本發(fā)明涉及一種分離水蛭素發(fā)酵液中色素分子的方法,屬于生物醫(yī)藥的分離純化。
背景技術(shù):
1884年,人們?cè)卺t(yī)用水蛭(hirudomeduimalis)中發(fā)現(xiàn)有很強(qiáng)的抗凝物質(zhì),命名為水蛭素(hirudinhir)。到1950年以后,從醫(yī)用水蛭唾液腺中分離得到具有生物活性的水蛭素。七十年代初確定,水蛭素是凝血酶的特異性抑制劑。八十年代,確定了水蛭素的氨基酸序列,并對(duì)其構(gòu)數(shù)關(guān)系及其生物學(xué)作用機(jī)理進(jìn)行了一系列研究,水蛭素是一個(gè)由多種異構(gòu)體所組成的家族,常見有三種分別為hv-1、hv-2和hv-3,異構(gòu)體間有高度的同源性,都是由65個(gè)氨基酸所組成的單鏈多肽,分子量約為7000da,氨基酸組成分析表明,水蛭素分子中不含精氨酸和色氨酸,而富含谷氨酸、天門冬氨酸以及谷氨酰胺和天門冬酰胺,比活性約為10000iu/mg蛋白。
由于水蛭素具有重要的醫(yī)藥價(jià)值,而天然水蛭素來源限制,故國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥界均著重研究通過基因工程獲得重組水蛭素。基于已知的水蛭素氨基酸序列,在體外合成相應(yīng)序列dna片段,插入重組表達(dá)載體,在大腸桿菌和酵母細(xì)胞中表達(dá)。畢赤酵母(pichiapastoris)表達(dá)系統(tǒng)是具有分泌優(yōu)勢(shì)的高表達(dá)真核系統(tǒng)。其分泌表達(dá)量高,酵母工程菌穩(wěn)定性好,高密度發(fā)酵條件下,能大大提高產(chǎn)物的表達(dá)水平等。
重組水蛭素的成功構(gòu)建表達(dá)后,需要對(duì)重組水蛭素進(jìn)行分離純化工作,優(yōu)化的分離純化方法可以使水蛭素純度提高,成本降低。傳統(tǒng)的分離重組水蛭素以去除色素分子多采用兩步法:1、超濾膜濃縮水蛭素;2、低溫乙醇沉淀濃縮后的水蛭素,分離色素分子?,F(xiàn)有的分離技術(shù)具有以下難點(diǎn):1、兩步法超濾濃縮--乙醇沉淀后水蛭素活性蛋白回收率在40%左右,蛋白回收率較低;2、因發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生蛋白降解酶,而該降解酶會(huì)水解水蛭素活性,因此超濾濃縮時(shí)間過長(zhǎng),不利于水蛭素活性的穩(wěn)定;且超濾膜的消耗較大,濃縮成本高;3、兩步法乙醇使用量大,不利于環(huán)保。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的是針對(duì)目前現(xiàn)有分離技術(shù)出現(xiàn)的問題,提供一種快速分離水蛭素發(fā)酵液中色素分子的方法,使用疏水作用色譜分離提純,提高水蛭素蛋白回收率。
為了達(dá)到上述發(fā)明目的,本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
一種分離水蛭素發(fā)酵液中色素分子的方法,所述方法包括在水蛭素發(fā)酵液中加入疏水色譜填料進(jìn)行吸附,吸附沉淀洗脫后,即得分離色素分子的水蛭素蛋白。
疏水色譜填料由化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、機(jī)械強(qiáng)度好的載體和疏水表面基團(tuán)組成,因而疏水色譜填料的表面具有弱疏水特性。而水蛭素蛋白表面存在一些疏水區(qū)域,蛋白質(zhì)分子中的疏水區(qū)域可以與填料表面產(chǎn)生疏水性相互作用而被吸附,而發(fā)酵液中色素分子的疏水性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于水蛭素蛋白,其與疏水色譜填料吸附性不強(qiáng),當(dāng)水蛭素發(fā)酵液經(jīng)疏水色譜填料吸附洗脫時(shí),根據(jù)疏水性差異,疏水性低的色素分子先被洗脫出來,水蛭素蛋白隨后被洗脫出來,從而實(shí)現(xiàn)色素分子與水蛭素蛋白的分離。且水蛭素蛋白與疏水色譜填料的疏水作用是一種很溫和的相互作用,在洗脫后能保持蛋白分子的結(jié)構(gòu)和活性。
