本發(fā)明涉及生物基因領(lǐng)域，具體涉及一種內(nèi)切葡聚糖酶基因及其編碼蛋白。

背景技術(shù)：

在纖維素酶系中，內(nèi)切葡聚糖酶(endo-1,4-β-d-glucanohydrolase,ec3.2.1.4)是主要成分，它包含多種同工酶，可以將可溶性纖維素水解成還原性的寡糖。不同來源、不同類型的內(nèi)切葡聚糖酶的分子量、等電點(diǎn)、酶學(xué)特性及分子結(jié)構(gòu)也會有所區(qū)別，在纖維素酶系中，內(nèi)切葡聚糖酶的這種多型性表現(xiàn)是最為明顯的。內(nèi)切葡聚糖酶在增加果汁得率、啤酒過濾及原油開采方面起著重要作用，并能增強(qiáng)纖維素質(zhì)服裝的整體質(zhì)量，如亮度、平滑度等方面。另外，內(nèi)切葡聚糖酶是木質(zhì)纖維素底物粘度快速降低的關(guān)鍵酶。

目前，內(nèi)切葡聚糖酶由于在耐熱和抗凍融等方面存在缺陷，極大地限制了內(nèi)切葡聚糖酶的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種內(nèi)切葡聚糖酶基因及其編碼蛋白，該基因編碼的內(nèi)切葡聚糖酶兼具良好的耐熱性和抗凍融性。

本發(fā)明所提供的內(nèi)切葡聚糖酶基因，其核酸序列如seqidno.1所示。

本發(fā)明還提供了上述內(nèi)切葡聚糖酶基因所編碼的蛋白，其蛋白序列如seqidno.2所示。

本發(fā)明所述內(nèi)切葡聚糖酶基因，是從福建省福州市閩侯縣收集的一份自然環(huán)境的水樣品中，通過宏基因組學(xué)技術(shù)，用試劑盒提取宏基因組dna，并直接對提取好的dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到。

本發(fā)明內(nèi)切葡聚糖酶基因編碼的內(nèi)切葡聚糖酶兼具良好的耐熱性和抗凍融性，擴(kuò)展了其應(yīng)用范圍。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1步驟1中pcr產(chǎn)物的電泳圖譜。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。以下未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照本領(lǐng)域常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件或者制造廠商所建議的條件。

本發(fā)明所述內(nèi)切葡聚糖酶基因的核酸序列如seqidno.1所示。

上述內(nèi)切葡聚糖酶基因的編碼蛋白序列如seqidno.2所示。

本發(fā)明所述內(nèi)切葡聚糖酶基因的來源，是從福建福州閩侯收集的一份自然環(huán)境的水樣品中，通過宏基因組學(xué)技術(shù)，用0.22微米的微孔濾膜，通過過濾，截留其中的各種生物，用試劑盒(mobio牌，dnaisolationkit，14900-50-nf，usa)提取宏基因組dna，并直接對提取好的宏基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到。

實(shí)施例1

通過分子克隆技術(shù)，構(gòu)建內(nèi)切葡聚糖酶基因的蛋白表達(dá)載體

1、對提取好的宏基因組dna做pcr擴(kuò)增(50μl體系)

上游引物序列：atatgctcgaggatcccatgaagcgccgcg

下游引物序列：gttagcagccggatccagcgccgggaacacc

pcr體系如下：

pcr程序設(shè)定如下：94℃預(yù)變性10min；(94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s)，并設(shè)置30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。

pcr產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖1所示，圖1左起第一個(gè)泳道是marker，第二個(gè)泳道是pcr產(chǎn)物，目的條帶位置如圖1所示。

本實(shí)施例所得pcr產(chǎn)物使用sanger法測序(abi3730xl測序儀雙向測序，測序引物為上述“上游引物”和“下游引物”，由廣州英駿生物公司完成)，得到本發(fā)明所述內(nèi)切葡聚糖酶基因的的核酸序列，如seqidno.1所示。

