本發(fā)明屬于司法鑒定領(lǐng)域，涉及一種法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別方法，具體涉及一種基于eric-pcr指紋圖譜的法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別方法。

背景技術(shù)：

對(duì)犯罪分子現(xiàn)場(chǎng)留下的蛛絲馬跡進(jìn)行識(shí)別和追蹤是刑事案件偵破的最常用手段之一。隨著犯罪分子反偵察意識(shí)的增強(qiáng)，傳統(tǒng)的識(shí)別和鑒定方法如手印、足跡等痕跡鑒定已無法完全滿足現(xiàn)代刑事偵查的要求。

毛發(fā)、血液、軟組織碎片等生物物證的dna分析技術(shù)是近年來使用廣泛、成熟可靠的物證鑒定技術(shù)，被廣泛運(yùn)用于犯罪現(xiàn)場(chǎng)、犯罪嫌疑人、血緣關(guān)系確認(rèn)等諸多偵查領(lǐng)域，但該技術(shù)對(duì)生物檢材的質(zhì)和量均有一定要求，如果生物檢材質(zhì)量較差，則無法得出可靠的鑒定結(jié)果。

細(xì)菌作為最原始、種類數(shù)量最龐大的客體，是人體與生俱來的附屬生物。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌寄生人體具有一定的“特異性”，即每個(gè)人可能具有獨(dú)有的寄生細(xì)菌，人和人之間的菌群種類差別高達(dá)80-90％。

dna指紋技術(shù)是指利用不同生物體中dna序列的差異性，建立起來的一種用于個(gè)體識(shí)別、遺傳追溯的dna條帶圖譜。該技術(shù)自從20世紀(jì)70年代被提出后，迅速運(yùn)用于物種起源進(jìn)化、腫瘤發(fā)生、疾病診斷、親子鑒定、法醫(yī)鑒定等諸多領(lǐng)域。eric(enterobacterialrepetitiveintergenicconsensus)是最早在腸道細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)度大約為124-127bp的高度保守的dna重復(fù)序列。近年大量研究表明，幾乎所有細(xì)菌基因組均包括eric重復(fù)序列，并且該序列在不同細(xì)菌基因組的重復(fù)頻次、間隔等具有特異性。在使用該序列的pcr引物進(jìn)行擴(kuò)增后，腸道中不同的細(xì)菌會(huì)出現(xiàn)特異性dna條帶圖譜即eric-pcr指紋圖譜，這種指紋圖譜具有分辨率高、敏感性高、重復(fù)性高、操作簡(jiǎn)便快速等諸多特點(diǎn)。

上述細(xì)菌dna圖譜技術(shù)在多個(gè)領(lǐng)域均有應(yīng)用，但目前還未有將其運(yùn)用于司法鑒定的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，人體接觸過的環(huán)境中的細(xì)菌eric-pcr指紋圖譜與人體一些部位采集得到的細(xì)菌eric-pcr指紋圖譜具有高度特異性，尤其是人體手指部位采集得到的細(xì)菌eric-pcr指紋圖譜具有尤其高的特異性。

基于上述發(fā)現(xiàn)，為了提供一種采用全新的生物檢材來進(jìn)行個(gè)體識(shí)別的方法，本發(fā)明提出了如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種基于eric-pcr指紋圖譜的法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別方法，用于對(duì)案件現(xiàn)場(chǎng)及涉案人員分別進(jìn)行取樣及鑒別從而對(duì)涉案人員進(jìn)行個(gè)體識(shí)別，其特征在于，包括如下步驟：

步驟s1，在案件現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行細(xì)菌采樣獲得現(xiàn)場(chǎng)細(xì)菌樣品，并對(duì)涉案人員的食指部位進(jìn)行細(xì)菌采樣獲得涉案人員細(xì)菌樣品；