作為優(yōu)選,所述疏水色譜填料由硅膠基質(zhì)以及表面鍵合苯甲基基團(tuán)形成。硅膠表面鍵合苯甲基基團(tuán),苯甲基基團(tuán)的疏水性要大于普通的羥丙基、甲基、丙基等鍵合基團(tuán),表面鍵合基團(tuán)疏水性越大,水蛭素蛋白與之疏水作用越強(qiáng),吸附洗脫的時(shí)間越長(zhǎng),從而更易與色素分子分離,但是硅膠表面鍵合基團(tuán)的疏水性太強(qiáng),會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子不可逆吸附和生物活性損失,因此本發(fā)明選擇苯甲基基團(tuán)作為硅膠表面鍵合基團(tuán)。
作為優(yōu)選,所述疏水色譜填料顆粒度為15-25μm,孔徑為
作為優(yōu)選,所述疏水色譜填料在使用前經(jīng)過預(yù)處理,所述預(yù)處理包括以下步驟:在疏水色譜填料中加入乙醇,超聲振蕩后,抽濾除去乙醇,抽濾沉淀物依次經(jīng)蒸餾水、ph為4.8-5.2的40-80mmol/l磷酸緩沖液(pb)淋洗,直至流出液ph為4.8-5.2,抽干,在2-8℃保存?zhèn)溆?,在臨用前用2-3倍疏水色譜填料體積的平衡液淋洗。疏水色譜填料只有經(jīng)過預(yù)處理,才能有效吸附蛋白質(zhì)。
作為優(yōu)選,所述吸附過程包括:按10-15mg水蛭素蛋白/g疏水色譜填料的量取疏水色譜填料,置于經(jīng)預(yù)處理后的水蛭素發(fā)酵液中,攪拌靜置,待疏水色譜填料完全沉降,取沉淀待用。
在水蛭素發(fā)酵液中加入疏水色譜填料,充分?jǐn)嚢韬?,靜置10-20分鐘,取上清液測(cè)水蛭素蛋白活性,若有活性,繼續(xù)補(bǔ)充疏水色譜填料,直至無活性檢出。我們的實(shí)驗(yàn)表明,疏水色譜填料的量按15mg水蛭素蛋白/g干重疏水色譜填料量取,在靜置10-20分鐘后,上清液基本無活性,表明蛋白吸附完全。當(dāng)然也可以量取更多量的疏水色譜填料,使蛋白的吸附更加完全和穩(wěn)固。該吸附過程獲得沉淀的方法非常簡(jiǎn)單,只需吸附液靜置1-2h,待疏水色譜填料完全沉降,利用虹吸法去除上清液,就可獲得吸附沉淀。
作為優(yōu)選,所述水蛭素發(fā)酵液的預(yù)處理包括加入2-5mol/l氯化鈉,并且調(diào)ph值為4.8-5.2。水蛭素發(fā)酵液經(jīng)過一定濃度氯化鈉處理,可以增加發(fā)酵液中蛋白質(zhì)的疏水性,使蛋白質(zhì)完全被吸附在填料表面。
作為優(yōu)選,所述洗脫過程包括:將吸附沉淀先用大于5倍沉淀體積的平衡液淋洗,然后用緩沖液1洗至無色素流出,再用2-3倍沉淀體積的緩沖液2洗脫,收集洗脫液,即為分離色素分子的水蛭素蛋白。
所述平衡液的離子強(qiáng)度>緩沖液1>緩沖液2。
進(jìn)一步優(yōu)選,所述平衡液的配方為:2-5mol/l氯化鈉,40-80mmol/l磷酸緩沖液,ph4.8-5.2。所述緩沖液1的配方為:1-4mol/l氯化鈉,40-80mmol/l磷酸緩沖液,ph為4.8-5.2;所述緩沖液2為ph4.8-5.2的40-80mmol/l磷酸緩沖液。
水蛭素蛋白與疏水色譜填料在高離子強(qiáng)度的平衡液淋洗下,疏水作用得到加強(qiáng),然后逐漸降低緩沖液的離子強(qiáng)度,與疏水色譜填料疏水性弱的色素分子先被洗脫出來,此時(shí)的洗脫液不收集,洗至無色素流出,換更低離子強(qiáng)度的緩沖液2繼續(xù)洗脫,水蛭素蛋白逐漸被洗脫出來,收集洗脫液,該洗脫液即為水蛭素蛋白活性部分。
作為優(yōu)選,所述方法還包括疏水色譜填料再生,再生步驟包括:經(jīng)洗脫后的沉淀,依次用乙醇、蒸餾水和平衡液淋洗,所述平衡液的配方為:2-5mol/l氯化鈉,40-80mmol/l磷酸緩沖液,ph4.8-5.2。抽干即得再生疏水色譜填料。經(jīng)過再生處理,實(shí)現(xiàn)疏水色譜填料的循環(huán)利用。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比,有益效果是:
1、整個(gè)吸附洗脫過程操作簡(jiǎn)單。且水蛭素發(fā)酵液中的培養(yǎng)基成分、蛋白降解酶、有機(jī)溶劑、菌體殘留部分等不會(huì)被疏水色譜填料吸附,留在上清液中直接被分離出去,本方法具有一定的純化作用。
2、吸附發(fā)酵液不受體積的限制,相同的分泌量表達(dá),如體積增大只需增加疏水色譜填料的重量即可,適合大規(guī)模發(fā)酵液分離使用,且分離時(shí)間短,都可在5小時(shí)左右完成分離操作。
3、疏水色譜填料可反復(fù)使用幾百次不需更換,高于超濾濃縮過程中膜的使用壽命。
4、水蛭素蛋白回收率可達(dá)70%以上,高于傳統(tǒng)兩步法超濾濃縮-乙醇沉淀蛋白回收率。
附圖說明
圖1為實(shí)施例3水蛭素發(fā)酵液分離色素前后對(duì)比照片。
具體實(shí)施方式
下面通過具體實(shí)施例以及附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步描述說明。如果無特殊說明,本發(fā)明的實(shí)施例中所采用的原料均為本領(lǐng)域常用的原料,實(shí)施例中所采用的方法,均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。
實(shí)施例1
100l罐高密度發(fā)酵,離心得水蛭素發(fā)酵液體積35l,分泌水蛭素表達(dá)量:1.2mg/ml,蛋白活性:16800iu/ml。
對(duì)疏水色譜填料進(jìn)行預(yù)處理:取疏水色譜填料3000g,疏水色譜填料顆粒度20μm,孔徑
取2800g預(yù)處理過的疏水色譜填料(干重),置離心過的水蛭素發(fā)酵液中(發(fā)酵液在臨吸附前加入4mol/l氯化鈉,ph調(diào)至4.8),磁力攪拌20min后,靜置1小時(shí),疏水色譜填料完全沉降,虹吸去除上清液,沉淀待用。
將吸附沉淀置布氏漏斗中抽濾,先用15l平衡液淋洗,再用30l緩沖液1洗脫,收集尾液在280nm波長(zhǎng)處檢測(cè)無色素信號(hào),表示色素洗脫完全,最后用7l緩沖液2洗脫,收集洗脫液,即為水蛭素蛋白。
將上述洗脫過后的吸附沉淀依次用15l80%乙醇、28lph為4.8的蒸餾水以及6l平衡液淋洗,抽干,得到的疏水色譜填料即可再一次使用。
本實(shí)施例所用的平衡液配方為:4mol/l氯化鈉,40mmol/lpb,ph為4.8。所述緩沖液1的配方為:2mol/l氯化鈉,40mmol/l磷酸緩沖液,ph為4.8;所述緩沖液2為ph4.8的40mmol/l磷酸緩沖液。
收集的水蛭素蛋白濃度為4.20mg/ml,活性:5.82萬iu/ml,水蛭素蛋白回收率為70%。
實(shí)施例2
100l罐高密度發(fā)酵,離心得水蛭素發(fā)酵液體積38l,分泌水蛭素表達(dá)量:1.15mg/ml,活性:16100iu/ml。
對(duì)疏水色譜填料進(jìn)行預(yù)處理:取疏水色譜填料3100g,疏水色譜填料顆粒度20μm,孔徑
取3000g預(yù)處理過的疏水色譜填料(干重),置離心過的水蛭素發(fā)酵液中(發(fā)酵液在臨吸附前加入3mol/l氯化鈉,ph調(diào)至5.2),磁力攪拌20min后,靜置1.5小時(shí),疏水色譜填料完全沉降,虹吸去除上清液,沉淀待用。
將吸附沉淀置布氏漏斗中抽濾,先用16l平衡液淋洗,再用31l緩沖液1洗脫,收集尾液在280nm波長(zhǎng)處檢測(cè)無色素信號(hào),表示色素洗脫完全,最后用7l緩沖液2洗脫,收集洗脫液,即為水蛭素蛋白。
將上述洗脫過后的吸附沉淀依次用15l85%乙醇、28lph為5.2的蒸餾水以及6l平衡液淋洗,抽干,得到的疏水色譜填料即可再一次使用。
本實(shí)施例所用的平衡液配方為:3mol/l氯化鈉,60mmol/lpb,ph為5.2。所述緩沖液1的配方為:1.5mol/l氯化鈉,60mmol/l磷酸緩沖液,ph為5.2;所述緩沖液2為ph5.2的60mmol/l磷酸緩沖液。
收集的水蛭素蛋白濃度為4.43mg/ml,活性:6.20萬iu/ml,水蛭素蛋白回收率為71%。
