本發(fā)明屬于生物化學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，涉及一種細(xì)胞穿膜肽引導(dǎo)的熒光素酶構(gòu)建及其在細(xì)胞內(nèi)atp檢測(cè)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

熒光素酶是靈敏、可靠的用于測(cè)定atp的生物傳感器，利用克隆的熒光素酶為探針對(duì)細(xì)胞內(nèi)atp濃度進(jìn)行定量，廣泛用于細(xì)胞活性檢測(cè)、細(xì)胞毒性篩選和細(xì)胞增殖研究中。熒光素(d-luciferin)作為螢火蟲(chóng)熒光素酶(luciferase)的底物，存在于多種發(fā)光生物中。在熒光素酶的催化和氧氣、atp、ca²⁺/mg²⁺的作用下，熒光素被氧化并釋放黃綠色的光(562nm)。atp普遍存在于包括微生物在內(nèi)的一切活細(xì)胞內(nèi)，又為熒光素酶直接作用的底物，在有氧條件下參與熒光素酶催化熒光素釋放熒光的過(guò)程，并且釋放的熒光強(qiáng)度與胞內(nèi)atp含量呈正相關(guān)。細(xì)胞死亡后，細(xì)胞內(nèi)atp迅速水解，而活細(xì)胞的atp含量基本固定，因此所測(cè)得的熒光強(qiáng)度反應(yīng)能夠反應(yīng)出活細(xì)胞的數(shù)量。對(duì)于細(xì)胞內(nèi)的atp檢測(cè)，細(xì)胞裂解后atp的提取過(guò)程不可避免，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)atp測(cè)量不準(zhǔn)確，并不利于高通量的藥物篩選。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于：克服現(xiàn)有常規(guī)的atp檢測(cè)方法需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解，無(wú)法反映細(xì)胞的真實(shí)狀態(tài)且存在操作復(fù)雜、準(zhǔn)確性較差等問(wèn)題，提供一種靈敏度高、操作簡(jiǎn)便快捷cpp-luc嵌合蛋白及其在細(xì)胞內(nèi)atp檢測(cè)中的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種cpp-luc載體，其包含穿膜肽基因和熒光素酶基因，由共同的啟動(dòng)子單獨(dú)表達(dá)或同時(shí)控制表達(dá)。

作為本發(fā)明cpp-luc載體的一種改進(jìn)，所述穿膜肽基因?yàn)閠at、vp-22、antp、transportan、pep-1、mpg、map、kala、pptg20、hct(9-32)或arg9。

作為本發(fā)明cpp-luc載體的一種改進(jìn)，所述熒光素酶為紅色螢火蟲(chóng)熒光素酶、綠色螢火蟲(chóng)熒光素酶或水母熒光素酶。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明還提供一種由穿膜肽和熒光素酶組成的cpp-luc嵌合蛋白，由所述cpp-luc載體原核表達(dá)得到。細(xì)胞穿膜肽(cellpenetratingpeptides，cpps)特指那些小于20個(gè)氨基酸、帶正電荷的短肽，可以穿過(guò)大多數(shù)細(xì)胞膜。它們可以將多種生物活性物質(zhì)攜帶入細(xì)胞中而無(wú)需特殊的培養(yǎng)環(huán)境，包括小分子化合物、染料、多肽、蛋白質(zhì)、質(zhì)粒、脂質(zhì)體、病毒等。

本發(fā)明cpp-luc嵌合蛋白可用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)atp，檢測(cè)方法包括如下步驟：

將cpp-luc嵌合蛋白加入含有血清的細(xì)胞培養(yǎng)板中孵育，然后去掉上清，加入熒光素酶底物進(jìn)行反應(yīng)，檢測(cè)熒光，即可測(cè)得細(xì)胞內(nèi)atp的含量。

作為本發(fā)明檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)atp的方法的一種改進(jìn)，所述孵育的溫度為37攝氏度，孵育時(shí)間為5min～1h。

作為本發(fā)明檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)atp的方法的一種改進(jìn)，所述反應(yīng)的時(shí)間為5min～1h。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明還提供一種細(xì)胞atp檢測(cè)試劑盒，其包括cpp-luc嵌合蛋白和熒光素酶底物。