步驟s2，對(duì)現(xiàn)場(chǎng)細(xì)菌樣品及涉案人員細(xì)菌樣品分別進(jìn)行細(xì)菌增殖培養(yǎng)，并對(duì)增殖培養(yǎng)后的菌液進(jìn)行宏基因組提取，分別得到現(xiàn)場(chǎng)細(xì)菌樣品所對(duì)應(yīng)的現(xiàn)場(chǎng)細(xì)菌宏基因組以及涉案人員細(xì)菌樣品所對(duì)應(yīng)的涉案人員細(xì)菌宏基因組；

步驟s3，采用相同的引物分別對(duì)現(xiàn)場(chǎng)細(xì)菌宏基因組及涉案人員細(xì)菌宏基因組進(jìn)行eric-pcr，分別得到現(xiàn)場(chǎng)細(xì)菌宏基因組所對(duì)應(yīng)的現(xiàn)場(chǎng)細(xì)菌eric-pcr指紋圖譜以及涉案人員細(xì)菌宏基因組所對(duì)應(yīng)的涉案人員細(xì)菌eric-pcr指紋圖譜；

步驟s4，對(duì)現(xiàn)場(chǎng)細(xì)菌eric-pcr指紋圖譜及涉案人員細(xì)菌eric-pcr指紋圖譜進(jìn)行比對(duì)，鑒別現(xiàn)場(chǎng)細(xì)菌eric-pcr指紋圖譜及涉案人員細(xì)菌eric-pcr指紋圖譜是否一致，從而進(jìn)行個(gè)體識(shí)別。

本發(fā)明提供的基于eric-pcr指紋圖譜的法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別方法，還可以具有這樣的技術(shù)特征：

其中，在步驟s3中，所采用的引物為引物eric-f以及引物eric-r，

引物eric-f的序列為atgtaagctcctggggattcac，

引物eric-r的序列aagtaagtgactggggtgagcg。

本發(fā)明提供的基于eric-pcr指紋圖譜的法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別方法，還可以具有這樣的技術(shù)特征：

其中，在步驟s2中，宏基因組提取包括如下步驟：

步驟s2-1，取菌液3ml，5000rpm離心10min，棄上清，pbs緩沖液洗菌體沉淀3次，1mlpbs重懸后加入50mg/ml溶菌酶37℃孵育1h得到菌液孵育液i；

步驟s2-2，向菌液孵育液i中依次加入100ul10％sds溶液，20mg/ml蛋白酶k，55℃孵育1h得到菌液孵育液ii；

步驟s2-3，向菌液孵育液ii中加入1500ul5mol/lnacl溶液，并用與該nacl溶液體積相等的酚:氯仿:異戊醇溶液抽提得到抽提液；

步驟s2-4，向抽提液中加入2倍體積的無水乙醇使dna沉淀，離心獲得沉淀的dna并用雙蒸水溶解，得到宏基因組dna。

發(fā)明作用與效果

根據(jù)本發(fā)明提供的基于eric-pcr指紋圖譜的法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別方法，可以分別獲得涉案人員食指部位以及涉案現(xiàn)場(chǎng)所采集的細(xì)菌樣品對(duì)應(yīng)的eric-pcr指紋圖譜，對(duì)這些eric-pcr指紋圖譜進(jìn)行比對(duì)即可初步實(shí)現(xiàn)涉案人員的個(gè)體識(shí)別及追蹤，為一些無法取得其他檢材的現(xiàn)場(chǎng)提供了的新的個(gè)體識(shí)別手段。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例一的宏基因組dna檢驗(yàn)結(jié)果的電泳圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例一的食指部位和手機(jī)屏幕細(xì)菌樣品宏基因組dna的eric-pcr結(jié)果電泳圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例一的食指部位和個(gè)人桌面細(xì)菌樣品宏基因組dna的eric-pcr結(jié)果電泳圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例二的食指部位和環(huán)境細(xì)菌樣品宏基因組dna的eric-pcr結(jié)果電泳圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖來說明本發(fā)明的具體實(shí)施方式。在下述實(shí)施例中所采用的試劑、酶、試劑盒及其他實(shí)驗(yàn)材料如無特殊說明均從一般商業(yè)途徑獲得，未注明的實(shí)驗(yàn)條件均參照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件或遵照供應(yīng)商的建議條件。

