(jìn)而形成細(xì)胞對的過程。目前的基于dep方法的高通量細(xì)胞配對的微流控芯片采用的是ito電極在頂部，微電極在底部的方式來產(chǎn)生dep，這種結(jié)構(gòu)的缺點是：(1)聚二甲基硅氧烷(pdms)是微流控芯片中用于微流道制備的最常用的材料，易于與芯片進(jìn)行封裝，并且通過簡單的打孔器即可在pdms上制備芯片的進(jìn)出口，而ito電極在頂部時，封裝過程和進(jìn)出口的制備都更加麻煩；(2)dep捕捉細(xì)胞的過程是在電極間施加交流信號產(chǎn)生非均勻電場進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的定向運動，在配對的過程中，ito在頂部作為兩種細(xì)胞捕獲的共用電極，在捕獲第一種細(xì)胞時，由于感應(yīng)電場的作用，用于捕捉另一種細(xì)胞的位置也會被第一種細(xì)胞占據(jù)，影響芯片的配對效率。因此，如何簡化芯片封裝過程，提高芯片的配對效率是當(dāng)前迫切需要解決的問題。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對上述問題，本發(fā)明的主要目的在于開發(fā)了一種基于介電電泳的微流控芯片及其制備方法和應(yīng)用，所述微流控芯片通過改變“上下”結(jié)構(gòu)為“平面”結(jié)構(gòu)不僅使芯片封裝過程簡化，而且可以有效提高芯片的配對效率。為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種基于介電電泳的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括底部的平面形芯片16和頂部的微流道13，所述平面形芯片具有依次疊加的四層結(jié)構(gòu)；所述平面芯片的第一層結(jié)構(gòu)1包括在玻璃基底上的電極，所述電極為叉指電極2；所述平面芯片的第二層結(jié)構(gòu)3包括微腔陣列8，用于細(xì)胞捕捉；所述平面芯片的第三層結(jié)構(gòu)4包括導(dǎo)電層10，用于形成叉指電極兩端的導(dǎo)電區(qū)域；所述平面芯片的第四層結(jié)構(gòu)5包括微腔陣列12和位于微腔陣列中的微擋板11，所述微腔陣列12用于細(xì)胞配對，所述微擋板11用于細(xì)胞接觸；所述第二層結(jié)構(gòu)(3)和第四層結(jié)構(gòu)(5)上還包括微流通道(9)，用于在細(xì)胞配對后將每個微腔陣列中的細(xì)胞沖到微擋板的位置。本發(fā)明中，所述叉指電極在施加電信號的情況下，產(chǎn)生非均勻電場，細(xì)胞在正向介電泳力的作用下，被捕捉到電極表面。根據(jù)本發(fā)明，為透明導(dǎo)電材料，優(yōu)選為ito(銦錫氧化物)、azo(鋁摻雜的氧化鋅的透明導(dǎo)電玻璃)或石墨烯中的任意一種或至少兩種的組合，優(yōu)選為ito。優(yōu)選地，所述叉指電極2的數(shù)量為2-10，例如可以是2、3、4、5、6、7、8、9或10，優(yōu)選為2。本發(fā)明中，所述叉指電極為2套以上，由于后續(xù)是兩種以上的熒光細(xì)胞進(jìn)行捕捉和配對，所述叉指電極要與所述熒光細(xì)胞的種類對應(yīng)，以能夠?qū)崿F(xiàn)不同的熒光細(xì)胞與不同的叉指電極配合，從而單獨實現(xiàn)捕捉，在進(jìn)行配對。優(yōu)選地，所述叉指電極(2)的寬度為10-30μm，例如可以是10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、21μm、22μm、23μm、24μm、25μm、26μm、27μm、28μm、29μm或30μm，優(yōu)選為15-25μm，進(jìn)一步優(yōu)選為20μm。優(yōu)選地，所述叉指電極(6)中兩根電極之間的間距為3-10μm，例如可以是3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm或10μm，優(yōu)選為6μm。