作為本發(fā)明細(xì)胞atp檢測(cè)試劑盒的一種改進(jìn)，所述檢測(cè)試劑盒還包括atp標(biāo)準(zhǔn)品。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明cpp-luc嵌合蛋白利用穿膜肽能引導(dǎo)熒光素酶進(jìn)入活細(xì)胞，在底物和atp存在下由atp驅(qū)動(dòng)發(fā)光，且熒光強(qiáng)度和atp的量成正比這一機(jī)制，將cpp-luc嵌合蛋白用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)atp，可免去atp檢測(cè)所需的細(xì)胞裂解等步驟，降低操作引起的誤差，還能實(shí)現(xiàn)常規(guī)atp檢測(cè)所不能進(jìn)行的活體檢測(cè)和實(shí)時(shí)檢測(cè)(成像)。本發(fā)明cpp-luc嵌合蛋白用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)atp時(shí)，具有操作簡(jiǎn)便、特異性好、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，還可將其制成atp檢測(cè)試劑盒，具有良好的應(yīng)用前景和巨大的市場(chǎng)價(jià)值。

附圖說(shuō)明

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明及有益效果進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

圖1為實(shí)施例1的質(zhì)粒圖譜。

圖2為實(shí)施例2的tat-lucsds-page分析；其中，a:37℃誘導(dǎo)4h，1:未誘導(dǎo)全菌液；2:未誘導(dǎo)上清；3:未誘導(dǎo)沉淀；4:誘導(dǎo)全菌液；5:誘導(dǎo)上清；6:誘導(dǎo)沉淀；m:marker；b:22℃誘導(dǎo)16h，1:未誘導(dǎo)全菌液；2:未誘導(dǎo)上清；3:未誘導(dǎo)沉淀；4:誘導(dǎo)全菌液；5:誘導(dǎo)上清；3:誘導(dǎo)沉淀；m:marker。

圖3為實(shí)施例2的細(xì)胞檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的發(fā)明目的、技術(shù)方案和有益技術(shù)效果更加清晰，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解的是，本說(shuō)明書(shū)中描述的實(shí)施例僅僅是為了解釋本發(fā)明，并非為了限定本發(fā)明，實(shí)施例的配方、比例等可因地制宜做出選擇而對(duì)結(jié)果并無(wú)實(shí)質(zhì)性影響。

實(shí)施例1tat-螢火蟲(chóng)熒光素酶重組蛋質(zhì)粒構(gòu)建

1、tat+luc序列如seqidno:1所示，其中，序列前30個(gè)堿基是tat標(biāo)簽。

2、通過(guò)含有tat序列的引物擴(kuò)增luc產(chǎn)生tat-luc基因序列

引物tat+lucbamhif序列如seqidno:2所示，引物tat+lucxhoir如seqidno:3所示。

3、pcr釣取基因

①pcr反應(yīng)體系

在0.2mlep管中配制以下體系，模板取含有l(wèi)uc的質(zhì)粒稀釋后取0.5μl擴(kuò)增tat+luc：

注：kodplusneodnapolymerase購(gòu)于toyobo公司，貨號(hào):kod401。

②擴(kuò)增條件

混勻后，置于geneamppcrsystem2400型pcr擴(kuò)增儀擴(kuò)增。

tat+luc基因的擴(kuò)增條件：

③pcr產(chǎn)物回收

1)pcr產(chǎn)物經(jīng)1％凝膠電泳后，在紫外燈下，用手術(shù)刀切取含目的基因片段的凝膠條帶至干凈1.5mlep管中，稱重后，按100mg凝膠對(duì)應(yīng)100μl溶液bd的比例向離心管中加入溶液bd。

2)60℃水浴10min至凝膠完全溶化，水浴期間振蕩混合3次。

3)將溶液轉(zhuǎn)移至dna純化柱中，靜置2min，室溫12000rpm離心1min，棄濾液。

4)向柱上加入500μl溶液pe，室溫12000rpm離心1min，棄濾液。

5)重復(fù)上一操作一次。

6)室溫空柱12000rpm離心1min以徹底去除純化柱中殘留的液體。

7)將柱子置于新的1.5mlep管上，向柱中央加入30μl60℃預(yù)熱的無(wú)菌水，13400g離心1min以洗脫出dna。

④pcr回收產(chǎn)物及載體雙酶切：在2個(gè)無(wú)菌的0.2mlep反應(yīng)管，分別取tat+lucpcr回收產(chǎn)物15μl和pet-28a載體各15μl，用bamhi與xhoi雙酶切，酶切體系如下：

混勻后，37℃反應(yīng)3h。

4、酶切產(chǎn)物回收(dna凝膠回收試劑盒，dongshengbiotech)

①酶切產(chǎn)物經(jīng)1％凝膠電泳后，在紫外燈下，用手術(shù)刀分別切取含目的片段和載體的凝膠條帶至干凈的1.5mlep管中，按100mg凝膠對(duì)應(yīng)100μl溶液bd的比例向離心管中加入溶液bd。

②60℃水浴10min至凝膠完全溶化，水浴期間振蕩混合3次。

③將溶液轉(zhuǎn)移至dna純化柱中，靜置2min，室溫12000rpm離心1min，棄濾液。

④向柱上加入500μl溶液pe，室溫12000rpm離心1min，棄濾液。

⑤重復(fù)上一操作一次。

⑥空柱12000rpm離心1min以徹底去除純化柱中殘留的液體。

⑦將柱子置于新的1.5mlep管上，向柱中央加入30μl60℃預(yù)熱的無(wú)菌水，13400g離心1min以洗脫出dna。

5、目段片段與載體連接

向0.2mlep管中加入以下試劑(t4dnaligase酶購(gòu)于takara公司，貨號(hào)：d2011a；)

16℃連接1h。

6、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化

①冰浴中將5μl連接產(chǎn)物分別加入至50μldh5α感受態(tài)組織中。輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，冰浴30min。

②42℃水浴熱休克90s。

③快速將管轉(zhuǎn)移至冰浴中，冰浴2min。

④分別加入200μllb培養(yǎng)基，混勻，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)1h。

⑤于超凈工作臺(tái)中，將菌液均勻涂布于含卡那(kan)(100μg/ml)的lb平板上，室溫下放置，至液體吸收。

⑥倒置平板，轉(zhuǎn)移入37℃生化培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。

7、質(zhì)粒酶切鑒定陽(yáng)性克隆

①?gòu)钠桨迳咸羧∪舾蓚€(gè)單克隆于3mllb管中搖床過(guò)夜培養(yǎng)；

②質(zhì)粒提取，(高純質(zhì)粒小量提取試劑盒，g-shun)

1)用1.5mlep管收集3μl菌液，12000rpm離心1min，去上清。

2)加入250μl溶液i/rnasea混合液，重懸菌體。

3)加入250μl溶液ii，溫和反復(fù)顛倒混勻6次，室溫放置2min。

4)加入350μl溶液iii，溫和反復(fù)顛倒混勻6次。

5)12000rpm離心10min，小心吸去上清至dna純化柱中，靜置2min。

6)12000rpm離心1min，棄濾液。

7)加入500μl溶液pb至柱中，12000rpm離心1min，棄濾液。

8)加入500μl溶液w至柱中，12000rpm離心1min，棄濾液。重復(fù)一次。

9)空柱12000rpm離心3min。

10)將柱取出置于新的1.5mlep管中，加入50μl無(wú)菌水(60℃預(yù)熱)，靜置2min，13400rpm離心1min以洗脫出質(zhì)粒(圖1)。

8、酶切鑒定所提取質(zhì)粒

酶切反應(yīng)體系如下：

37℃酶切2h。

本實(shí)施例所得tat+luc質(zhì)粒送至上海生工基因公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如seqidno:4所示。

實(shí)施例2重組蛋白表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)atp檢測(cè)

1.轉(zhuǎn)接50μl過(guò)夜培養(yǎng)的菌液至含50μg/ml卡那霉素的5mllb液體培養(yǎng)液中，37℃下210rpm/min培養(yǎng)至od600約為0.6時(shí)，加入終濃度為0.5mm的iptg誘導(dǎo)表達(dá)，在37℃下繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。其后10000rpm，4℃離心10min收集菌體，將收集到的菌體沉淀用pbs重懸后進(jìn)行超聲破碎，工作3s，間歇5s，功率300w，循環(huán)90次。10000rpm,4℃離心20min，收集上清樣品，將沉淀用適量pbs重懸。取適量的全菌液、上清和沉淀樣品進(jìn)行sds-page凝膠電泳(圖2)。

2.為了檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)atp含量，將a549細(xì)胞倍比稀釋在黑壁96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中至每孔0至50000個(gè)。然后在100μl細(xì)胞培養(yǎng)基中加入1μl的tat-luc3.1mg/ml孵育2分鐘。其后棄去上清，向每個(gè)孔中加入d-螢火蟲(chóng)熒光素鈉鹽至最終濃度為150μg/ml(培養(yǎng)基稀釋)，馬上用96微孔板發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度反應(yīng)熒光素酶的酶活性(圖3)。

根據(jù)上述說(shuō)明書(shū)的揭示和教導(dǎo)，本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員還可以對(duì)上述實(shí)施方式進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兏托薷?。因此，本發(fā)明并不局限于上面揭示和描述的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的一些修改和變更也應(yīng)當(dāng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。此外，盡管本說(shuō)明書(shū)中使用了一些特定的術(shù)語(yǔ)，但這些術(shù)語(yǔ)只是為了方便說(shuō)明，并不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成任何限制。