實(shí)施例一：食指部位與接觸物品的細(xì)菌樣品的關(guān)聯(lián)性考察

本實(shí)施例的目的在于從志愿者食指部位及志愿者的接觸物品(包括其使用的手機(jī)屏幕和個(gè)人桌面)上分別采樣，并考察這些部位所采集的樣品的關(guān)聯(lián)性。

在本實(shí)施例中，志愿者一共有10名，男女各5名。

本實(shí)施例的基于eric-pcr指紋圖譜的法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別方法包括如下步驟：

步驟s1，在案件現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行細(xì)菌采樣獲得現(xiàn)場(chǎng)細(xì)菌樣品，并對(duì)涉案人員的食指部位進(jìn)行細(xì)菌采樣獲得涉案人員細(xì)菌樣品。

在本實(shí)施例中，志愿者作為模擬的涉案人員，志愿者對(duì)應(yīng)的手機(jī)屏幕及個(gè)人桌面作為案件現(xiàn)場(chǎng)的一部分，分別進(jìn)行采樣，采樣的方式為：用滅菌pbs溶液濕潤(rùn)滅菌棉球，根據(jù)志愿者使用手機(jī)和鼠標(biāo)習(xí)慣分別擦拭志愿者右手食指、本人手機(jī)觸摸屏以及個(gè)人桌面，將擦拭后的棉球放入標(biāo)注好的lb(luria-bertani)培養(yǎng)基中37℃搖床過夜培養(yǎng)。其中，lb培養(yǎng)基配方如下:胰蛋白胨(tryptone)10g/l，酵母提取物(yeastextract)5g/l，氯化鈉(nacl)10g/l瓊脂粉15g/l，高滅菌后倒置固體平板培養(yǎng)基。

上述采樣得到的各個(gè)樣品中，食指部位的細(xì)菌樣品即為涉案人員細(xì)菌樣品，手機(jī)屏幕樣品和個(gè)人桌面樣品即為現(xiàn)場(chǎng)細(xì)菌樣品。

下述過程中，男性志愿者用m代表，其食指部位樣品編號(hào)分別為mf1-mf5，對(duì)應(yīng)的手機(jī)屏幕樣品編號(hào)分別為mp1-mp5，對(duì)應(yīng)的個(gè)人桌面樣品編分別號(hào)為me1-me5。女性志愿者用f代表，食指部位、手機(jī)屏幕、個(gè)人桌面的樣品分別編號(hào)為ff1-ff5、fp1-fp5、fe1-fe5。

步驟s2，對(duì)現(xiàn)場(chǎng)細(xì)菌樣品及涉案人員細(xì)菌樣品分別進(jìn)行細(xì)菌增殖培養(yǎng)，并對(duì)增殖培養(yǎng)后的菌液進(jìn)行宏基因組提取，分別得到現(xiàn)場(chǎng)細(xì)菌樣品所對(duì)應(yīng)的現(xiàn)場(chǎng)細(xì)菌宏基因組以及涉案人員細(xì)菌樣品所對(duì)應(yīng)的涉案人員細(xì)菌宏基因組。其中，宏基因組的提取具體包括如下子步驟：

步驟s2-1，取增殖培養(yǎng)后的菌液3ml，5000rpm離心10min，棄上清，pbs緩沖液洗菌體沉淀3次，1mlpbs重懸后加入50mg/ml溶菌酶37℃孵育1h得到菌液孵育液i；