優(yōu)選地，所述叉指電極(6)和叉指電極(7)的間距為5-50μm，例如可以是5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、18μm、20μm、22μm、23μm、25μm、28μm、30μm、32μm、33μm、35μm、38μm、40μm、42μm、45μm、48μm或50μm，優(yōu)選為10μm。本發(fā)明中，所述叉指電極的長度可以根據(jù)所做的平面形芯片的尺寸進(jìn)行調(diào)整。本發(fā)明中，采用上述尺寸的叉指電極才能夠產(chǎn)生足夠強的電場進(jìn)而形成足夠的吸引單個細(xì)胞的介電電泳力，其深度和間距都是相關(guān)聯(lián)的，只有在本申請的范圍內(nèi)才能實現(xiàn)單細(xì)胞的捕捉和配對。根據(jù)本發(fā)明，所述第二層結(jié)構(gòu)3的材料為負(fù)膠，優(yōu)選為su-8負(fù)膠。優(yōu)選地，所述微腔陣列8的直徑可根據(jù)單個細(xì)胞的尺寸進(jìn)行設(shè)計，微腔的厚度跟介電泳力大小相關(guān)，越深介電泳力越小，越淺介電泳力越大，本發(fā)明中所述微腔陣列8的直徑為10-30μm，例如可以是10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、21μm、22μm、23μm、24μm、25μm、26μm、27μm、28μm、29μm或30μm，優(yōu)選為15-25μm，進(jìn)一步優(yōu)選為20μm。優(yōu)選地，所述微腔陣列8的深度為1-20μm，例如可以是1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、17μm、17μm、18μm、19μm或20μm，優(yōu)選為5-15μm，進(jìn)一步優(yōu)選為10μm。根據(jù)本發(fā)明，所述導(dǎo)電層10的材料為銅、、銀、鉻或ito中的任意一種或至少兩種的組合，優(yōu)選為銅。優(yōu)選地，所述導(dǎo)電層10的尺寸為的厚度為0.5-5μm，例如可以是0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm或5μm，優(yōu)選為1μm。本發(fā)明中，由于導(dǎo)電層位于第三層結(jié)構(gòu)，而第二層結(jié)構(gòu)為負(fù)膠材料，所以在第二層結(jié)構(gòu)設(shè)置了腔體用于將導(dǎo)電層與第一層結(jié)構(gòu)聯(lián)通，用于導(dǎo)電，所述腔體的大小，本領(lǐng)域技術(shù)人員只需滿足導(dǎo)電層和第一層結(jié)構(gòu)的聯(lián)通導(dǎo)電即可，在此不作特殊限定。優(yōu)選地，所述第二層結(jié)構(gòu)3和第四層結(jié)構(gòu)5上的微流通道9位置對應(yīng)，尺寸相同。本發(fā)明中，所述第四層結(jié)構(gòu)5上的微流通道9穿過了微擋板11，當(dāng)液體沖完細(xì)胞后可以從微擋板的位置流出去。優(yōu)選地，所述微流通道9的寬度為3-15μm，例如可以是3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm或15μm，優(yōu)選為8μm。根據(jù)本發(fā)明，所述第四層結(jié)構(gòu)5的材料為負(fù)膠，優(yōu)選為su-8負(fù)膠。優(yōu)選地，所述微腔陣列12的直徑為130-200μm，例如可以是130μm、132μm、135μm、138μm、140μm、145μm、150μm、155μm、170μm、175μm、170μm、175μm、180μm、185μm、190μm、195μm或200μm，優(yōu)選為150-170μm，進(jìn)一步優(yōu)選為170μm。優(yōu)選地，所述微腔陣列12的深度為10-30μm，例如可以是10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、17μm、17μm、18μm、19μm、20μm、21μm、22μm、23μm、24μm、25μm、26μm、27μm、28μm、29μm或30μm，優(yōu)選為15-25μm，進(jìn)一步優(yōu)選為20μm。