本發(fā)明公開了玫瑰基因rrnudx1在改變植物花期中的應(yīng)用，屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

玫瑰(rosarugosathunb.)是世界上重要的天然香料植物，也是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食同源花卉，單萜類化合物中的香茅醇、香葉醇、橙花醇及其乙酸酯類衍生物是形成玫瑰特征香氣的主要成分。

單萜作為萜類化合物主要種類，大多分布在植物的腺體油室等分泌組織中，通常具有較強(qiáng)的香氣和生物活性，單萜對(duì)于植物生存和人類生活具有重要作用，除了它們?cè)谥参锓烙械墓δ芡?，單萜還用作香料和藥物，同時(shí)許多名貴植物精油的主要成分均由單萜類化合物組成，如薄荷精油主要由檸檬醛和香芹酮組成。近年來，研究人員通過分離單萜生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因，借助基因工程手段，選擇性地調(diào)控單萜代謝途徑，從而提高萜類合成前體和下游單萜類化合物的產(chǎn)量，達(dá)到改良植物香氣以及精油品質(zhì)的目的。

nudx1屬于nudix水解酶基因家族，在細(xì)菌、病毒、真核生物中均有發(fā)現(xiàn)，研究表明，nudx1基因是nudx家族中唯一一個(gè)馬特型酶，其蛋白以8-oxo-(d)gtp(8-氧化脫氧鳥苷三磷酸酶)、dntp、nadh、dihydroneopterin(二氫新蝶呤)為底物，能夠有效清除細(xì)胞中因ros氧化所受損的核苷酸，減少細(xì)胞內(nèi)氧化損傷的累積，降低細(xì)胞突變和程序性死亡，增強(qiáng)對(duì)不良環(huán)境的適應(yīng)力。

玫瑰rrnudx1基因的cdna全長(zhǎng)序列全長(zhǎng)777bp，具有起始密碼子、完整的開放閱讀框453bp，終止密碼子、5'非編碼區(qū)68bp，3′非編碼區(qū)244bp與poly(a)尾巴12bp，共編碼151個(gè)氨基酸。基因登陸號(hào)為kx096710.1。但是，rrnudx1基因的應(yīng)用尚未有報(bào)道。

成花是高等植物階段轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵步驟，是植物完成其生命史的質(zhì)的飛躍過程，它受到植物自身內(nèi)在因素和外界環(huán)境因素的共同調(diào)控。對(duì)植物開花機(jī)制的探索一直是國(guó)內(nèi)外廣泛聚焦的重點(diǎn)，也是當(dāng)前植物發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。成花誘導(dǎo)是植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變，也是植物生殖啟動(dòng)的首個(gè)階段，它直接決定著其成花的時(shí)間。近些年來，人們?cè)趯?duì)模式植物擬南芥、水稻、金魚草等的研究中，發(fā)現(xiàn)植物的成花誘導(dǎo)過程由一個(gè)極其繁瑣的網(wǎng)狀途徑控制。目前己證實(shí)至少存在四條主要信號(hào)途徑參與植物成花轉(zhuǎn)變的調(diào)控過程，即:春化途徑(vernalizationpathway)、光周期途徑(photoperiodpathway)、自主途徑(autonomouspathway)和赤霉素途徑(gibberellinpathway)。其中春化途徑和光周期途徑是植物對(duì)外界環(huán)境中的溫度和光照狀況的響應(yīng)，而自主途徑和赤霉素途徑則受到植物本身發(fā)育情況和內(nèi)源激素水平的調(diào)控。盡管調(diào)控植物成花的四條途徑均可能獨(dú)立地響應(yīng)各種環(huán)境信號(hào)的刺激，但這些途徑之間又彼此相互關(guān)聯(lián)互相作用，構(gòu)成一個(gè)紛繁復(fù)雜的有機(jī)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，來實(shí)現(xiàn)對(duì)植物開花的精密調(diào)控。來自各條途徑的信號(hào)最終匯集于幾個(gè)重要的開花調(diào)控整合因子，如soc1(suppressorofoverexprssionofco1)，ft(floweringlocust)，lfy(leafy)，flc(floweringlocusc)等，通過它們對(duì)這些信號(hào)進(jìn)行整合，進(jìn)而啟動(dòng)下游花分生組織特征基因的表達(dá)，確保植物適時(shí)開花。

