本發(fā)明涉及用于檢測超氧陰離子和二價汞離子的熒光探針，具體的說是一種基于花菁的有機(jī)化合物及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

汞是公認(rèn)的全球性環(huán)境污染物，20世紀(jì)50年代，人類從“水俁病”開始了解汞(mercury，hg)及其化合物的毒性。隨著金屬汞(hg)的用途越來越廣，汞中毒的病例越來越多，汞中毒的發(fā)病率在我國呈持續(xù)增長趨勢，同時也得到政府和社會的廣泛關(guān)注。近年來某些疾病在診治過程中因用藥不當(dāng)，如口服汞、無機(jī)汞化合物以及使用含汞及其化合物的中藥偏方治療哮喘、銀屑病、痤瘡、鼻竇炎等導(dǎo)致體內(nèi)汞蓄積，應(yīng)用含汞超標(biāo)的美白祛斑化妝品引起非職業(yè)性汞中毒病例亦不少見。研究表明，汞中毒的發(fā)病機(jī)制錯綜復(fù)雜，如汞可與人體金屬硫蛋白結(jié)合，并能取代某些酶中的金屬分子而改變其活力；汞能與細(xì)胞膜上的巰基結(jié)合，引起膜通透性的改變；汞中毒也可引起氧化應(yīng)激，干擾神經(jīng)遞質(zhì)和離子的交換等。尤其是汞中毒后氧化應(yīng)激引起的自由基生成增加和消除減少近年來頗受重視。研究表明，汞在體內(nèi)一方面與谷胱甘肽等抗氧化物結(jié)合，降低體內(nèi)消除自由基的能力；另一方面又可產(chǎn)生自由基，導(dǎo)致體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物提高，引起氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡。本專利中所涉及的熒光探針將有助于探索汞離子刺激下，活性氧爆發(fā)的生理過程。

目前，用于檢測o2·^-的方法有:電子順磁共振法，sod酶活性測定法，高效液相色譜法(hplc)以及電化學(xué)方法。對汞化合物檢測方法，包括分光光度法、原子發(fā)射光譜法、原子吸收光譜法、氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法。然而這些方法大多需要樣品的預(yù)處理，需要復(fù)雜的操作手段及大型儀器。因此，尋找一種方便快捷檢測超氧陰離子和汞離子的方法迫在眉睫。熒光探針方法以其高時空分辨率、操作簡便和原位非損傷檢測等優(yōu)點，在生物活性物種檢測領(lǐng)域，已成為一種功能強(qiáng)大的研究輔助工具。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種基于花菁的有機(jī)化合物及其應(yīng)用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種基于花菁的有機(jī)化合物，基于花菁的有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)式ⅰ所示，

所述基于花菁的有機(jī)化合物在協(xié)同檢測超氧陰離子和二價汞離子中的應(yīng)用。

一種熒光探針，熒光探針為式ⅰ所示基于花菁的有機(jī)化合物，

所述熒光探針用于定性/定量地協(xié)同檢測超氧陰離子和二價汞離子。

一種熒光探針的應(yīng)用，所述熒光探針在定性/定量地協(xié)同檢測超氧陰離子和二價汞離子中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明化合物用于作為聯(lián)動檢測超氧陰離子和二價汞離子的熒光探針，其在檢測超氧陰離子前后，熒光由關(guān)到開，產(chǎn)生熒光；檢測二價汞離子前后，熒光探針吸收和熒光發(fā)射最大波長會有改變?？捎糜谒w系、模擬生理環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子和二價汞離子的聯(lián)動檢測，并可大大降低外部檢測條件的干擾，提高檢測精度。本發(fā)明化合物用作熒光探針，可用于細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子和二價汞離子聯(lián)動檢測，這對深入研究超氧陰離子和二價汞離子在生物體內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程和機(jī)理，進(jìn)一步了解超氧陰離子和二價汞離子的生理和毒理作用具有重要的生物醫(yī)學(xué)意義。本發(fā)明具有操作簡單、方便、快速，靈敏度高，選擇性好，響應(yīng)時間短，可對檢測目標(biāo)物進(jìn)行原位、實時監(jiān)測，且應(yīng)用范圍廣泛等優(yōu)點。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例提供的采用的熒光探針對不同濃度超氧陰離子(o2^·-)檢測前后熒光變化。