優(yōu)選地，所述微擋板11的形狀為只要能夠?qū)ε鋵蟮募?xì)胞沖入微腔陣列中實現(xiàn)遮擋功能的微擋板都是可行的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整，本申請采用半圓形、正方形或長方形中的任意一種或至少兩種的組合。優(yōu)選地，所述微擋板11的尺寸根據(jù)微流道的尺寸進(jìn)行調(diào)整，所述微擋板的尺寸為可以遮擋從微流道沖入微腔陣列的細(xì)胞，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整，本申請微擋板11的的寬度為30-50μm，例如可以是30μm、31μm、32μm、33μm、35μm、36μm、38μm、40μm、41μm、43μm、45μm、48μm或50μm，優(yōu)選為40μm，所述微擋板11的長度為50-70μm，例如可以是50μm、52μm、53μm、55μm、56μm、58μm、60μm、62μm、65μm、68μm或70μm，優(yōu)選為60μm。根據(jù)本發(fā)明，所述微流道13的材料為透明硅膠類材料，優(yōu)選為pdms。優(yōu)選地，所述微流道13包括進(jìn)樣流道14、出樣流道15和工作流道17。優(yōu)選地，所述進(jìn)樣流道14和出樣流道15為逐級分支狀。優(yōu)選地，所述進(jìn)樣流道14的深度為100-500μm，例如可以是100μm、102μm、103μm、105μm、110μm、115μm、120μm、125μm、130μm、132μm、135μm、138μm、140μm、145μm、150μm、160μm、170μm、180μm、200μm、220μm、250μm、260μm、280μm、300μm、320μm、350μm、380μm、400μm、420μm、450μm、480μm或500μm，優(yōu)選為120-200μm，進(jìn)一步優(yōu)選為125μm。優(yōu)選地，所述出樣流道15的深度為100-500μm，例如可以是100μm、102μm、103μm、105μm、110μm、115μm、120μm、125μm、130μm、132μm、135μm、138μm、140μm、145μm、150μm、160μm、170μm、180μm、200μm、220μm、250μm、260μm、280μm、300μm、320μm、350μm、380μm、400μm、420μm、450μm、480μm或500μm，優(yōu)選為120-200μm，優(yōu)選為120-130μm，進(jìn)一步優(yōu)選為125μm。優(yōu)選地，所述工作流道17的深度為50-150μm，例如可以是50μm、51μm、53μm、55μm、58μm、60μm、61μm、63μm、65μm、68μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm、100μm、105μm、110μm、115μm、120μm、125μm、130μm、135μm、140μm、145μm或150μm，優(yōu)選為70-100μm，進(jìn)一步優(yōu)選為80μm。第二方面，本發(fā)明提供一種如第一方面所述的微流控芯片的制備方法，包括如下步驟：(1)采用光刻法、濕法刻蝕和磁控濺射的方法制備平面形芯片的四層結(jié)構(gòu)；(2)采用3d打印的方式制備微流道的模具，將pdms前驅(qū)體澆筑在模具內(nèi)，50-80℃優(yōu)選為55℃熱烘1-5h，優(yōu)選為3h，得到所述微流道；(3)將所述平面性芯片和微流道組裝，得到所述微流控芯片。本發(fā)明中，具體的第一層結(jié)構(gòu)通過光刻法和濕法刻蝕相結(jié)合的方式進(jìn)行制備，第二層結(jié)構(gòu)采用光刻法進(jìn)行制備，第三層結(jié)構(gòu)采用磁控濺射法進(jìn)行制備，第四層結(jié)構(gòu)采用光刻法進(jìn)行制備。第三方面，本發(fā)明提供如第一方面所述的微流控芯片用于單細(xì)胞捕捉和配對。