目前，通過基因工程的方法，在植物花色、株型、重瓣性、雄性不育及抗性等方面的改良研究已取得了很好的進(jìn)展，但在早花育種方面鮮有報(bào)道。利用本發(fā)明的技術(shù)手段，我們獲得了能提前近30天開花的矮牽牛特異種質(zhì)材料，這為利用rrnudx1改變植物花期提供了重要手段。本發(fā)明及相關(guān)成果將進(jìn)一步豐富植物成花調(diào)控理論，為培育早花的植物新品種、降低生產(chǎn)成本、提高育種效率奠定開創(chuàng)性的基礎(chǔ)，具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供玫瑰rrnudx1基因的應(yīng)用。

本發(fā)明公開了玫瑰rrnudx1基因在改變植物花期中的應(yīng)用。

本發(fā)明還公開了rrnudx1基因在培育早花植物品種中的用途。

一種早花植物品種的培育方法，是構(gòu)建rrnudx1基因的過表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將過表達(dá)載體導(dǎo)入待轉(zhuǎn)化植物，獲得早花植物品種。

本發(fā)明通過構(gòu)建rrnudx1基因的過表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將pcambia1304-rrnudx過表達(dá)載體導(dǎo)入矮牽牛，待植株開花后，我們發(fā)現(xiàn)，移栽35天后，部分轉(zhuǎn)rrnudx1基因植株開始開花，而野生型植株則在移栽60天后才陸續(xù)開花。同時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株的葉片明顯變寬，整體葉形由長(zhǎng)橢圓形向類心形轉(zhuǎn)變，說明過表達(dá)rrnudx1基因具有增強(qiáng)矮牽牛長(zhǎng)勢(shì)，促進(jìn)其提早開花的功能。

利用本發(fā)明的技術(shù)手段，獲得了能提前近30天開花的矮牽牛特異種質(zhì)材料。本發(fā)明及相關(guān)成果將進(jìn)一步豐富植物成花調(diào)控理論，為培育早花的植物新品種、降低生產(chǎn)成本、提高育種效率奠定開創(chuàng)性的基礎(chǔ)，具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。

附圖說明

圖1矮牽牛植株轉(zhuǎn)化過程；a:葉片預(yù)處理，b:侵染，c:生根，d:壯苗，e:移植。

圖2pcr產(chǎn)物凝膠檢測(cè)，m：markerdl2000n：rrnudx1的pcr產(chǎn)物。

圖3重組質(zhì)粒pcambia1304-rrnudx1的單酶切電泳圖，

m1：markerdl15000m2:markerdl2000a1-a2:重組質(zhì)粒單酶切n:陰性對(duì)照。

圖4rrnudx1-1和rrnudx1-2序列比較，

rrnudx1-1：克隆的目的基因rrnudx1-2：重組質(zhì)粒。

圖5pcambia1304-rrnudx1農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子菌液pcr電泳圖

m：markerdl2000p1-p3：pcambia1304為模板n1：ddh2o為模板n2：農(nóng)桿菌eha菌液為模板n3：yeb液體培養(yǎng)基為模板a1-a7：pcambia1304-rrnudx1農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子菌液為模板。

圖6矮牽牛愈傷gus染色結(jié)果

a:wt；b-d:轉(zhuǎn)rrnudx1基因愈傷。

圖7轉(zhuǎn)基因矮牽牛植株dna驗(yàn)證

m:markerdl2000；a1-a6:過表達(dá)抗性植株；p:pcambia1304-rrnudx1質(zhì)粒；wt1-2:野生型。

圖8野生型和轉(zhuǎn)rrnudx1基因矮牽牛植株形態(tài)及開花期比較；

wt1-2：野生型矮牽牛；rrnudx11-3：超表達(dá)rrnudx1基因的矮牽牛；

a:移栽35天后植株生長(zhǎng)狀態(tài)；b：移栽35天后轉(zhuǎn)基因植株現(xiàn)花蕾；c:野生型和轉(zhuǎn)基因植株葉片大小比較；d:轉(zhuǎn)基因植株比野生型提早開花。

具體實(shí)施方式

在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實(shí)施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語(yǔ)是為了描述特定的具體實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

生物材料：pcambia1304表達(dá)載體(biovector公司，北京)、eha105農(nóng)桿菌(華越洋生物科技有限公司，北京)

1玫瑰rrnudx1基因轉(zhuǎn)化矮牽牛與功能驗(yàn)證

1.1載體質(zhì)粒與菌株

pcambia1304表達(dá)載體和eha105農(nóng)桿菌均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2主要試劑的配制