序列表

seqidno:1tat+luc的dna序列

atgaggaagaagcggagacagcgacgaagagaagacgccaaaaacataaagaaaggcccggcgccattctatccgctggaagatggaaccgctggagagcaactgcataaggctatgaagagatacgccctggttcctggaacaattgcttttacagatgcacatatcgaggtggacatcacttacgctgagtacttcgaaatgtccgttcggttggcagaagctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacagaatcgtcgtatgcagtgaaaactctcttcaattctttatgccggtgttgggcgcgttatttatcggagttgcagttgcgcccgcgaacgacatttataatgaacgtgaattgctcaacagtatgggcatttcgcagcctaccgtggtgttcgtttccaaaaaggggttgcaaaaaattttgaacgtgcaaaaaaagctcccaatcatccaaaaaattattatcatggattctaaaacggattaccagggatttcagtcgatgtacacgttcgtcacatctcatctacctcccggttttaatgaatacgattttgtgccagagtccttcgatagggacaagacaattgcactgatcatgaactcctctggatctactggtctgcctaaaggtgtcgctctgcctcatagaactgcctgcgtgagattctcgcatgccagagatcctatttttggcaatcaaatcattccggatactgcgattttaagtgttgttccattccatcacggttttggaatgtttactacactcggatatttgatatgtggatttcgagtcgtcttaatgtatagatttgaagaagagctgtttctgaggagccttcaggattacaagattcaaagtgcgctgctggtgccaaccctattctccttcttcgccaaaagcactctgattgacaaatacgatttatctaatttacacgaaattgcttctggtggcgctcccctctctaaggaagtcggggaagcggttgccaagaggttccatctgccaggtatcaggcaaggatatgggctcactgagactacatcagctattctgattacacccgagggggatgataaaccgggcgcggtcggtaaagttgttccattttttgaagcgaaggttgtggatctggataccgggaaaacgctgggcgttaatcaaagaggcgaactgtgtgtgagaggtcctatgattatgtccggttatgtaaacaatccggaagcgaccaacgccttgattgacaaggatggatggctacattctggagacatagcttactgggacgaagacgaacacttcttcatcgttgaccgcctgaagtctctgattaagtacaaaggctatcaggtggctcccgctgaattggaatccatcttgctccaacaccccaacatcttcgacgcaggtgtcgcaggtcttcccgacgatgacgccggtgaacttcccgccgccgttgttgttttggagcacggaaagacgatgacggaaaaagagatcgtggattacgtcgccagtcaagtaacaaccgcgaaaaagttgcgcggaggagttgtgtttgtggacgaagtaccgaaaggtcttaccggaaaactcgacgcaagaaaaatcagagagatcctcataaaggccaagaagggcggaaagatcgccgtg

seqidno:2tat+lucbamhif人工序列

cgcggatccatgaggaagaagcggagacagcgacgaagagaagacgccaaaaacataaa

seqidno:3tat+lucxhoir人工序列

ccgctcgagcacggcgatctttccgcccttcttggc

seqidno:4tat+luc質(zhì)粒

ggggaggggaaccatttccccctctagaataattttgtttaactttaagaaggagatataccatgggcagcagccatcatcatcatcatcacagcagcggcctggtgccgcgcggcagccatatggctagcatgactggtggacagcaaatgggtcgcggatccatgaggaagaagcggagacagcgacgaagagaagacgccaaaaacataaagaaaggcccggcgccattctatccgctggaagatggaaccgctggagagcaactgcataaggctatgaagagatacgccctggttcctggaacaattgcttttacagatgcacatatcgaggtggacatcacttacgctgagtacttcgaaatgtccgttcggttggcagaagctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacagaatcgtcgtatgcagtgaaaactctcttcaattctttatgccggtgttgggcgcgttatttatcggagttgcagttgcgcccgcgaacgacatttataatgaacgtgaattgctcaacagtatgggcatttcgcagcctaccgtggtgttcgtttccaaaaaggggttgcaaaaaattttgaacgtgcaaaaaaagctcccaatcatccaaaaaattattatcatggattctaaaacggattaccagggatttcagtcgatgtacacgttcgtcacatctcatctacctcccggttttaatgaatacgattttgtgccagagtccttcgatagggacaagacaattgcactgatcatgaactcctctggatctactggtctgcctaaaggtgtcgctctgcctcatagaactgcctgcgtgagattctcgcatgccagagatcctatttttggcaatcaaatcattccggatactgcgattttaagtgttgttccattccatcacggttttggaatgtttactacactcggatatttgatatgtggatttcgagtcgtcttaatgtatagatttgaaga