根據(jù)本發(fā)明，所述但細(xì)胞捕捉和配對包括如下步驟：1)制備兩種不同顏色熒光標(biāo)記的細(xì)胞分散液；2)將綠色熒光細(xì)胞分散液微流控芯片上的微流道13的進(jìn)樣流道14中，在施加正弦交流信號的叉指電極a6之間產(chǎn)生非均勻電場，使得細(xì)胞在正介電電泳力的作用下捕捉到一側(cè)的微腔陣列8中，用緩沖液將多余的細(xì)胞沖走，實現(xiàn)綠色熒光細(xì)胞陣列的捕捉；3)紅色熒光細(xì)胞分散液加入微流控芯片上的微流道13的進(jìn)樣流道14中，在施加正弦交流信號的叉指電極b7之間產(chǎn)生非均勻電場，進(jìn)而使得細(xì)胞在正介電電泳力的作用下捕捉到另一側(cè)的微腔陣列8中，用緩沖液將多余的細(xì)胞沖走，實現(xiàn)紅色熒光細(xì)胞陣列的捕捉，同時兩種熒光細(xì)胞形成細(xì)胞配對；4)將微流道13用夾具與平面形芯片16緊密貼合，從進(jìn)樣流道14引進(jìn)緩沖液，緩沖液通過微流通道9流入，將每個微腔陣列8中配對的兩個細(xì)胞沖到微腔陣列12的微擋板11上，實現(xiàn)細(xì)胞的接觸。優(yōu)選地，步驟1)所述細(xì)胞分散液的制備具體包括：用兩種熒光標(biāo)記染料分別染色細(xì)胞，再將發(fā)紅光和綠光的兩種細(xì)胞分散在低導(dǎo)電性緩沖液中，得到2×105-2×107/ml優(yōu)選為2×106/ml細(xì)胞濃度的分散液。優(yōu)選地，步驟2)所述的綠色熒光細(xì)胞分散液在進(jìn)樣流道中的流速為5-20μl/min，例如可以是5μl/min、6μl/min、7μl/min、8μl/min、9μl/min、10μl/min、11μl/min、12μl/min、13μl/min、14μl/min、15μl/min、17μl/min、17μl/min、18μl/min、19μl/min或20μl/min，優(yōu)選為10μl/min。優(yōu)選地，步驟2)所述的捕捉的時間為1-10min，例如可以是1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min或10min，優(yōu)選為3-5min。優(yōu)選地，步驟3)所述的紅色熒光細(xì)胞分散液在進(jìn)樣流道中的流速為5-20μl/min，例如可以是5μl/min、6μl/min、7μl/min、8μl/min、9μl/min、10μl/min、11μl/min、12μl/min、13μl/min、14μl/min、15μl/min、17μl/min、17μl/min、18μl/min、19μl/min或20μl/min，優(yōu)選為10μl/min。優(yōu)選地，步驟3)所述的捕捉的時間為1-10min，例如可以是1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min或10min，優(yōu)選為3-5min。優(yōu)選地，步驟2)和步驟3)所述的正弦交流信號為正弦脈沖交流電，所述交流電的電壓峰峰值5-20vpp，例如可以是5vpp、6vpp、7vpp、8vpp、9vpp、10vpp、11vpp、12vpp、13vpp、14vpp、15vpp、16vpp、17vpp、18vpp、19vpp或20vpp，優(yōu)選12vpp。優(yōu)選地，所述交流電的頻率2-10mhz，例如可以是2mhz、3mhz、4mhz、5mhz、6mhz、7mhz、8mhz、9mhz或10mhz，優(yōu)選4mhz。微流控芯片的工作原理包括以下步驟：1)制備兩種不同顏色熒光標(biāo)記的細(xì)胞分散液：用兩種熒光標(biāo)記染料分別染色細(xì)胞，再將發(fā)紅光和綠光的兩種細(xì)胞分散在低導(dǎo)電性緩沖液中，得到2×105-2×107/ml細(xì)胞濃度的分散液；2)將綠色熒光細(xì)胞分散液微流控芯片上的微流道13的進(jìn)樣流道14中，流速為5-20μl/min，在施加正弦交流信號的叉指電極6之間產(chǎn)生非均勻電場，使得細(xì)胞在正介電電泳力的作用下捕捉到一側(cè)的微腔陣列8中，捕捉1-10min，用緩沖液將多余的細(xì)胞沖走，實現(xiàn)綠色熒光細(xì)胞陣列的捕捉；3)紅色熒光細(xì)胞分散液加入微流控芯片上的微流道13的進(jìn)樣流道14中，流速為5-20μl/min，在施加正弦交流信號的叉指