本發(fā)明涉及一種檢測(cè)水中銅綠假單胞菌和toxa的引物，本發(fā)明還涉及一種檢測(cè)水中銅綠假單胞菌及其重要毒力因子外毒素蛋白a，toxa的雙重微滴式數(shù)字pcr檢測(cè)試劑盒，本發(fā)明還涉及一種采用上述試劑盒檢測(cè)食水中銅綠假單胞菌及toxa的方法。
背景技術(shù)：
銅綠假單胞菌pseudomonasaeruginosa原稱綠膿桿菌。在自然界分布廣泛，為土壤中存在的最常見的細(xì)菌之一。各種水、空氣、正常人的皮膚、呼吸道和腸道等都有本菌存在。本菌存在的重要條件是潮濕的環(huán)境。該菌是一種常見的環(huán)境微生物，因?qū)I(yíng)養(yǎng)要求不高，善于利用各種碳源和氨化化合物作為氮源，所以在水、土壤、食品以及醫(yī)院等環(huán)境中廣泛存在。美國(guó)、加拿大、歐洲、日本、巴西及世界衛(wèi)生組織對(duì)飲用水中銅綠假單胞菌含量的限定mpn<3/l或每250ml不得檢出。我國(guó)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)包裝飲用水》(gb19298-2014)，則規(guī)定5個(gè)水樣中，每個(gè)樣中250ml都不得檢出銅綠假單胞菌。
2009年10月開始，《飲用天然礦泉水》等水相關(guān)的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)先后都將菌落總數(shù)這一指標(biāo)刪除。這一改革雖然具有實(shí)際意義，但客觀來說，使得水生產(chǎn)企業(yè)簡(jiǎn)化了消毒程序，大大提高了銅綠假單胞菌超標(biāo)概率。2015年9月23日，北京市食品藥品監(jiān)督管理局下架4款“銅綠假單胞菌”超標(biāo)嚴(yán)重的純凈水、礦泉水。近年來，各地更是頻現(xiàn)飲用水中銅綠假單胞超標(biāo)的情況。
銅綠假單胞菌的急性感染過程中，細(xì)菌表面蛋白如鞭毛、脂多糖、粘多糖等促進(jìn)細(xì)菌對(duì)宿主上皮細(xì)胞的黏附和定植，而細(xì)菌的擴(kuò)散和組織損傷則主要由ⅱ型和ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌的主要毒力因子、蛋白酶等所致。其中，外毒素a，即toxa由ⅱ型分泌系統(tǒng)產(chǎn)生，是銅綠假單胞菌最主要的致病因子，通過使靶細(xì)胞的延長(zhǎng)因子-2核糖基化失活，從而抑制靶細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致靶細(xì)胞的壞死。
飲用水生產(chǎn)質(zhì)量的嚴(yán)格把控需要對(duì)銅綠假單胞菌準(zhǔn)確、快速檢測(cè)，同時(shí)對(duì)銅綠假單胞菌傳播風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估。本發(fā)明通過設(shè)計(jì)針銅綠假單胞菌和toxa基因的特異引物、探針組合，可了解水中銅綠假單胞菌的分布和菌株中toxa基因的流行情況。
目前，各類食品安全標(biāo)準(zhǔn)都要求對(duì)銅綠假單胞菌的進(jìn)行定量檢測(cè)，但對(duì)于銅綠假單胞菌的定量檢測(cè)主要還是通過傳統(tǒng)方法進(jìn)行培養(yǎng)后計(jì)數(shù)，但傳統(tǒng)方法存在過程繁瑣，周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)。而常規(guī)pcr方法需要pcr擴(kuò)增后進(jìn)行電泳，不僅操作繁瑣，而且不能實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。目前，southernblot和實(shí)時(shí)熒光定量pcr是常用的兩種外源基因拷貝數(shù)分析技術(shù)，已廣泛用于外源基因拷貝數(shù)分析。但這兩種方法也存在一定缺陷。例如，southernblot方法分析時(shí)工作量大、周期長(zhǎng)、操作要求高、準(zhǔn)確性較差，特別是對(duì)于多拷貝基因的分析，結(jié)果容易偏小。