(1)yeb液體培養(yǎng)基：0.05gmgso4·7h2o、1g酵母提取物、5g蛋白胨、5g牛肉浸膏、5g蔗糖，用ddh2o溶解并定容至1000ml，調(diào)ph值至7.0，滅菌后4℃保存。yeb固體培養(yǎng)基：在yeb液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加20g/l瓊脂，滅菌后分裝保存。

(2)kan：母液50mg/ml。0.5gkan，溶于10ml滅菌ddh2o中，0.22μm濾膜過濾，用1.5ml離心管分裝，-20℃保存。

(3)rif：母液5mg/ml。0.05grif，溶于少量無水乙醇后用滅菌ddh2o定容到10ml，0.22μm濾膜過濾，用1.5ml離心管分裝，-20℃保存。

(4)6-ba：母液0.1mg/ml。10mg6-ba，用少量0.1moi/l的naoh溶液溶解，最后用滅菌ddh2o定容至100ml，-20℃避光保存。

(5)iaa：母液0.1mg/ml。10mgiaa，用少量1mol/l的naoh溶液溶解，定容至100ml，0.22μm濾膜過濾，-20℃避光保存。

(6)as：母液50μmol/l。0.1962gas，溶于dmso定容至20ml，0.22μm濾膜過濾，-20℃避光保存。

(7)mes：母液10mg/ml。0.1gmes，溶于10ml滅菌ddh2o中溶解，0.22μm濾膜過濾，用1.5ml離心管分裝，4℃保存。

(8)cb：母液50mg/ml。0.5gcb，溶于10ml滅菌ddh2o中溶解，0.22μm濾膜過濾，用1.5ml離心管分裝，-20℃保存。

1.3矮牽牛遺傳轉(zhuǎn)化基本培養(yǎng)基

ms1：蔗糖30g/l+ms基本成分，ph5.8

ms2(愈傷分化)：ms1+6-ba3.0mg/l+iaa0.2mg/l，ph5.8

ms3(生根)：蔗糖30g/l+1/2ms，ph5.8

ms4(侵染液)：ms+mes1mg/l+as20mol/l，ph5.8

ms5(共培養(yǎng))：ms2+as20mol/l，ph5.8

1.4rrnudx1基因過表達(dá)載體構(gòu)建

3.4.1目的基因的初步獲取

3.4.4.1引物的合成與設(shè)計(jì)

根據(jù)rrnudx1基因(kx096710.1)cdna全長(zhǎng)序列分別設(shè)計(jì)上下游引物(引物所跨區(qū)域包含完整的cds序列)，用于體外分離目的基因，引物信息如下：

表1擴(kuò)增rrnudx1基因開放閱讀框的引物

3.4.4.2目的基因的pcr擴(kuò)增

(1)反應(yīng)體系為：

(2)反應(yīng)條件：

x：退火溫度

(3)將pcr反應(yīng)液在1％的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)。

1.4.4.3pcr產(chǎn)物的回收與純化

參照takara公司的takaraminibestagarosegeldnaextractionkitver.4.0試劑盒進(jìn)行。

1.4.4.4pcr產(chǎn)物的連接、轉(zhuǎn)化、擴(kuò)大培養(yǎng)

目的片段的連接、轉(zhuǎn)化參照trans公司的peasy^tm-t5zerocloningkit試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.4.5質(zhì)粒dna的提取及檢測(cè)

參考2.2.4.3部分的方法，委托上海生工進(jìn)行目的基因序列測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果與已登錄的rrnudx1基因序列進(jìn)行同源比對(duì)。

1.4.4.6rrnudx1基因的克隆與序列分析

采用玫瑰品種‘唐紅’花瓣提取的rna，反轉(zhuǎn)錄成cdna為模板，通過pcr擴(kuò)增后產(chǎn)物電泳圖如圖2，可以看出，擴(kuò)增片段介于500-750bp，與預(yù)期值相近。回收純化擴(kuò)增片段，插入peasy^tm-t5zerocloningvector，轉(zhuǎn)入大腸桿菌在附加1‰km的lb平板上篩選陽(yáng)性克隆。測(cè)序結(jié)果顯示，所克隆的目的基因序列為540bp左右，含起始密碼子、終止密碼子，編碼151個(gè)氨基酸，經(jīng)比對(duì)與已克隆的rrnudx1基因相似性達(dá)100％，推測(cè)氨基酸序列相似性達(dá)100％。