電極7之間產(chǎn)生非均勻電場，進(jìn)而使得細(xì)胞在正介電電泳力的作用下捕捉到另一側(cè)的微腔陣列8中，捕捉1-10min，用緩沖液將多余的細(xì)胞沖走，實現(xiàn)紅色熒光細(xì)胞陣列的捕捉，同時兩種熒光細(xì)胞形成細(xì)胞配對；其中，所述施加正弦交流信號的交流電的電壓峰峰值5-20vpp，所述交流電的頻率2-10mhz；4)將微流道13用夾具與平面形芯片17緊密貼合，從進(jìn)樣流道14引進(jìn)緩沖液，緩沖液通過微流通道9流入，將每個微腔陣列8中配對的兩個細(xì)胞沖到微腔陣列12的微擋板11上，實現(xiàn)細(xì)胞的接觸。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：(1)本發(fā)明微流控芯片的平面形結(jié)構(gòu)易于封裝，通量高；(2)本發(fā)明的微流控芯片進(jìn)行高通量單細(xì)胞捕捉和配對，所述方法配對效率高，配對效率可達(dá)60％，局部配對效率可達(dá)80％。附圖說明圖1為本發(fā)明的基于介電電泳的微流控芯片中平面形芯片的結(jié)構(gòu)示意圖；其中，圖中1-第一層結(jié)構(gòu)，2-叉指電極，3-第二層結(jié)構(gòu)，4-第三層結(jié)構(gòu)，5-第四層結(jié)構(gòu)；圖2為本發(fā)明平面形芯片中第一層結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)示意圖；其中，圖中6-叉指電極a，7-叉指電極b；圖3為本發(fā)明平面形芯片中第二層結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)示意圖；其中，圖中8-微腔陣列，9-微流通道；圖4為本發(fā)明平面形芯片中第三層結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)示意圖；其中，圖中10-導(dǎo)電層；圖5為本發(fā)明平面形芯片中第四層結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)示意圖；其中，圖中11-微擋板，12-微腔陣列；圖6為本發(fā)明的基于介電電泳的微流控芯片的結(jié)構(gòu)示意圖；其中，圖中13-微流道，14-進(jìn)樣流道，15-出樣流道，16-平面形芯片，17-工作流道；圖7為本發(fā)明細(xì)胞配對結(jié)果圖。具體實施方式為更進(jìn)一步闡述本發(fā)明所采取的技術(shù)手段及其效果，以下結(jié)合附圖并通過具體實施方式來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明并非局限在實施例范圍內(nèi)。實施例1：基于介電電泳的微流控芯片如圖6所示，是本發(fā)明實施例所述基于介電電泳的微流控芯片的示意圖，所述微流控芯片具體的結(jié)構(gòu)如圖1-5所示，所述微流控芯片包括底部的平面形芯片16和頂部的微流道13，所述平面形芯片具有依次疊加的四層結(jié)構(gòu)；所述平面芯片的第一層結(jié)構(gòu)1包括在玻璃基底上的ito電極，所述ito電極為叉指電極2，所述叉指電極2的數(shù)量為2-10，所述叉指電極2的寬度為10-30μm，所述叉指電極6中兩根電極之間的間距為3-10μm，所述叉指電極6和叉指電極7的間距為5-50μm；所述平面芯片的第二層結(jié)構(gòu)3為su-8負(fù)膠，所示第二層結(jié)構(gòu)3包括微腔陣列8，用于細(xì)胞捕捉，所述微腔陣列8的直徑為10-30μm，所述微腔陣列8的深度為1-20μm；所述平面芯片的第三層結(jié)構(gòu)4包括銅導(dǎo)電層10，用于形成叉指電極兩端的導(dǎo)電區(qū)域，所述銅導(dǎo)電層10的的厚度為0.5-5μm；所述平面芯片的第四層結(jié)構(gòu)5包括微腔陣列12和位于微腔陣列中的微擋板11，所述微腔陣列12用于細(xì)胞配對，所述微擋板11用于細(xì)胞接觸，所述微腔陣列12的直徑為130-200μm，所述微腔陣列12的深度為10-30μm，所述微擋板11的形狀為半圓形，所述微擋板11的寬度為30-50μm，所述微擋板11的長度為50-70μm。