熒光定量pcr在分析外源基因拷貝數(shù)時(shí)必須依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線和已知拷貝數(shù)的基因，只是一種相對(duì)定量方法，且標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)量易受到dna純度、引物和探針的濃度、反應(yīng)抑制因子等諸多因素影響；另外，標(biāo)準(zhǔn)曲線必須基于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)建立，而標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的種類有限和昂貴價(jià)格不能適用于所有的研究。
微滴數(shù)字pcr是近年來興起的一種新的絕對(duì)定量技術(shù)，它基于單分子pcr方法來進(jìn)行計(jì)數(shù)的核酸定量，是一種絕對(duì)定量的方法。主要采用當(dāng)前分析化學(xué)熱門研究領(lǐng)域的微流控或微滴化方法，將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應(yīng)器或微滴中，每個(gè)反應(yīng)器的核酸模板數(shù)少于或者等于1個(gè)。這樣經(jīng)過pcr循環(huán)之后，有一個(gè)核酸分子模板的反應(yīng)器就會(huì)給出熒光信號(hào)，沒有模板的反應(yīng)器就沒有熒光信號(hào)。根據(jù)相對(duì)比例和反應(yīng)器的體積，就可以推算出原始溶液的基因拷貝數(shù)。
但基于微滴數(shù)字pcr平臺(tái)的拷貝數(shù)的分析工作報(bào)道較少，針對(duì)銅綠假單胞菌及toxa基因的檢測(cè)就更未見報(bào)道了。本發(fā)明基于微滴式ddpcr平臺(tái)，建立了銅綠假單胞菌及其toxa基因拷貝數(shù)分析方法，研究結(jié)果為分析食品安全生物源性風(fēng)險(xiǎn)因子的定量檢測(cè)提供了新的方法和借鑒，也為食品安全質(zhì)量控制提供了一個(gè)技術(shù)支撐手段。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種引物且組分和配比合理，使用方便，檢測(cè)快捷，準(zhǔn)確，適用于雙重ddpcr檢測(cè)水中銅綠假單胞菌及toxa基因的試劑盒；
本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種采用上述試劑盒檢測(cè)水中銅綠假單胞菌及toxa基因的方法，該方法操作簡(jiǎn)便、快速，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下方案：
一種水中銅綠假單胞菌及toxa基因引物，其特征在于該引物的序列和探針序列分別為：
上游引物p.af:tggtagtccacgccgtaaa
下游引物p.ar:cagactgcgatccggactacg
探針p.ap:tcgaccgcctggggagtacg
上游引物toxaf：ggctatgtgttcgtcggcta
下游引物toxar：ttactttaggtcctcgcgcg
探針toxap：ggctacgcccaggaccagga
一種ddpcr檢測(cè)水中銅綠假單胞菌及toxa基因的試劑盒，其特征在于該試劑盒中反應(yīng)體系包括以下組分：其中2×ddpcrsupermix10.0μl，銅綠假單胞菌和toxa正反向引物各0.1-1.0μl、探針各0.1-1.0μl，dna模板4.0μl。
一種ddpcr檢測(cè)銅綠假單胞菌及toxa基因的方法，其特征在于包括以下步驟：
a、提取樣品dna；
b、將各反應(yīng)組分加入上述20.0μl反應(yīng)體系，然后加入70.0μl礦物油，混勻后轉(zhuǎn)移到微滴發(fā)生器上自動(dòng)產(chǎn)生微滴；
c、將產(chǎn)生的微滴細(xì)全部轉(zhuǎn)移到96孔反應(yīng)板pcr反應(yīng)管中；再將96孔反應(yīng)板在封膜儀上封膜，并置于普通pcr儀進(jìn)行pcr反應(yīng)。
d、打開微滴熒光檢測(cè)器應(yīng)用軟件，將pcr反應(yīng)結(jié)束后的96孔反應(yīng)板直接插入設(shè)備，檢測(cè)每pcr反應(yīng)管中微滴的pcr反應(yīng)情況,最后根據(jù)珀松分布定律算出待測(cè)基因的拷貝數(shù)。