步驟s2-2，向菌液孵育液i中依次加入100ul10％sds溶液，20mg/ml蛋白酶k，55℃孵育1h得到菌液孵育液ii；

步驟s2-3，向菌液孵育液ii中加入1500ul5mol/lnacl溶液，并用與該nacl溶液體積相等的酚:氯仿:異戊醇溶液抽提得到抽提液；

步驟s2-4，向抽提液中加入2倍體積的無水乙醇使dna沉淀，離心獲得沉淀的dna并用雙蒸水溶解，得到宏基因組dna。

在本實(shí)施例中，為了檢驗(yàn)上述方法得到的宏基因組dna的質(zhì)量，在提取宏基因組dna后還分別對(duì)其進(jìn)行了檢驗(yàn)。檢驗(yàn)采用瓊脂糖凝膠電泳、nanodrop2000c分光光度計(jì)測(cè)定od260/280比值兩種方法來進(jìn)行。

圖1為本發(fā)明實(shí)施例一的宏基因組dna檢驗(yàn)結(jié)果的電泳圖。

如圖1所示，所有采集到的志愿者宏基因組dna均有較完整的全基因組條帶。另外，經(jīng)分光光度計(jì)分析，所有dna的od260/280比值均在1.8-2.0之間，說明dna質(zhì)量較好，可用于下一步eric-pcr實(shí)驗(yàn)。

步驟s3，采用相同的引物分別對(duì)現(xiàn)場(chǎng)細(xì)菌宏基因組及涉案人員細(xì)菌宏基因組進(jìn)行eric-pcr，分別得到現(xiàn)場(chǎng)細(xì)菌宏基因組所對(duì)應(yīng)的現(xiàn)場(chǎng)細(xì)菌eric-pcr指紋圖譜以及涉案人員細(xì)菌宏基因組所對(duì)應(yīng)的涉案人員細(xì)菌eric-pcr指紋圖譜。

上述eric-pcr過程中所采用的引物包括：引物eric-f，序列為atgtaagctcctggggattcac；以及引物eric-r，其序列aagtaagtgactggggtgagcg。

eric-pcr的反應(yīng)參數(shù)如下：95℃,2min；94℃，3s，92℃,30s,50℃，1min,65℃，8min,30次循環(huán)；65℃8min。

pcr產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳后，由凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

步驟s4，對(duì)現(xiàn)場(chǎng)細(xì)菌eric-pcr指紋圖譜及涉案人員細(xì)菌eric-pcr指紋圖譜進(jìn)行比對(duì)，鑒別現(xiàn)場(chǎng)細(xì)菌eric-pcr指紋圖譜及涉案人員細(xì)菌eric-pcr指紋圖譜是否一致，從而進(jìn)行個(gè)體識(shí)別。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例一的食指部位和手機(jī)屏幕細(xì)菌樣品宏基因組dna的eric-pcr結(jié)果電泳圖。圖3為本發(fā)明實(shí)施例一的食指部位和個(gè)人桌面細(xì)菌樣品宏基因組dna的eric-pcr結(jié)果電泳圖。

圖2中，各泳道的對(duì)應(yīng)關(guān)系為：m:dnamaker，單數(shù)泳道為食指部位細(xì)菌樣品，偶數(shù)泳道為手機(jī)屏幕細(xì)菌樣品。泳道1-2、3-4、5-6、7-8、9-10分別為五位男性志愿者的食指部位和手機(jī)屏幕細(xì)菌樣品。11-12、13-14、15-16、17-18、19-20分別為五位女性志愿者的食指部位和手機(jī)屏幕細(xì)菌樣品。另外，圖2中被同一個(gè)方框圈起的兩個(gè)泳道的條帶完全相同。

如圖2所示，十名志愿者中有1名男性、2名女性的食指部位和手機(jī)屏幕上的細(xì)菌eric-pcr指紋圖譜不一致。

其中，1名男性(7-8泳道)食指部位和手機(jī)屏幕上的dna圖譜只有一條有近似大小的dna條帶，而其余幾個(gè)條帶大小差別較大，由此可知，此名志愿者食指部位和手機(jī)屏幕上的菌群可能只有部分一致。而1名女性(11-12泳道)食指部位和手機(jī)屏幕上的菌群eric-pcr指紋圖譜則完全不同，甚至沒有一個(gè)同樣大小的條帶。也就是說，此名志愿者食指細(xì)菌菌群完全不一致。