所述第二層結(jié)構(gòu)3和第四層結(jié)構(gòu)5上還包括微流通道9，用于在細(xì)胞配對后將每個微腔陣列中的細(xì)胞沖到微擋板的位置，所述微流通道9的的寬度為3-15μm；所述微流道13包括進(jìn)樣流道14、出樣流道15和工作流道17；所述進(jìn)樣流道14和出樣流道15為逐級分支狀；所述進(jìn)樣流道14的深度為100-500μm，所述出樣流道15的深度為100-500μm；所述工作流道17的深度為50-150μm。微流控芯片的工作原理包括以下步驟：1)制備兩種不同顏色熒光標(biāo)記的細(xì)胞分散液：用兩種熒光標(biāo)記染料分別染色細(xì)胞，再將發(fā)紅光和綠光的兩種細(xì)胞分散在低導(dǎo)電性緩沖液中，得到2×105-2×107/ml細(xì)胞濃度的分散液；2)將綠色熒光細(xì)胞分散液微流控芯片上的微流道13的進(jìn)樣流道14中，流速為5-20μl/min，在施加正弦交流信號的叉指電極6之間產(chǎn)生非均勻電場，使得細(xì)胞在正介電電泳力的作用下捕捉到一側(cè)的微腔陣列8中，捕捉1-10min，用緩沖液將多余的細(xì)胞沖走，實現(xiàn)綠色熒光細(xì)胞陣列的捕捉；3)紅色熒光細(xì)胞分散液加入微流控芯片上的微流道13的進(jìn)樣流道14中，流速為5-20μl/min，在施加正弦交流信號的叉指電極7之間產(chǎn)生非均勻電場，進(jìn)而使得細(xì)胞在正介電電泳力的作用下捕捉到另一側(cè)的微腔陣列8中，捕捉1-10min，用緩沖液將多余的細(xì)胞沖走，實現(xiàn)紅色熒光細(xì)胞陣列的捕捉，同時兩種熒光細(xì)胞形成細(xì)胞配對；其中，所述施加正弦交流信號的交流電的電壓峰峰值5-20vpp，所述交流電的頻率2-10mhz；4)將微流道13用夾具與平面形芯片17緊密貼合，從進(jìn)樣流道14引進(jìn)緩沖液，緩沖液通過微流通道9流入，將每個微腔陣列8中配對的兩個細(xì)胞沖到微腔陣列12的微擋板11上，實現(xiàn)細(xì)胞的接觸。實施例2：基于介電電泳的微流控芯片所述微流控芯片包括底部的平面形芯片16和頂部的微流道13，所述平面形芯片具有依次疊加的四層結(jié)構(gòu)；所述平面芯片的第一層結(jié)構(gòu)1包括在玻璃基底上的ito電極，所述ito電極為叉指電極2，所述叉指電極2的數(shù)量為2，所述叉指電極2的寬度為20μm，所述叉指電極6中兩根電極之間的間距為6μm，所述叉指電極6和叉指電極7的間距為10μm；所述平面芯片的第二層結(jié)構(gòu)3為su-8負(fù)膠，所示第二層結(jié)構(gòu)3包括微腔陣列8，用于細(xì)胞捕捉，所述微腔陣列8的直徑為20μm，所述微腔陣列8的深度為10μm；所述平面芯片的第三層結(jié)構(gòu)4包括銅導(dǎo)電層10，用于形成叉指電極兩端的導(dǎo)電區(qū)域，所述銅導(dǎo)電層10的的厚度為1μm；所述平面芯片的第四層結(jié)構(gòu)5包括微腔陣列12和位于微腔陣列中的微擋板11，所述微腔陣列12用于細(xì)胞配對，所述微擋板11用于細(xì)胞接觸，所述微腔陣列12的直徑為170μm，所述微腔陣列12的深度為20μm，所述微擋板11的形狀為半圓形，所述微擋板11的寬度40μm，所述微擋板11的長度為60μm；所述第二層結(jié)構(gòu)3和第三層結(jié)構(gòu)4之間還包括微流通道9，用于在細(xì)胞配對后將每個微腔陣列中的細(xì)胞沖到微擋板的位置，所述微流通道9的寬度為8μm；所述微流道13包括進(jìn)樣流道14、出樣流道15和工作流道17；所述進(jìn)樣流道14和出樣流道15為逐級分支狀；所述進(jìn)樣流道14的深度為125μm，所述出樣流道15的深度為125μm；所述工作流道17的深度為80μm。