如上所述檢測(cè)銅綠假單胞菌及toxa基因的方法，其特征在于步驟b中pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序按以下步驟進(jìn)行：
(1)94℃預(yù)變性3min；
(2)94℃變性10s，60℃退火1min，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；
(3)98℃酶熱失活10min；
(4)4℃停止反應(yīng)。
如上所述檢測(cè)銅綠假單胞菌及toxa基因的方法，其特征在于步驟a中所述提取樣品dna的具體步驟如下：
50ml水樣直接10000rpm立心10分鐘，或者取50ml水樣通過濾膜過濾，用鑷子夾取濾膜在50ml的離心管用2ml超純水沖洗后再10000rpm離心10分鐘，去上清；加入5mlctab提取液，充分混勻。65℃孵育30min，不時(shí)振蕩；后8000r/min室溫離心10min，取1ml上清液入2ml離心管中；加入700μl氯仿后用力振蕩，13000g離心10min，轉(zhuǎn)移上清液600μl到新的2ml離心管中；加入2倍體積的ctab沉淀溶液顛倒數(shù)次后室溫靜置60min，13000×g離心10min，棄去上清，加入350μlnacl溶液將沉淀進(jìn)行懸浮，再加入350μl氯仿，渦旋振蕩進(jìn)行混勻，13000g離心10min，轉(zhuǎn)移上清后加入0.8倍體積的異丙醇用來沉淀核酸，室溫放置20min，13000g離心10min，棄去上清，加入500μl70％乙醇溶液洗滌沉淀，溶解于50μlte溶液中。
本發(fā)明中敏感性和特異性試驗(yàn)：
采用測(cè)序等方法對(duì)陽性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果陽性擴(kuò)增產(chǎn)物序列進(jìn)行blast比較時(shí)，序列均與genbank目的序列高度同源。將10倍稀釋的參考菌株基因組dna加入前述反應(yīng)體系，重復(fù)試驗(yàn)顯示檢測(cè)樣品過程中具有很好重復(fù)性。稀釋模板濃度對(duì)數(shù)值和拷貝數(shù)值之間也呈良好的線性關(guān)系r2≥0.95。說明該方法具有較好的精確度和良好的穩(wěn)定性。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn):
1)本發(fā)明試劑盒組分和配比合理，使用方便，檢測(cè)快捷，準(zhǔn)確，適用于ddpcr定量檢測(cè)銅綠假單胞菌及toxa基因；
2)本發(fā)明檢測(cè)方法簡(jiǎn)化了檢測(cè)流程，而且無需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，大大縮短了檢測(cè)周期，檢測(cè)時(shí)間比傳統(tǒng)培養(yǎng)計(jì)數(shù)方法縮短兩天左右；
3)本發(fā)明檢測(cè)方法整個(gè)過程無需使用標(biāo)準(zhǔn)曲線，且與新一代測(cè)序無縫對(duì)接直接，對(duì)基因拷貝數(shù)可執(zhí)行絕對(duì)定量分析。
4)數(shù)字pcr檢測(cè)系統(tǒng)通過微滴化處理，可以大大減少背景和基質(zhì)的干擾，靈敏度可以低至1個(gè)拷貝,因此,對(duì)低濃度基因濃度的細(xì)微變化進(jìn)行準(zhǔn)確及重復(fù)性佳的檢測(cè)。
5)采用本發(fā)明檢測(cè)方法在同一反應(yīng)體系即可實(shí)現(xiàn)同時(shí)銅綠假單胞菌和toxa基因進(jìn)行精準(zhǔn)檢測(cè)，操作簡(jiǎn)便、快速。具有較好產(chǎn)業(yè)化前景。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述：
實(shí)施例1
本發(fā)明檢測(cè)水中銅綠假單胞菌及toxa基因的引物，序列分別為：
上游引物p.af:tggtagtccacgccgtaaa
下游引物p.ar:cagactgcgatccggactacg
探針p.ap:tcgaccgcctggggagtacg
上游引物toxaf：ggctatgtgttcgtcggcta
下游引物toxar：ttactttaggtcctcgcgcg