1.4.2目的基因(含有酶切位點(diǎn))的獲取

1.4.2.1引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)in-fusion試劑盒說明書要求，結(jié)合目的基因及雙元表達(dá)載體pcambia1304上的限制性酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)用于過表達(dá)載體構(gòu)建的pcr引物，引物名稱及其寡核苷酸序列如下：

rrnudx1單酶切引物：

rrnudx1-f:5’-ggactcttgaccatggttatgggaaacgagacagttgtag-3’(ncoi)(seqidno.3)rrnudx1-r:5’-gtcagatctaccatggtcatgttggaaaagggttaaatc-3’(ncoi)(seqidno.4)1.4.2.2含有酶切位點(diǎn)目的基因的pcr擴(kuò)增

以2.1.3.5獲取的含有rrnudx1基因編碼區(qū)序列的克隆載體質(zhì)粒為模板，采用高保真酶進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)，將ncoi酶切位點(diǎn)引入rrnudx1基因編碼區(qū)兩端。

(1)反應(yīng)體系為：

(2)反應(yīng)條件：

(3)用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物，切下含有目的片段的膠塊并回收。

1.4.2.3雙元表達(dá)載體pcambia1304酶切及產(chǎn)物回收

(1)連接rrnudx1基因的過表達(dá)載體pcambia1304酶切反應(yīng)體系為：

(2)反應(yīng)條件：37℃3h；

(3)用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物。

1.4.2.4目的片段與表達(dá)載體的連接

將獲取的目的基因與獲取的過表達(dá)載體以1:3混合連接。

(1)連接反應(yīng)體系為：

(2)pcr反應(yīng)條件：50℃15min

1.4.3連接轉(zhuǎn)化

目的片段的連接、轉(zhuǎn)化參照trans公司的peasy^tm-t5zerocloningkit試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5重組質(zhì)粒的鑒定及檢測(cè)

1.5.1酶切鑒定及檢測(cè)

挑選lb固體培養(yǎng)皿上的單菌落，分別置于含3ml液體lb(含1‰kan)的滅菌10ml離心管中，37℃200rpm振蕩過夜培養(yǎng)后，提取pcambia1304-rrnudx1重組質(zhì)粒的dna。

對(duì)pcambia1304-rrnudx1進(jìn)行單酶切鑒定，反應(yīng)條件均為37℃3h，用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物。同時(shí)酶切pcambia1304作為陰性對(duì)照，電泳檢測(cè)結(jié)果如圖3所示?？梢钥闯?，陰性對(duì)照n顯示一條長(zhǎng)約12000bp的條帶，單酶切a1-a2切出一條約為500bp的條帶，與rrnudx1開放閱讀框大小一致。因此，表明目的基因已初步插入表達(dá)載體pcambia1304中。

將經(jīng)酶切驗(yàn)證后的陽(yáng)性重組質(zhì)粒送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用dnaman分析(圖4)，與已克隆結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)相似性為100％，無堿基突變，推測(cè)氨基酸序列完全相同，證明目的基因rrnudx1已成功連入表達(dá)載體pcambia1304，過表達(dá)載體pcambia1304-rrnudx1構(gòu)建成功。并將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒于-20℃保存。

1.5.2重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌eha105及篩選鑒定

1.5.2.1農(nóng)桿菌eha105感受態(tài)制備

試驗(yàn)方法參照本實(shí)驗(yàn)室王佳(2015)的方法進(jìn)行農(nóng)桿菌eha105感受態(tài)制備

1.5.2.2液氮凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

(1)在碎冰上將農(nóng)桿菌eha105感受態(tài)細(xì)胞慢慢融化，加入5μl重組質(zhì)粒并混勻，置于冰上30min，1min液氮速凍，37℃熱激5min，冰浴2min；

(2)加入800μl左右的不含抗生素液體yeb，120-160rpm，28℃，4-5h，在含有40mg/l的rif和50mg/l的kan的固體yeb上涂布300μl，28℃暗培養(yǎng)2d左右。

3.5.2.3農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定

(1)挑取yeb平板上的單菌落，接種于含有3ml(含有40mg/l的rif和50mg/l的kan)液體yeb的滅菌10ml離心管中，28℃200rpm暗培養(yǎng)；