實施例3：細(xì)胞的捕捉和配對采用實施例2所述的基于介電電泳的微流控芯片，進(jìn)行細(xì)胞的捕捉和配對，具體步驟如下：1)制備兩種不同顏色熒光標(biāo)記的細(xì)胞分散液：用兩種熒光標(biāo)記染料分別染色細(xì)胞，再將發(fā)紅光和綠光的兩種細(xì)胞分散在低導(dǎo)電性緩沖液中，得到2×106/ml細(xì)胞濃度的分散液；2)將綠色熒光細(xì)胞分散液微流控芯片上的微流道13的進(jìn)樣流道14中，流速為10μl/min，在施加正弦交流信號的叉指電極6之間產(chǎn)生非均勻電場，使得細(xì)胞在正介電電泳力的作用下捕捉到一側(cè)的微腔陣列8中，捕捉3-5min，用緩沖液將多余的細(xì)胞沖走，實現(xiàn)綠色熒光細(xì)胞陣列的捕捉；3)紅色熒光細(xì)胞分散液加入微流控芯片上的微流道13的進(jìn)樣流道14中，流速為10μl/min，在施加正弦交流信號的叉指電極7之間產(chǎn)生非均勻電場，進(jìn)而使得細(xì)胞在正介電電泳力的作用下捕捉到另一側(cè)的微腔陣列8中，捕捉3-5min，用緩沖液將多余的細(xì)胞沖走，實現(xiàn)紅色熒光細(xì)胞陣列的捕捉，同時兩種熒光細(xì)胞形成細(xì)胞配對；其中，所述施加正弦交流信號的交流電的電壓峰峰值12vpp，所述交流電的頻率4mhz；4)將微流道13用夾具與平面形芯片17緊密貼合，從進(jìn)樣流道14引進(jìn)緩沖液，緩沖液通過微流通道9流入，將每個微腔陣列8中配對的兩個細(xì)胞沖到微腔陣列12的微擋板11上，實現(xiàn)細(xì)胞的接觸。用熒光顯微鏡檢測細(xì)胞的捕捉效率，先捕捉綠色熒光細(xì)胞，使用藍(lán)色激光激發(fā)綠色熒光細(xì)胞發(fā)出綠光，記錄綠色熒光細(xì)胞圖像，再捕捉紅色熒光細(xì)胞，使用綠色激光激發(fā)紅色熒光細(xì)胞發(fā)出紅光，記錄紅色熒光細(xì)胞圖像，再用軟件將兩種熒光細(xì)胞圖片合并到一起，計算單個細(xì)胞配對效率。結(jié)果如圖7所示，通過單個細(xì)胞捕捉配對后，計算的細(xì)胞配對效率為80％。實施例4與實施例2相比，除了叉指電極2的寬度為10μm，所述叉指電極6中兩根電極之間的間距為3μm，所述叉指電極6和叉指電極7的間距為5μm，其他部件與實施例2相同。實施例5與實施例2相比，除了叉指電極2的寬度為30μm，所述叉指電極6中兩根電極之間的間距為10μm，所述叉指電極6和叉指電極7的間距為50μm，其他部件與實施例2相同。對比例1與實施例2相比，除了叉指電極6中兩根電極之間的間距為15μm，其他部件與實施例2相同。對比例2與實施例2相比，除了叉指電極6和叉指電極7的間距為55μm，其他部件與實施例2相同。對比例3與實施例2相比，除了叉指電極6和叉指電極7的間距為1μm，其他部件與實施例2相同，叉指電極相隔太近，無法形成足夠的介電電泳力。對比例4與實施例2相比，除了微腔陣列8的深度為25μm，其他部件與實施例2相同。對比例5結(jié)構(gòu)與實施例2相同，與實施例3相比，除了所述施加正弦交流信號的交流電的電壓峰峰值2vpp，其他部件與實施例3相同，介電電泳力太小，無法進(jìn)行細(xì)胞捕捉。實施例2、實施例4-5和對比例1、2、4檢測的結(jié)果如下表1所示：表1實施例2實施例4實施例5對比例1對比例2對比例4配對率80％68％65％48％43％40％從表1可以看出，叉指電極的尺寸對配對效率產(chǎn)生了影響，實施例2中的配對率可達(dá)80％，而當(dāng)叉指電極的尺寸不在本申請的范圍內(nèi)時，其不能產(chǎn)生足夠的電場，不能形成足夠的吸引單個細(xì)胞的介電電泳力，且叉指電極的各個尺寸是相互關(guān)聯(lián)的，只有在本申請的叉指電極的范圍內(nèi)，才能夠?qū)崿F(xiàn)單細(xì)胞的有效配對。綜合實施例與對比例，本發(fā)明的微流控芯片進(jìn)行高通量單細(xì)胞捕捉和配對，所述方法配對效率高，配對效率可達(dá)60％以上，局部配對效率可達(dá)80％。申請人聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明的詳細(xì)方法，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)方法才能實施。所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進(jìn)，對本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁12