本發(fā)明涉及生物基因領(lǐng)域，具體涉及一種超氧化物歧化酶基因及其編碼蛋白。

背景技術(shù)：

超氧化物歧化酶orgotein(superoxidedismutase，sod)，別名肝蛋白、簡稱：sod。它是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，廣泛分布于各種生物體內(nèi)，如動物，植物，微生物等。sod具有特殊的生理活性，是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)。sod在生物體內(nèi)的水平高低是衰老與死亡的直觀指標(biāo)?，F(xiàn)已證實(shí)，由氧自由基引發(fā)的疾病多達(dá)60多種。它可對抗與阻斷因氧自由基對細(xì)胞造成的損害，并及時(shí)修復(fù)受損細(xì)胞，復(fù)原因自由基造成的細(xì)胞傷害。由于現(xiàn)代生活壓力，環(huán)境污染，各種輻射和超量運(yùn)動都會造成氧自由基大量形成，因此，生物抗氧化機(jī)制中sod的地位越來越重要。

超氧化物歧化酶按其所含金屬輔基不同可分為三種類型。第一種是含銅、鋅金屬輔基的sod，稱為cu.zn—sod，是最為常見的一種sod酶，呈綠色，主要存在于機(jī)體細(xì)胞漿中；第二種是是含錳金屬輔基的sod，稱為mn—sod，呈紫色，存在于真核細(xì)胞的線粒體和原核細(xì)胞內(nèi)；第三種是含鐵金屬輔基的sod，稱為fe—sod，呈黃褐色，存在于原核細(xì)胞中。

sod具有抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)血脂、抗輻射、美容等功能，在化妝品、食品、醫(yī)藥學(xué)、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域具有重要的用途。但是，現(xiàn)有技術(shù)中的sod由于在耐熱和抗凍融等方面存在缺陷，極大地限制了sod的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種超氧化物歧化酶基因及其編碼蛋白，該基因編碼的超氧化物歧化酶兼具良好的耐熱性和抗凍融性。

本發(fā)明所提供的超氧化物歧化酶基因(簡稱sod基因)，其dna序列如seqidno.1所示。

本發(fā)明還提供了上述超氧化物歧化酶基因所編碼的蛋白，其蛋白序列如seqidno.2所示。

本發(fā)明所述sod基因，是從福建省福州市閩侯縣收集的一份自然環(huán)境的水樣品中，通過宏基因組學(xué)技術(shù)，用試劑盒提取宏基因組dna，并直接對提取好的dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到。

本發(fā)明sod基因編碼的超氧化物歧化酶兼具良好的耐熱性和抗凍融性，能夠廣泛應(yīng)用于化妝品、食品、醫(yī)藥學(xué)、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1步驟1中pcr產(chǎn)物的電泳圖譜；

圖2為實(shí)施例1步驟6的電泳圖譜；上排1～6孔：左起：marker、樣品6～10；下排1～7孔：左起：marker、陰性對照、樣品1～5。

圖3為實(shí)施例2sod活性檢測結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。以下未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照本領(lǐng)域常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件或者制造廠商所建議的條件。

本發(fā)明所述超氧化物歧化酶基因的dna序列如seqidno.1所示。

上述超氧化物歧化酶基因的編碼蛋白序列如seqidno.2所示。

本發(fā)明所述sod基因的來源，是從福建福州閩侯收集的一份自然環(huán)境的水樣品中，通過宏基因組學(xué)技術(shù)，用0.22微米的微孔濾膜，通過過濾，截留其中的各種生物，用試劑盒(mobio牌，powerdnaisolationkit，14900-50-nf，usa)提取宏基因組dna，并直接對提取好的宏基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到。

實(shí)施例1

通過分子克隆技術(shù)，構(gòu)建sod基因的蛋白表達(dá)載體

1、對提取好的宏基因組dna做pcr擴(kuò)增(50μl體系)

pcr體系如下：

sodinfupet15f：gttagcagccggatcctattttatctggttataccgtctctcaacctcc

sodinfupet15r：atatgctcgaggatcccatgaagtttagaagtataatccttgcagggc

pcr程序設(shè)定如下：94℃預(yù)變性10min；(94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s)，并設(shè)置30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。

pcr產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖1所示，圖1左起第一個(gè)泳道是marker，第二個(gè)泳道是pcr產(chǎn)物，目的條帶位置如圖1所示。

本實(shí)施例所得pcr產(chǎn)物使用sanger法測序(abi3730xl測序儀雙向測序，測序引物為上述sodinfupet15f和sodinfupet15r，由廣州英駿生物公司完成)，得到本發(fā)明所述超氧化物歧化酶基因的的dna序列，如seqidno.1所示。

2、膠回收

使用omega公司膠回收試劑盒，貨號d2500-01，對步驟1的pcr產(chǎn)物中的目的條帶進(jìn)行膠回收。膠回收的pcr產(chǎn)物(sod酶基因)作為后續(xù)infusion連接反應(yīng)的底物，用于連接到表達(dá)載體上。

3、線性化表達(dá)質(zhì)粒的制備

質(zhì)粒載體選擇pet15b，先對載體酶切

在37℃下保溫30min，酶切產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用上述omega試劑盒回收酶切產(chǎn)物條帶。膠回收產(chǎn)物濃度為32ng/μl。以上即為制備好的線性化的質(zhì)粒載體，用于后續(xù)的infusion反應(yīng)。

4、in-fusion連接反應(yīng)

將純化好的pcr產(chǎn)物與質(zhì)粒表達(dá)載體相互連接，構(gòu)建表達(dá)載體。

50℃保溫15min，然后置于冰上。

5、轉(zhuǎn)化

取in-fusion連接反應(yīng)獲得的連接產(chǎn)物10μl，加入到大腸桿菌stbl3感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰浴30min，42℃熱激45s，冰浴2min，涂lb平板(帶有氨芐青霉素抗性)。將平板在37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)16個(gè)小時(shí)，平板上形成單克隆菌落。6、驗(yàn)證單克隆

挑取單克隆菌落10個(gè)(編號1—10)，分別至10個(gè)各有10μl無菌水的ep管中，吹打混勻，各取1μl做模板進(jìn)行菌落pcr，驗(yàn)證目的基因是否連接到質(zhì)粒載體上。

pcr體系：

空質(zhì)粒對照：

pcr程序設(shè)定如下：94℃預(yù)變性10min；(94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min)，并設(shè)置30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。pcr產(chǎn)物電泳檢測，通過目的條帶的有無和大小，判斷目的基因是否成功連接于載體,,電泳結(jié)果如圖2所示。

7、測序驗(yàn)證與表達(dá)菌株的構(gòu)建

取圖2中的5號樣品菌，接種到帶有氨芐青霉素抗性的液體lb培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜，菌液送至廣州英駿生物公司進(jìn)行sanger測序驗(yàn)證，使用t7上游和下游通用測序引物進(jìn)行測序，結(jié)果顯示序列正確。然后提取該樣品的質(zhì)粒dna，將質(zhì)粒dna轉(zhuǎn)化到大腸桿菌er2566細(xì)胞(蛋白表達(dá)的宿主菌)內(nèi)，將er2566培養(yǎng)過夜。

實(shí)施例2

蛋白表達(dá)

1、誘導(dǎo)表達(dá)

1)取實(shí)施例1步驟7中過夜培養(yǎng)的菌液300μl，加入到30mllb中，再加氨芐青霉素，37℃，200rpm培養(yǎng)。

2)大約2h后測od值，當(dāng)od值達(dá)到0.5(0.3～0.5)時(shí)，加入iptg，終濃度0.1mm，然后20℃，200rpm培養(yǎng)12h。

2、酶法裂解細(xì)胞(30ml菌液)

1)4000g，10min離心收集菌體，去上清，用高純水洗一次(高純水重懸沉淀再離心去除上清)。

2)每30ml菌液對應(yīng)的沉淀重懸于1.2mlcelllysisbuffer(ph8.5)，buffer需要確保添加有pmsf。

3)加入溶菌酶粉末至終濃度1mg/ml，混勻，冰浴30min。

4)將離心管轉(zhuǎn)移到搖床，旋緊蓋子，傾斜45度放置，230rpm，25℃，震蕩10min。

5)加入tritonx-10012μl(終濃度為1％)，dna酶0.5μl和rna酶1μl(終濃度均為5μg/ml)，置于搖床上，230rpm，25℃，震蕩15min。

6)4℃，12000g離心15min，上清為可溶蛋白組分，沉淀為細(xì)胞碎片和不溶蛋白組分。上清液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

上清液中基因工程重組表達(dá)的sod，其蛋白序列如seqidno.2所示。

3、活性檢測

從碧云天公司采購sod活性檢測試劑盒(wst-8法)，直接對上清液進(jìn)行sod活性的檢測。

檢測結(jié)果如圖3所示：

帶有本發(fā)明sod基因的pet15b-sod-er2566，其裂解上清液中的sod酶活性達(dá)到15個(gè)units以上。而不帶有本發(fā)明sod基因的pet15b-er2566(陰性對照)，其裂解上清液中sod酶活性小于2.5個(gè)units。

1、熱穩(wěn)定性試驗(yàn)

將帶有本發(fā)明sod基因的pet15b‐sod‐er2566的裂解上清液于80℃保溫10分鐘后，再次測定sod酶活性，發(fā)現(xiàn)其仍然保留有90％的活性，說明本發(fā)明sod酶具有良好的熱穩(wěn)定性。

2、抗凍融能力

將帶有本發(fā)明sod基因的pet15b‐sod‐er2566的裂解上清液，放入‐86℃超低溫冰箱，冷凍12小時(shí)，取出，并在室溫(25℃)解凍，再次測定sod酶活性，發(fā)現(xiàn)其仍然保留有95％的活性，說明本發(fā)明sod酶具有良好的抗凍融能力。

實(shí)施例3

對比試驗(yàn)

將genbank編號為sdl36756.1的sod酶的基因，人工合成(由通用生物公司合成)全基因dna，按照實(shí)施例1和實(shí)施例2的方法，將該基因克隆到表達(dá)載體，并誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。

1、熱穩(wěn)定性試驗(yàn)

將表達(dá)有目的蛋白的基因工程菌裂解上清液于80℃保溫10分鐘后，測定sod酶活性，與未高溫處理的對照組比較，發(fā)現(xiàn)其保留有60％的活性。

2、抗凍融能力

將表達(dá)有目的蛋白的基因工程菌裂解上清液放入‐86℃超低溫冰箱，冷凍12小時(shí)，取出，并在室溫(25℃)解凍，再次測定sod酶活性，與未凍融處理的對照組比較，發(fā)現(xiàn)其保留有75％的活性。

由實(shí)施例2及實(shí)施例3的熱穩(wěn)定試驗(yàn)及抗凍融能力測定試驗(yàn)可知，與現(xiàn)有的sod酶相比，本發(fā)明sod基因編碼的超氧化物歧化酶兼具良好的耐熱性和抗凍融性，拓寬了其在化妝品、食品、醫(yī)藥學(xué)、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域的應(yīng)用。

sequencelisting

<110>福州大學(xué)

<120>超氧化物歧化酶基因及其編碼蛋白

<130>2017

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>741

<212>dna

<213>未知

<400>1

atgggcagcagccatcatcatcatcatcacagcagcggcctggtgccgcgcggcagccat60

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<213>未知

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