2、膠回收

使用omega公司膠回收試劑盒，貨號d2500-01，對步驟1的pcr產(chǎn)物中的目的條帶，進(jìn)行割膠回收。膠回收的pcr產(chǎn)物(內(nèi)切葡聚糖酶基因)作為后續(xù)infusion連接反應(yīng)的底物，用于連接到表達(dá)載體上。

3、線性化表達(dá)質(zhì)粒的制備

質(zhì)粒載體選擇pet15b，先對載體酶切

在37℃下保溫30min，酶切產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用上述omega試劑盒回收酶切產(chǎn)物條帶。膠回收產(chǎn)物濃度為32ng/μl。以上即為制備好的線性化的質(zhì)粒載體，用于后續(xù)的infusion反應(yīng)。

4、in-fusion連接反應(yīng)

將純化好的pcr產(chǎn)物與質(zhì)粒表達(dá)載體相互連接，構(gòu)建表達(dá)載體。

50℃保溫15min，然后置于冰上。

5、轉(zhuǎn)化

取in-fusion連接反應(yīng)獲得的連接產(chǎn)物10μl，加入到大腸桿菌stbl3感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰浴30min，42℃熱激45s，冰浴2min，涂lb平板(帶有氨芐青霉素抗性)。將平板在37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)16個(gè)小時(shí)，平板上形成單克隆菌落。6、驗(yàn)證單克隆

挑取單克隆菌落10個(gè)(編號1—10)，分別至10個(gè)各有10μl無菌水的ep管中，吹打混勻，各取1μl做模板進(jìn)行菌落pcr，驗(yàn)證目的基因是否連接到質(zhì)粒載體上。

pcr體系：

空質(zhì)粒對照：

pcr程序設(shè)定如下：94℃預(yù)變性10min；(94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min)，并設(shè)置30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。pcr產(chǎn)物電泳檢測，通過目的條帶的有無和大小，判斷目的基因是否成功連接于載體,,

7、測序驗(yàn)證與表達(dá)菌株的構(gòu)建

取有目的條帶的樣品菌，接種到帶有氨芐青霉素抗性的液體lb培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜，菌液送至廣州英駿生物公司進(jìn)行sanger測序驗(yàn)證，使用t7上游和下游通用測序引物進(jìn)行測序，結(jié)果顯示序列正確。然后提取該樣品的質(zhì)粒dna，將質(zhì)粒dna轉(zhuǎn)化到大腸桿菌er2566細(xì)胞(蛋白表達(dá)的宿主菌)內(nèi)，將er2566培養(yǎng)過夜。

實(shí)施例2

蛋白表達(dá)

1、誘導(dǎo)表達(dá)

1)取實(shí)施例1步驟7中過夜培養(yǎng)的菌液300μl，加入到30mllb中，再加氨芐青霉素，37℃，200rpm培養(yǎng)。

2)大約2h后測od值，當(dāng)od值達(dá)到0.5(0.3～0.5)時(shí)，加入iptg，終濃度0.1mm，然后20℃，200rpm培養(yǎng)12h。

2、酶法裂解細(xì)胞(30ml菌液)

1)4000g，10min離心收集菌體，去上清，用高純水洗一次(高純水重懸沉淀再離心去除上清)。

2)每30ml菌液對應(yīng)的沉淀重懸于1.2mlcelllysisbuffer(ph8.5)，buffer需要確保添加有pmsf。

3)加入溶菌酶粉末至終濃度1mg/ml，混勻，冰浴30min。

4)將離心管轉(zhuǎn)移到搖床，旋緊蓋子，傾斜45度放置，230rpm，25℃，震蕩10min。

5)加入tritonx-10012μl(終濃度為1％)，dna酶0.5μl和rna酶1μl(終濃度均為5μg/ml)，置于搖床上，230rpm，25℃，震蕩15min。

6)4℃，12000g離心15min，上清為可溶蛋白組分，沉淀為細(xì)胞碎片和不溶蛋白組分。上清液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

上清液中基因工程重組表達(dá)的內(nèi)切葡聚糖酶，其蛋白序列如seqidno.2所示。

3、活性檢測

用中國人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(ny/t911-2004)的方法進(jìn)行葡聚糖酶的活性測定。實(shí)驗(yàn)測得，該葡聚糖酶的活性為1378u/μl上清液。

1、熱穩(wěn)定性試驗(yàn)

將帶有本發(fā)明內(nèi)切葡聚糖酶基因的pet15b‐內(nèi)切葡聚糖酶‐er2566的裂解上清液于90℃保溫10分鐘后，再次測定內(nèi)切葡聚糖酶活性，發(fā)現(xiàn)其仍然保留有87％的活性，說明本發(fā)明內(nèi)切葡聚糖酶具有良好的熱穩(wěn)定性。

2、抗凍融能力

將帶有本發(fā)明內(nèi)切葡聚糖酶基因的pet15b‐內(nèi)切葡聚糖酶‐er2566的裂解上清液，放入‐86℃超低溫冰箱，冷凍12小時(shí)，取出，并在室溫(25℃)解凍，再次測定內(nèi)切葡聚糖酶活性，發(fā)現(xiàn)其仍然保留有93％的活性，說明本發(fā)明內(nèi)切葡聚糖酶具有良好的抗凍融能力。

實(shí)施例3

對比試驗(yàn)

將genbank編號為kjr61497.1的內(nèi)切葡聚糖酶的基因，人工合成(由通用生物公司合成)全基因dna，按照實(shí)施例1和實(shí)施例2的方法，將該基因克隆到表達(dá)載體，并誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。

1、熱穩(wěn)定性試驗(yàn)

將表達(dá)有目的蛋白的基因工程菌裂解上清液于90℃保溫10分鐘后，測定內(nèi)切葡聚糖酶活性，與未高溫處理的對照組比較，發(fā)現(xiàn)其保留有40％的活性。

2、抗凍融能力

將表達(dá)有目的蛋白的基因工程菌裂解上清液放入‐86℃超低溫冰箱，冷凍12小時(shí)，取出，并在室溫(25℃)解凍，再次測定內(nèi)切葡聚糖酶活性，與未凍融處理的對照組比較，發(fā)現(xiàn)其保留有70％的活性。

由實(shí)施例2及實(shí)施例3的熱穩(wěn)定試驗(yàn)及抗凍融能力測定試驗(yàn)可知，與現(xiàn)有的內(nèi)切葡聚糖酶相比，本發(fā)明內(nèi)切葡聚糖酶基因編碼的內(nèi)切葡聚糖酶兼具良好的耐熱性和抗凍融性，拓寬了該酶的應(yīng)用范圍。

sequencelisting

<110>福州大學(xué)

<120>內(nèi)切葡聚糖酶基因及其編碼蛋白

<130>2017

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>585

<212>dna

<213>未知

<400>1

atgaagcgccgcgacctgctgcgcaccggcggtgccgccgggctggtgctgggactggga60

accgggccgctgcgcgctgccctgcgggccggcgccgggcgtccggccagcctggacggg120

ggggcgtggcgcgcctacgtccagcgcttcgtccaggccgacgggcgggtgaccgacacc180

ggcaacaagggcgtcagccattccgaaggccaggggtacggcatgctgctggcggcggcg240

gcgggcgaccgcgccaccttcgagtccctgtgggcctggacccgccgcacgctgatggtc300

cgcgacgacggcctcgtcgcgtggcgctgggtgccgggggagggggtgaccgaccgcaac360

aacgcctccgacggggatatcctgatcgcgtgggcgcttttgtgcggggccgaggcgtgg420

cgggtggaggaataccgcaccgccgccgtggcggttctccaggctctggccgccgcggtg480

gtggtggagcaggcggatctgaccgtgctgctgcccgggcgcgacggcttccgccgtggc540

gatgcggtggtggtcaatcccagctactgggtgttcccggcgctg585

<210>2

<211>195

<212>prt

<213>未知

<400>2

metlysargargaspleuleuargthrglyglyalaalaglyleuval

151015

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202530

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354045

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505560

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65707580

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859095

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100105110

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115120125

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130135140

tyrargthralaalavalalavalleuglnalaleualaalaalaval

145150155160

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165170175

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195