另外，對(duì)上述兩名不一致的志愿者食指部位和手機(jī)屏幕重復(fù)進(jìn)行了三次樣品采集及eric-pcr，其重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與上述結(jié)果也完全相同。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例一的食指部位和個(gè)人桌面細(xì)菌樣品宏基因組dna的eric-pcr結(jié)果電泳圖。

圖3中，各泳道的對(duì)應(yīng)關(guān)系為：m:dnamaker，單數(shù)泳道為食指部位細(xì)菌樣品，偶數(shù)泳道為個(gè)人桌面細(xì)菌樣品。泳道1-2、3-4、5-6、7-8、9-10分別為五位男性志愿者的食指部位和個(gè)人桌面細(xì)菌樣品。11-12、13-14、15-16、17-18、19-20分別為五位女性志愿者的食指部位和個(gè)人桌面細(xì)菌樣品。另外，圖3中被同一個(gè)方框圈起的兩個(gè)泳道的條帶完全相同。

如圖3，在十名志愿者中，只有2名男性(1-2和9-10泳道)和一名女性(17-18泳道)的食指部位和個(gè)人桌面上的eric-pcrdna圖譜完全相符，而其它七名志愿者不完全相符。但圖譜條帶比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，3-4、5-6、11-12、13-14、15-16、19-20泳道中至少有一個(gè)條帶大小近似，甚至大多數(shù)條帶大小完全一致。

實(shí)施例一的作用與效果

如上所述，采用本實(shí)施例提供的基于eric-pcr指紋圖譜的法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別方法獲得eric-pcr指紋圖譜后，由于接觸物品(手機(jī)屏幕及個(gè)人桌面)與食指部位的細(xì)菌樣品均存在一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系，并且其中手機(jī)屏幕的對(duì)應(yīng)關(guān)系更為密切(10人中有7人是完全一致的)，因此根據(jù)本實(shí)施例提供的方法對(duì)案件現(xiàn)場(chǎng)的接觸物品進(jìn)行取樣即可初步實(shí)現(xiàn)涉案人員的個(gè)體識(shí)別，為一些無法取得其他檢材的現(xiàn)場(chǎng)提供了的新的個(gè)體識(shí)別手段。

另外，從上述實(shí)施例可以看出，人體的食指部位細(xì)菌樣品與手機(jī)屏幕的細(xì)菌樣品也有無法完全對(duì)應(yīng)的情況，說明個(gè)人衛(wèi)生習(xí)慣、環(huán)境和其它微生物都可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響，因此在實(shí)際應(yīng)用中，準(zhǔn)確、細(xì)致、多次取樣極為關(guān)鍵。

實(shí)施例二：食指部位與周圍環(huán)境的細(xì)菌樣品的關(guān)聯(lián)性考察

本實(shí)施例的目的在于從志愿者食指部位及志愿者所停留過的環(huán)境中分別采樣，并考察所采集的樣品的關(guān)聯(lián)性。

在本實(shí)施例中，對(duì)于與實(shí)施例一相同的步驟和方法，省略相同的說明。

在本實(shí)施例中，志愿者一共有19名，分別編號(hào)為f1-f19。

其中，對(duì)手指部位的采樣方式與實(shí)施例一相同。

對(duì)志愿者停留過的環(huán)境進(jìn)行采用的過程為：該19名志愿者首先在同一個(gè)會(huì)議室中進(jìn)行了會(huì)議，在會(huì)議結(jié)束14小時(shí)后對(duì)該會(huì)議室進(jìn)行了采樣，采集到的樣品包括會(huì)議桌面、椅子扶手處所采集的細(xì)菌樣品19份，公用電腦鼠標(biāo)、鍵盤、門把手、黑板擦采集的細(xì)菌樣品4份，共計(jì)23份細(xì)菌樣品作為環(huán)境細(xì)菌樣品，分別編號(hào)為1-23。