(2)菌液pcr檢測(cè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；

(3)用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物。

1.5.2.4農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子保存

將經(jīng)菌液pcr鑒定為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的農(nóng)桿菌菌液中加入25％滅菌甘油，混勻后用1.5ml滅菌離心管分裝，-70℃保存。

1.5.2.5結(jié)果

將檢測(cè)正確的重組質(zhì)粒(pcambia1304-rrnudx1)采用液氮凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌eha105感受態(tài)，在附加有1‰km和1‰rif的yeb固體培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，制成菌液后以其為模板進(jìn)行菌液pcr驗(yàn)證，同時(shí)針對(duì)模板設(shè)置一組陽(yáng)性對(duì)照(p)，三組陰性對(duì)照(n1、n2、n3)，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)顯示(圖5)，a1-a7均擴(kuò)增出了長(zhǎng)度為500bp左右的目的片段。

1.6矮牽牛遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化

1.6.1植物材料的獲得

1.6.1.1無菌苗的獲得

將矮牽牛種子置于75％的酒精中浸泡5min，無菌水沖洗3次，再用12.5％的次氯酸鈉溶液中浸泡10min，無菌水沖洗3次，接種于1/2ms培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

1.6.1.2組培苗移栽

當(dāng)組培苗長(zhǎng)到五葉一心時(shí)進(jìn)行移栽，將瓶蓋打開在常溫中煉苗一周左右，然后移栽于人工溫室氣候箱，光/暗周期為16h/8h，光照強(qiáng)度為200umol.m^-2s^-1，溫度為25℃/23℃，相對(duì)濕度為70％。

1.6.2矮牽牛遺傳轉(zhuǎn)化體系選擇壓和抑菌劑濃度的確定

1.6.2.1潮霉素選擇壓的確定

本試驗(yàn)構(gòu)建的過表達(dá)載體pcambia1304-rrdxr、pcambia1304-rrnudx1攜帶潮霉素(hyg)抗性基因，因此確定hgy為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的矮牽牛遺傳轉(zhuǎn)化的選擇抗生素。在超凈工作臺(tái)上，選取生長(zhǎng)旺盛的矮牽牛無菌苗，將葉片切為1cm²的葉盤，分別置于hyg濃度為1、3、5、6、7、9、10、15mg/l的培養(yǎng)基ms1上，每個(gè)梯度處理30塊葉片組織，培養(yǎng)30天，每15天更換1次培養(yǎng)基，重復(fù)3次。

從表2可以看出，hyg的濃度越高，對(duì)外植體的分化影響越大，愈傷誘導(dǎo)和芽分化的臨界值均為7mg/l，生根的臨界濃度6mg/l，因此在選擇培養(yǎng)時(shí)，分別使用相應(yīng)濃度的hyg進(jìn)行篩選，確保陽(yáng)性率的提高。

表2不同hyg濃度對(duì)矮牽牛各時(shí)期分化的影響

1.6.2.2羧芐濃度的確定

本試驗(yàn)采用羧芐作為遺傳轉(zhuǎn)化的抑菌劑，在超凈工作臺(tái)上，選取生長(zhǎng)旺盛的矮牽牛無菌苗，將葉片切為1cm²的葉盤，分別置于cb濃度為100、200、300、400、500、600、700mg/l的培養(yǎng)基ms1上，每個(gè)梯度處理30塊葉片組織，培養(yǎng)30天，每15天更換1次培養(yǎng)基，重復(fù)3次。

從表3可以看出，羧芐對(duì)外植體的生長(zhǎng)沒有明顯的抑制作用，濃度為500mg/l時(shí)，對(duì)愈傷和芽分化有小幅度影響，濃度為500mg/l時(shí)，對(duì)生根有小幅度影響，故三種選擇培養(yǎng)基的抑菌劑濃度均選擇500mg/l。

表3不同cb濃度對(duì)矮牽牛各時(shí)期分化的影響

1.6.2.3農(nóng)桿菌侵染液的培養(yǎng)