圖2為本發(fā)明實施例提供的所采用的熒光探針對o2^·-的選擇性示意圖；其中，橫坐標(biāo)從左至右依次為：1、空白；2、o2^·-(25μm)；3、羥基自由基(25μm)；4、雙氧水(200μm)；5、過氧化亞油酸(400μm)；6、枯烯氫過氧化物(300μm)；7、過氧化叔丁醇(250μm)；8、一氧化氮(300μm)；9、過氧化亞硝酰陰離子(25μm)；10、次氯酸(200μm)。

圖3為本發(fā)明實施例提供的采用的熒光探針對不同濃度hg²⁺檢測前后熒光變化。

圖4為本發(fā)明實施例提供的所采用的熒光探針對汞離子的選擇性示意圖；其中，橫坐標(biāo)從左至右依次為：1、空白；2、kcl(100μm)；3、zn(ch3coo)2(100μm)；4、cacl2(100μm)；5、mgcl2(100μm)；6、cocl2(100μm)；7、mncl2(100μm)；8、fecl3(100μm)；9、cdcl2(100μm)；10、cucl2(100μm)；11、nacl(100μm)；12、pb(no3)2(100μm)；13、nicl2(100μm)；14、hgcl2(10μm)。

圖5為為本發(fā)明實施例提供的人胚腎hek-293細(xì)胞作為生物模型，細(xì)胞用化合物i(2μm)孵育15分鐘作為對照組的三通道熒光圖。其中，通道1：750-850nm，通道2：540-585nm，通道3：585-725nm。

圖6為hek-293細(xì)胞用化合物i(2μm)孵育15分鐘，再加入超氧陰離子(2μm)孵育15分鐘，用mem培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞三次后的三通道熒光圖。通道1：750-850nm，通道2：540-585nm，通道3：585-725nm。

圖7為hek-293細(xì)胞用化合物i(2μm)孵育15分鐘，再加入超氧陰離子(2μm)和hgcl2(2μm)后的三通道熒光圖。通道1：750-850nm，通道2：540-585nm，通道3：585-725nm。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的解釋說明。

基于花菁的有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)式為：

將化合物ⅰ與待測定水體、模擬生理環(huán)境或生物體內(nèi)外的超氧陰離子反應(yīng)從而導(dǎo)致熒光由關(guān)到開，所得化合物ii的結(jié)構(gòu)；

將化合物ii與待測定水體、模擬生理環(huán)境或生物體內(nèi)外的二價汞離子反應(yīng)，熒光探針的吸收和熒光發(fā)射最大波長會有改變，所得化合物iii的結(jié)構(gòu)；

本發(fā)明檢測o2^·-和二價汞離子的熒光探針，在o2^·-和二價汞離子存在下對應(yīng)的熒光發(fā)射波長和熒光強(qiáng)度發(fā)生明顯變化，可用于o2^·-和二價汞離子的檢測，并可大大降低外部檢測條件的干擾，提高檢測精度，檢測信噪比高，靈敏度和選擇性好。此外，該發(fā)明o2^·-和二價汞離子熒光探針的這類化合物，在o2^·-和二價汞離子存在時紫外吸收亦發(fā)生明顯變化，可用紫外分光光度計進(jìn)行檢測。這類化合物作為熒光探針可用于復(fù)雜生物樣品中o2^·-和二價汞離子的聯(lián)動檢測，這對深入研究汞離子刺激下，o2^·-和汞離子在生物體內(nèi)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)具有重要的生物醫(yī)學(xué)意義。本發(fā)明與傳統(tǒng)檢測技術(shù)相比，非侵入性的熒光探針檢測操作簡單、方便、快速，靈敏度高，選擇性好，響應(yīng)時間短，可對檢測目標(biāo)物進(jìn)行原位、實時監(jiān)測，且應(yīng)用范圍廣泛。

實施例1.基于花菁的有機(jī)化合物的制備：

化合物ⅰ中所示花菁熒光團(tuán)來自市售商品，然后在熒光團(tuán)相應(yīng)的位置修飾上不同的檢測基團(tuán)，得到的相應(yīng)的花菁類化合物。具體實施例如下：

(1)化合物ii的制備

將花菁熒光團(tuán)(0.209g，0.327mmol)溶解在20ml甲醇中，將na2se(0.05g，0.4mmol)溶解在1ml水中，室溫條件下，將1ml的na2se溶液滴加到圓底燒瓶中,在氬氣保護(hù)下回流30min。用飽和碘化鉀溶液洗滌，并用冰醋酸調(diào)至中性，經(jīng)二氯甲烷萃取，旋蒸。粗產(chǎn)品用柱層析色譜進(jìn)行純化，洗脫劑選擇乙酸乙酯和甲醇(6:1/v/v)，得到0.128g(0.187mmol)綠色固體化合物ii，產(chǎn)率57.2％。