實(shí)施例3
100l罐高密度發(fā)酵,離心得水蛭素發(fā)酵液體積40l,分泌水蛭素表達(dá)量:1.08mg/ml,蛋白活性:15800iu/ml。
對(duì)疏水色譜填料進(jìn)行預(yù)處理:取疏水色譜填料3200g,疏水色譜填料顆粒度20μm,孔徑
取3100g預(yù)處理過的疏水色譜填料(干重),置離心過的水蛭素發(fā)酵液中(發(fā)酵液在臨吸附前加入2mol/l氯化鈉,ph調(diào)至5.0),磁力攪拌20min后,靜置2小時(shí),疏水色譜填料完全沉降,虹吸去除上清液,沉淀待用。
將吸附沉淀置布氏漏斗中抽濾,先用16l平衡液淋洗,再用31l緩沖液1洗脫,收集尾液在280nm波長(zhǎng)處檢測(cè)無色素信號(hào),表示色素洗脫完全,最后用7l緩沖液2洗脫,收集洗脫液,即為水蛭素蛋白。
將上述洗脫過后的吸附沉淀依次用15l85%乙醇、28lph為5.0的蒸餾水以及6l平衡液淋洗,抽干,得到的疏水色譜填料即可再一次使用。
本實(shí)施例所用的平衡液配方為:2mol/l氯化鈉,50mmol/lpb,ph為5.0。所述緩沖液1的配方為:1mol/l氯化鈉,50mmol/l磷酸緩沖液,ph為5.0;所述緩沖液2為ph5.0的50mmol/l磷酸緩沖液。
收集的水蛭素蛋白濃度為4.51mg/ml,活性:6.58萬iu/ml,水蛭素蛋白回收率為73%。
對(duì)比例1
對(duì)比例1與實(shí)施例3的區(qū)別為疏水色譜填料由硅膠基質(zhì)以及表面鍵合c18烷基形成,其它與實(shí)施例3一樣,在此不贅述。
收集的水蛭素蛋白濃度為3.15mg/ml,活性:4.59萬iu/ml,水蛭素蛋白回收率為51%。
對(duì)比例2
對(duì)比例2與實(shí)施例3的區(qū)別為疏水色譜填料由硅膠基質(zhì)以及表面鍵合c8烷基形成,其它與實(shí)施例3一樣,在此不贅述。
收集的水蛭素蛋白濃度3.27為mg/ml,活性:4.77萬iu/ml,水蛭素蛋白回收率為53%。
對(duì)比例3
對(duì)比例3與實(shí)施例3的區(qū)別為疏水色譜填料沒有進(jìn)行預(yù)處理,其它與實(shí)施例3一樣,在此不贅述。
收集的水蛭素蛋白濃度1.85為mg/ml,活性:2.69萬iu/ml,水蛭素蛋白回收率為30%。
對(duì)比例4
對(duì)比例4與實(shí)施例3的區(qū)別為水蛭素發(fā)酵液在臨吸附前沒有進(jìn)行預(yù)處理,其它與實(shí)施例3一樣,在此不贅述。
收集的水蛭素蛋白濃度為2.90mg/ml,活性:4.23萬iu/ml,水蛭素蛋白回收率為47%。
對(duì)比例5
對(duì)比例5與實(shí)施例3的區(qū)別為,在洗脫過程中,所用平衡液配方為:7mol/l氯化鈉,100mmol/lpb,ph為5.5;所用緩沖液1的配方為:6mol/l氯化鈉,100mmol/l磷酸緩沖液,ph為5.5;所用緩沖液2為ph5.5的100mmol/l磷酸緩沖液。
收集的水蛭素蛋白濃度3.09為mg/ml,活性:4.50萬iu/ml,水蛭素蛋白回收率為50%。
另外,本發(fā)明要求保護(hù)的技術(shù)范圍中點(diǎn)值未窮盡之處以及在實(shí)施例技術(shù)方案中對(duì)單個(gè)或者多個(gè)技術(shù)特征的同等替換所形成的新的技術(shù)方案,同樣都在本發(fā)明要求保護(hù)的范圍內(nèi);同時(shí)本發(fā)明方案所有列舉或者未列舉的實(shí)施例中,在同一實(shí)施例中的各個(gè)參數(shù)僅僅表示其技術(shù)方案的一個(gè)實(shí)例(即一種可行性方案)。
本文中所描述的具體實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明精神作舉例說明。本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)所描述的具體實(shí)施例做各種修改或補(bǔ)充或采用類似的方式替代,但并不會(huì)偏離本發(fā)明的精神或者超越所附權(quán)利要求書所定義的范圍。