探針toxap：ggctacgcccaggaccagga
實(shí)施例2
本發(fā)明一種檢測(cè)水中銅綠假單胞菌及toxa基因的試劑盒，其中20μl反應(yīng)體系包括以下組分：
其中2×ddpcrsupermix10.0μl，銅綠假單胞菌和toxa正反向引物各1.0μl、探針各1.0μl，dna模板4.0μl。
其中引物序列如下:
上游引物p.af:tggtagtccacgccgtaaa
下游引物p.ar:cagactgcgatccggactacg
探針p.ap:tcgaccgcctggggagtacg
上游引物toxaf：ggctatgtgttcgtcggcta
下游引物toxar：ttactttaggtcctcgcgcg
探針toxap：ggctacgcccaggaccagga
實(shí)施例3
本發(fā)明檢測(cè)水中銅綠假單胞菌及toxa基因方法，包括以下步驟：
a、提取樣品dna；
b、將各反應(yīng)組分加入上述20.0μl反應(yīng)體系，然后加入70.0μl礦物油，混勻后轉(zhuǎn)移到微滴發(fā)生器上自動(dòng)產(chǎn)生微滴；
c、將產(chǎn)生的微滴仔細(xì)全部轉(zhuǎn)移到96孔反應(yīng)板pcr反應(yīng)管中；再將96孔反應(yīng)板在封膜儀上封膜，并置于普通pcr儀進(jìn)行pcr反應(yīng)。
d、打開微滴熒光檢測(cè)器應(yīng)用軟件，將pcr反應(yīng)結(jié)束后的96孔反應(yīng)板直接插入設(shè)備，檢測(cè)每pcr反應(yīng)管中微滴的pcr反應(yīng)情況,最后根據(jù)珀松分布定律算出待測(cè)基因的拷貝數(shù)。
其中引物序列如下:
上游引物p.af:tggtagtccacgccgtaaa
下游引物p.ar:cagactgcgatccggactacg
探針p.ap:tcgaccgcctggggagtacg
上游引物toxaf：ggctatgtgttcgtcggcta
下游引物toxar：ttactttaggtcctcgcgcg
探針toxap：ggctacgcccaggaccagga
所述的熒光pcr擴(kuò)增按以下步驟進(jìn)行：
(1)(1)94℃預(yù)變性3min；
(2)94℃變性10s，60℃退火1min，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；
(3)98℃酶熱失活10min；
(4)4℃停止反應(yīng)。
實(shí)施例4
本發(fā)明檢測(cè)水中銅綠假單胞菌及toxa基因方法，包括以下步驟：
50ml水樣直接10000rpm立心10分鐘，或者取50ml水樣通過濾膜過濾，用鑷子夾取濾膜在50ml的離心管用2ml超純水沖洗后再10000rpm離心10分鐘，去上清；加入5mlctab提取液，充分混勻。65℃孵育30min，不時(shí)振蕩；后8000r/min室溫離心10min，取1ml上清液入2ml離心管中；加入700μl氯仿后用力振蕩，13000g離心10min，轉(zhuǎn)移上清液600μl到新的2ml離心管中；加入2倍體積的ctab沉淀溶液顛倒數(shù)次后室溫靜置60min，13000×g離心10min，棄去上清，加入350μlnacl溶液將沉淀進(jìn)行懸浮，再加入350μl氯仿，渦旋振蕩進(jìn)行混勻，13000g離心10min，轉(zhuǎn)移上清后加入0.8倍體積的異丙醇用來沉淀核酸，室溫放置20min，13000g離心10min，棄去上清，加入500μl70％乙醇溶液洗滌沉淀，溶解于50μlte溶液中。
其中2×ddpcrsupermix10.0μl，銅綠假單胞菌和toxa正反向引物各1.0μl、探針各1.0μl，dna模板4.0μl。其中引物序列如下:
上游引物p.af:tggtagtccacgccgtaaa
下游引物p.ar:cagactgcgatccggactacg
探針p.ap:tcgaccgcctggggagtacg
上游引物toxaf：ggctatgtgttcgtcggcta
下游引物toxar：ttactttaggtcctcgcgcg
探針toxap：ggctacgcccaggaccagga
進(jìn)行pcr擴(kuò)增，按以下步驟進(jìn)行：
(1)94℃預(yù)變性3min；