化合物ii:¹hnmr(500mhz,cdcl3-d1)δ(ppm):1.525-1.762(m,12h),1.925(s,1h),1.964-2.027(m,1h),2.154-2.321(m,7h),2.470(s,1h),2.515(s,1h),2.530-2.562(d,1h),2.570-2.612(m,1h),2.613-2.685(q,3h),2.700(s,1h),2.871-2.931(q,1h),3.614-3.678(q，1h)，3.868-3.936(q,1h),4.742-4.812(q,1h),7.295-7.340(m,2h),7.422-7.455(d,1h),7.460-7.490(m,1h),7.497-7.567(m,2h),7.631-7.686(t,1h),7.828-7.882(m,1h).¹³cnmr(125mhz,cdcl3-d1)δ(ppm):141.753，141.150，140.443，129.623，128.329，127.884，127.223，125.866，125.820，124.944，122.758，122.250，122.143，121.638，113.436，108.207，91.995，52.990，47.823，45.414，43.083，39.115，36.679，28.582，28.449，27.099，25.488，25.368，22.149，13.417.lc-ms(api-es):m/zc34h41n2se⁺calcd557.24，found[m+h]⁺557.19.

(2)化合物i的制備

將化合物ii(0.12g，0.1755mmol)溶解在10ml乙醇中，將nabh4(0.0122g，0.3225mmol)溶解在2ml乙醇中，冰浴條件下，將2ml的nabh4溶液滴加到圓底燒瓶中,在氬氣保護(hù)下反應(yīng)10min。用除氧的飽和碘化鉀溶液洗滌，再經(jīng)二氯甲烷萃取，旋蒸。粗產(chǎn)品用柱層析色譜進(jìn)行純化，洗脫劑選擇二氯甲烷和石油醚(1:1/v/v)，得到0.049g(0.08786mmol)黃色固體化合物i，產(chǎn)率50％。

化合物i:¹hnmr(500mhz,cdcl3-d1)δ(ppm):1.027(s,4h),1.053-1.110(t,4h),1.112-1.153(t,1h),1.182-1.291(m,8h),1.334-1.439(t,6h),1.530-1.623(d,7h),2.180-2.250(m,1h),2.647-2.680(d,1h),3.206-3.294(m,1h),3.364-3.444(m,1h),6.610(d,2h),6.767(t，2h)，7.027(d,2h),7.119(t,2h).¹³cnmr(125mhz,cdcl3-d1)δ(ppm):162.726，149.414，139.000，130.180，127.451，125.718，124.955，124.114，122.155，118.673，108.388，104.759，102.424，87.948，85.063，53.430，40.661，33.512，32.697，31.951，29.723，26.499，25.470，24.332，22.714，14.140，9.967.lc-ms(api-es):m/zc34h42n2secalcd558.25,found[m+h]⁺558.15.

實施例2

將制備所得化合物ⅰ作為探針應(yīng)用于水體系、模擬生理環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行對超氧陰離子和汞離子的檢測，模擬生理條件，以下各項實驗均在ph＝7.4條件下進(jìn)行(hepes緩沖溶液，濃度為10mm)，探針濃度采用10μm。

上述制備所得化合物i對超氧陰離子的響應(yīng)：

ph采用hepes緩沖溶液控制在ph＝7.4。于每個10ml比色管中加入10μm化合物ⅰ，然后加入不同濃度的超氧陰離子(超氧陰離子濃度為0-10μm)，ph＝7.4的10mmhepes定容到10ml，搖勻溶液，平衡10min后，將各個比色管中工作液分別倒入到熒光皿中測定熒光光譜。在750-900nm處測定熒光強(qiáng)度，如圖1所示。化合物i可用于實現(xiàn)生物體內(nèi)的超氧陰離子檢測。同時，本發(fā)明實施例提供的化合物i與超氧陰離子反應(yīng)后產(chǎn)物結(jié)構(gòu)如下：