上述采樣得到的各個(gè)樣品中，19份食指部位的細(xì)菌樣品即為涉案人員細(xì)菌樣品，23份環(huán)境細(xì)菌樣品即為現(xiàn)場(chǎng)細(xì)菌樣品。

采用與實(shí)施例一相同的步驟及方法對(duì)上述各個(gè)樣品進(jìn)行細(xì)菌增殖培養(yǎng)、宏基因組提取、eric-pcr，獲得對(duì)應(yīng)的各eric-pcr指紋圖譜。

在本實(shí)施例中，為了確認(rèn)條帶一致的宏基因組dna的序列是否也一致，在獲得上述eric-pcr指紋圖譜后還進(jìn)行了dna測(cè)序，結(jié)果后述。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例二的食指部位和環(huán)境細(xì)菌樣品宏基因組dna的eric-pcr結(jié)果電泳圖。

圖4中，圖4(a)為19份食指部位的細(xì)菌樣品，圖4(b)為23份環(huán)境細(xì)菌樣品。圖4(a)中，不同泳道的箭頭下方數(shù)字為與該泳道一致的圖4(b)的泳道編號(hào)。

如圖4所示，19個(gè)人中，有13人個(gè)人的食指部位eric-pcr指紋圖譜的dna片段條帶數(shù)、條帶大小，和其本人曾經(jīng)使用過的辦公桌桌面采集細(xì)菌的eric-pcr指紋圖譜完全吻合。

另外，根據(jù)dna的測(cè)序結(jié)果，eric-pcr指紋圖譜完全吻合的宏基因組dna之間，其擴(kuò)增條帶的序列也是完全吻合的。其eric-pcr指紋圖譜的一致關(guān)系、擴(kuò)增條帶序列的一致關(guān)系見下表1：

表1：食指部位和環(huán)境細(xì)菌樣品宏基因組dna的eric-pcr圖譜及其擴(kuò)增條帶序列的一致關(guān)系

實(shí)施例二的作用與效果

如上所述，采用本實(shí)施例提供的基于eric-pcr指紋圖譜的法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別方法獲得的eric-pcr指紋圖譜中，志愿者的食指部位及志愿者停留環(huán)境的細(xì)菌樣品存在一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系，并且eric-pcr指紋圖譜相一致的細(xì)菌樣品中，擴(kuò)增條帶的序列也完全一致，說明只要二者的eric-pcr指紋圖譜一致，則其擴(kuò)增條帶也完全一致，能夠證明兩個(gè)細(xì)菌樣品中的菌群相同。

進(jìn)一步，eric-pcr指紋圖譜相一致的細(xì)菌樣品中，擴(kuò)增條帶的序列也完全一致，說明只需要進(jìn)行eric-pcr即可找出相同的細(xì)菌樣品，因此與需要進(jìn)行測(cè)序的傳統(tǒng)dna方法相比，本實(shí)施例的方法更加快速簡(jiǎn)便。

如表1所示，19名志愿者中，只有6人(f1、f3、f5、f12、f13、f16)的指紋圖譜，在23份環(huán)境細(xì)菌樣品的eric-pcr指紋圖譜中未找到對(duì)應(yīng)圖譜。

也就是說，使用本實(shí)施例提供的基于eric-pcr指紋圖譜的法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別方法實(shí)現(xiàn)個(gè)體追蹤的幾率可高達(dá)68.6％，且在參加會(huì)議人員結(jié)束會(huì)議后14個(gè)小時(shí)仍然可以進(jìn)行有效追蹤。

由此可知，犯罪嫌疑人離開現(xiàn)場(chǎng)14小時(shí)后，其手部(或身體其它暴露部分)殘留在現(xiàn)場(chǎng)的菌群仍然存活，對(duì)這些細(xì)菌進(jìn)行采樣，并利用本實(shí)施例提供的方法，就可以獲得犯罪嫌疑人“在場(chǎng)”的有力證據(jù)，即實(shí)現(xiàn)個(gè)體識(shí)別及追蹤。