(1)取出-70℃中含有目的基因的農(nóng)桿菌菌株，在含有km和rif的yeb篩選培養(yǎng)基上劃板，28℃暗培養(yǎng)2-3天；

(2)在yeb+kan+rif液體培養(yǎng)基中接種單菌落，培養(yǎng)od為0.8-1.3；

(3)菌液pcr驗(yàn)證，確定菌液中目的基因的正確性；

(4)經(jīng)過鑒定的菌液，加入50ml不含抗生素液體yeb在28℃200rpm震蕩1-2天；

(5)將二次活化的菌液在4℃5000rpm離心12-15min后，收集菌體，再用事先準(zhǔn)備好的侵染液(ms4)重懸稀釋菌液od為0.3-0.6備用。

1.7矮牽牛的遺傳轉(zhuǎn)化

1.7.1葉片的預(yù)處理

選取生長(zhǎng)旺盛的矮牽牛葉片，在超凈工作臺(tái)上，切成1cm²的小方塊，葉片腹面向下，置于ms固體培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2天。

1.7.2侵染

首先在共培養(yǎng)表面平鋪無菌濾紙片；第二步將預(yù)先培養(yǎng)2天的材料放入已準(zhǔn)備好的侵染液中侵染5-8min；第三步取出侵染后的葉片，用無菌濾紙吸干表面的菌液，置于共培養(yǎng)基(ms5)上培養(yǎng)3天。

1.7.3分化篩選培養(yǎng)

將共培養(yǎng)3天后的葉盤取出，用無菌濾紙吸干材料表面的菌液；轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)愈傷組織，置于植物組培室培養(yǎng)，每15d換一次培養(yǎng)基，直至長(zhǎng)出再生苗。

1.7.4生根篩選培養(yǎng)

當(dāng)篩選培養(yǎng)的愈傷組織分化出的再生苗長(zhǎng)至2-3cm左右時(shí)，切下更換至生根篩選培養(yǎng)基中，沒有分化出芽的愈傷組織需要切除褐化變黃的部分，轉(zhuǎn)移到新的分化篩選培養(yǎng)基上，陽(yáng)性植株2-3周即可生根(圖1)。

1.8轉(zhuǎn)基因矮牽牛的檢測(cè)

采用gus染色法和pcr法檢測(cè)抗性植株

1.8.1矮牽牛愈傷組織gus染色

對(duì)潮霉素篩選下生長(zhǎng)形態(tài)正常的矮牽牛愈傷組織進(jìn)行g(shù)us染色，結(jié)果顯示，野生型呈黃白色，無gus底物活性，轉(zhuǎn)rrnudx1基因的愈傷中染出了不同程度的藍(lán)色(圖6)，表明篩選標(biāo)記基因gus正常表達(dá)。

1.8.2轉(zhuǎn)rrnudx1基因的矮牽牛植株dna驗(yàn)證

在獲得的轉(zhuǎn)rrnudx1基因的矮牽牛植株中隨機(jī)挑選6個(gè)單株，提取葉片dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，結(jié)果顯示6株中5株能擴(kuò)增出單一的條帶且大小為500bp左右，與轉(zhuǎn)入的對(duì)照質(zhì)粒產(chǎn)物大小相似，而野生型不能擴(kuò)增出條帶(圖7)，由此可見rrnudx1基因已經(jīng)整合到矮牽?；蚪M中。

1.9矮牽牛轉(zhuǎn)基因植株表型觀察

將野生型和轉(zhuǎn)rrnudx1基因的矮牽牛植株移栽于人工溫室氣候箱，相同培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，觀測(cè)記錄轉(zhuǎn)基因和野生型植株葉片的形態(tài)、開花時(shí)間、花朵大小、花色和花期等表型方面的變化(圖8)，記錄從定植到開花所需的時(shí)間(天數(shù)，d)。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，移栽35天后，部分轉(zhuǎn)rrnudx1基因植株開始開花，而野生型植株則在移栽60天后才陸續(xù)開花。同時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株的葉片明顯變寬，整體葉形由長(zhǎng)橢圓形向類心形轉(zhuǎn)變(圖8，表4)。

表4移栽35天后野生型和轉(zhuǎn)基因植株葉片形態(tài)比較(mm)

2結(jié)論

綜合上述結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，轉(zhuǎn)rrnudx1基因矮牽牛長(zhǎng)勢(shì)明顯增強(qiáng)，且開花期顯著提前近30天，說明過表達(dá)rrnudx1基因具有改變植物花期、促進(jìn)提早開花的功能，這為我們接下來利用rrnudx1基因改變其它植物的花期奠定了突破性基礎(chǔ)。

sequencelisting

<110>揚(yáng)州大學(xué)

<120>玫瑰rrnudx1基因在改變植物花期中的應(yīng)用

<130>

<160>4

<170>patentinversion3.3

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<212>dna

<213>人工序列

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<213>人工序列

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