而后再向上述各10ml比色管中繼續(xù)加入0-10μm不同濃度的氯化汞(hgcl2)，搖勻溶液，平衡10min后，將各個比色管中工作液分別倒入到熒光皿中測定熒光光譜。在540-750nm處測定熒光強(qiáng)度，如圖3所示。在檢測超氧陰離子反應(yīng)后產(chǎn)物可進(jìn)一步的用于實現(xiàn)生物體內(nèi)的hgcl2的檢測。同時，進(jìn)一步與hgcl2反應(yīng)后產(chǎn)物結(jié)構(gòu)如下：

實施例3

化合物ⅰ對超氧陰離子的選擇性

ph采用hepes緩沖溶液控制在ph＝7.4。取多個10ml比色管，并在每個10ml比色管中加入10μm化合物ⅰ，加入不同待檢測物，用10mmph為7.4的hepes緩沖液定容到10ml。搖勻溶液，25℃下平衡10min后，將各個比色管中工作液分別倒入到熒光皿中測定熒光光譜(參見圖2)。待測物依次為：1、空白；2、超氧陰離子(25μm)；3、羥基自由基(25μm)；4、雙氧水(200μm)；5、過氧化亞油酸(400μm)；6、枯烯氫過氧化物(300μm)；7、過氧化叔丁醇(250μm)；8、一氧化氮(300μm)；9、過氧化亞硝酰陰離子(25μm)；10、次氯酸(200μm)。

由圖2可見化合物ⅰ對超氧陰離子的選擇性，化合物ⅰ對超氧陰離子具有很好的選擇性。

實施例4

實施例2操作后，ph采用hepes緩沖溶液控制ph＝7.4。于每個10ml比色管中加入10μm化合物ⅰ，然后加入濃度從0-10μm的超氧陰離子，ph＝7.4的10mmhepes定容到10ml，搖勻溶液，平衡10min后，將各個比色管中工作液分別倒入到熒光皿中測定熒光光譜。

而后向上述各比色管中依次加入待測物，搖勻溶液，25℃下平衡10min后，將各個比色管中工作液分別倒入到熒光皿中測定熒光光譜(參見圖4)。待測物依次為：1、空白；2、kcl(100μm)；3、zn(ch3coo)2(100μm)；4、cacl2(100μm)；5、mgcl2(100μm)；6、cocl2(100μm)；7、mncl2(100μm)；8、fecl3(100μm)；9、cdcl2(100μm)；10、cucl2(100μm)；11、nacl(100μm)；12、pb(no3)2(100μm)；13、nicl2(100μm)；14、hgcl2(10μm)?？梢娨徊降淖C明由化合物ⅰ檢測超氧陰離子后產(chǎn)生的化合物ii對二價汞離子具有很好的選擇性，進(jìn)一步說明化合物ⅰ可用于協(xié)同檢測超氧陰離子和二價汞離子。

實施例6

化合物i在人胚腎hek-293細(xì)胞內(nèi)的成像選擇人胚腎hek-293細(xì)胞作為生物模型，首先，在37℃下，細(xì)胞用化合物i(2μm)孵育15分鐘作為對照組，用mem沖洗細(xì)胞三次細(xì)胞沒有顯示熒光(圖5)。

在37℃下，再將細(xì)胞用化合物ii(2μm)孵育15分鐘作為對照組，用mem沖洗細(xì)胞三次細(xì)胞顯示微弱的熒光(圖5)。

選擇人胚腎hek-293細(xì)胞作為生物模型，首先，在37℃下，細(xì)胞用化合物i(2μm)孵育15分鐘，而后加入超氧陰離子(2μm)再孵育15分鐘，用mem沖洗細(xì)胞三次，有明顯的熒光生成(參見圖6)，可見化合物i可以用來直接檢測活細(xì)胞外源添加的超氧陰離子。

選擇人胚腎hek-293細(xì)胞作為生物模型，首先，在37℃下，細(xì)胞用化合物i(2μm)孵育15分鐘，而后再加入hgcl2(2μm)孵育15分鐘，用mem沖洗細(xì)胞三次，在540-585nm熒光檢測(圖7)和585-740nm熒光檢測(圖7)，兩處均有強(qiáng)烈的熒光生成。因此，化合物ⅰ可用于協(xié)同直接檢測活細(xì)胞外源添加的氯化汞。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。作為熒光染料是本發(fā)明新化合物的一種用途，不能認(rèn)定本發(fā)明的化合物僅用于熒光染料，對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在基于本發(fā)明化合物用作熒光染料的相同作用機(jī)理的考慮下，還可以做出若干簡單推理，得出本發(fā)明的化合物的其他應(yīng)用用途，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。