(2)94℃變性10s，60℃退火1min，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；
(3)98℃酶熱失活10min；
(4)4℃停止反應(yīng)。
實(shí)施例5
本發(fā)明檢測(cè)水中銅綠假單胞菌及toxa基因方法，包括以下步驟：
50ml水樣直接10000rpm立心10分鐘，或者取50ml水樣通過濾膜過濾，用鑷子夾取濾膜在50ml的離心管用2ml超純水沖洗后再10000rpm離心10分鐘，去上清；加入5mlctab提取液，充分混勻。65℃孵育30min，不時(shí)振蕩；后8000r/min室溫離心10min，取1ml上清液入2ml離心管中；加入700μl氯仿后用力振蕩，13000g離心10min，轉(zhuǎn)移上清液600μl到新的2ml離心管中；加入2倍體積的ctab沉淀溶液顛倒數(shù)次后室溫靜置60min，13000×g離心10min，棄去上清，加入350μlnacl溶液將沉淀進(jìn)行懸浮，再加入350μl氯仿，渦旋振蕩進(jìn)行混勻，13000g離心10min，轉(zhuǎn)移上清后加入0.8倍體積的異丙醇用來沉淀核酸，室溫放置20min，13000g離心10min，棄去上清，加入500μl70％乙醇溶液洗滌沉淀，溶解于50μlte溶液中。
其中2×ddpcrsupermix10.0μl，銅綠假單胞菌和toxa正反向引物各0.1μl、探針各0.1μl，dna模板4.0μl。其中引物序列如下:
上游引物p.af:tggtagtccacgccgtaaa
下游引物p.ar:cagactgcgatccggactacg
探針p.ap:tcgaccgcctggggagtacg
上游引物toxaf：ggctatgtgttcgtcggcta
下游引物toxar：ttactttaggtcctcgcgcg
探針toxap：ggctacgcccaggaccagga
進(jìn)行pcr擴(kuò)增，按以下步驟進(jìn)行：
(1)94℃預(yù)變性3min；
(2)94℃變性10s，60℃退火1min，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；
(3)98℃酶熱失活10min；
(4)4℃停止反應(yīng)。
結(jié)果分析
本發(fā)明研制過程中，同時(shí)采用培養(yǎng)基的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，進(jìn)行銅綠假單胞菌數(shù)量測(cè)定的對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，銅綠假單胞菌結(jié)果取平均值。結(jié)果顯示，本發(fā)明采用數(shù)字pcr方法對(duì)水中銅綠假單胞菌的拷貝數(shù)，與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法檢測(cè)出的菌落總數(shù)結(jié)果相關(guān)系數(shù)r2≥99％。另外，本發(fā)明數(shù)字pcr盡歡方法的單樣本全程檢測(cè)時(shí)間為4小時(shí)，遠(yuǎn)短于現(xiàn)有傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)方法，且檢測(cè)銅綠假單胞菌同時(shí)，還能對(duì)其toxa進(jìn)行定量檢測(cè)，能夠準(zhǔn)確評(píng)價(jià)致病菌傳播風(fēng)險(xiǎn)，因此具有良好的技術(shù)優(yōu)勢(shì)和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展前景。
以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征以及本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。
sequencelisting
<110>中山檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
<120>檢測(cè)水中銅綠假單胞菌和toxa的引物、試劑盒和方法
<130>檢測(cè)水中銅綠假單胞菌和toxa的引物、試劑盒和方法
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