本發(fā)明涉及分子基因分型領(lǐng)域，具體而言，涉及一種用于鹿科動物親子鑒定的引物、試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
微衛(wèi)星是基因組中的一種短串聯(lián)重復序列(2-6bp)，由于重復數(shù)不同表現(xiàn)出不同的等位基因。與其他鑒定方法相比，用微衛(wèi)星標記進行親子鑒定有很多不可比擬的優(yōu)點。其中，最顯著的優(yōu)點是他的共顯性遺傳特征，這就使得純合子和雜合子基因型可以被區(qū)分出來，極大地增加了親子鑒定的準確性。另外，微衛(wèi)星標記具有較高的多態(tài)性，也就是說同一個位點上有多個等位基因，由于非親子關(guān)系的個體不太可能會共享同一個等位基因，所以使用少數(shù)高多態(tài)性微衛(wèi)星標記就可以鑒別大量個體的親子關(guān)系。最后，因為微衛(wèi)星分析使用的是聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)，所以鑒別時只需要少量的dna，并且高度降解的dna也可以使用，如糞便、頭發(fā)、羽毛和皮膚中提取的dna。
梅花鹿(cervusnippon)主要分布于東亞，范圍從西伯利亞到韓國、中國東部和越南；在日本等西太平洋島嶼也有分布。中國的梅花鹿主要分布在吉林省，而日本的梅花鹿主要分布于北海道。19世紀梅花鹿曾經(jīng)被獵到幾乎絕種，20世紀中開始立法保護，族群在1950年代到1980年代快速恢復。梅花鹿也被引進到澳大利亞、歐洲和美國。原先的目的是作為公園裝飾用的動物，但現(xiàn)在許多變成野生。目前，分布于中國和日本的梅花鹿亞種已經(jīng)被iucn紅色名錄列為極?；驗l危等級，我國的梅花鹿同時也是國家一級保護動物。
目前在人類的其他家畜的親子鑒定研究中，應(yīng)用最多的是微衛(wèi)星分子標記技術(shù)，但是由于物種之間其基因組不同所以導致用于其親子鑒定的微衛(wèi)星分子標記的引物也不同。目前國內(nèi)還沒有準確的鹿親子鑒定方法，由于牛的親緣關(guān)系和鹿很相近，有的動物園采用牛的微衛(wèi)星標記用于鹿上，但其無效基因位點很多，鑒別效率不高。之前有研究利用7個牛的微衛(wèi)星位點對27只動物園的豚鹿進行了親子鑒定，這7個微衛(wèi)星的非父排除率為83.6％，表現(xiàn)出較低的多態(tài)性。研究證明只有56％的牛微衛(wèi)星引物可應(yīng)用于羊，其中只有42％的微衛(wèi)星位點在羊上表現(xiàn)出多態(tài)性，鑒定效果較差。
有鑒于此，特提出本發(fā)明。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了一套用于鹿科動物親子鑒定的微衛(wèi)星引物，這套引物共有10對，其累計非父排除率高達99.99％，可應(yīng)用于鹿的親子鑒定實踐中。
本發(fā)明涉及一種用于鹿科動物親子鑒定的引物，選自下列的至少一個引物對：
seqidno:1和2、seqidno:3和4、seqidno:5和6、seqidno:7和8、seqidno:9和10、seqidno:11和12、seqidno:13和14、seqidno:15和16、seqidno:17和18以及seqidno:19和20。
優(yōu)選的，本發(fā)明所提供的用于鹿科動物親子鑒定的引物，選自下列引物對任2對、3對、4對、5對、6對、7對、8對、9對或全部。
本發(fā)明所使用的微衛(wèi)星標記全部來源于鹿，是通過簡化基因組測序得到的原始數(shù)據(jù)，之后經(jīng)過嚴格篩選得到高多態(tài)性微衛(wèi)星標記，再經(jīng)過反復在實踐中應(yīng)用，篩選得到的10個穩(wěn)定的準確性高、多態(tài)性高的微衛(wèi)星標記。
優(yōu)選的，如上所述的用于鹿科動物親子鑒定的引物，每對引物的上游引物的5’端被熒光染料標記。
優(yōu)選的，如上所述的用于鹿科動物親子鑒定的引物，所述熒光染料選自選自fam、fitc、hex、vic、joe、tamra、tet、rox、cy3、cy5、texas-red、pet、ned、alexafluor、dylight和ftm中的一種或多種。
本發(fā)明還涉及一種鹿科動物親子鑒定試劑盒，其包括如上所述的用于鹿科動物親子鑒定的引物；
所述試劑盒優(yōu)選還包括pcr反應(yīng)緩沖液、dna聚合酶、dntp以及水中的一種或多種。
優(yōu)選的，如上所述的鹿科動物親子鑒定試劑盒，所述dna聚合酶選自taq、bst、vent、phi29、pfu、tru、tth、tl1、tac、tne、tma、tih、tf1、pwo、kod、sac、sso、poc、pab、mth、pho、es4dna聚合酶以及klenow片段中的任一種；
在一些實施方式中，所述dna聚合酶為taqdna聚合酶；
更優(yōu)選為熱啟動taqdna聚合酶。
優(yōu)選的，如上所述的鹿科動物親子鑒定試劑盒，所述水選自雙蒸水或去離子水。
本發(fā)明還涉及一種鹿科動物親子鑒定方法，包括：
提取待檢測鹿科動物樣品的dna并使用如上所述的鹿科動物親子鑒定的引物對其進行擴增；
檢測擴增產(chǎn)物大小，并用軟件進行親子推斷。
優(yōu)選的，如上所述的鹿科動物親子鑒定方法，用所述的鹿科動物親子鑒定的引物對進行擴增時，各引物對的退火溫度均為58℃～62℃；更優(yōu)選為59℃～61℃，最優(yōu)選60℃。
優(yōu)選的，如上所述的鹿科動物親子鑒定方法，所述待檢測鹿科動物樣品包括所述待檢測鹿科動物的血液、唾液、精液、骨骼或毛發(fā)。
優(yōu)選的，如上所述的鹿科動物親子鑒定方法，所述鹿科動物樣品的dna的提取方法包括飽和苯酚-氯仿法、樹脂提取法或磁珠提取法提取。
優(yōu)選的，如上所述的鹿科動物親子鑒定方法，其中提取待檢測鹿科動物樣品的dna并使用如上所述的鹿科動物親子鑒定的引物對其進行擴增時，所用引物至少為2對以上；
更優(yōu)選的，所用引物為3、4、5、6、7、8、9或10對。
優(yōu)選的，如上所述的鹿科動物親子鑒定方法，使用全部10對引物對進行親子鑒定；
在擴增完成后，檢測擴增產(chǎn)物大小時，按如下引物對的擴增產(chǎn)物進行分組：
第一組：seqidno:1和2、seqidno:3和4；
第二組：seqidno:5和6、seqidno:7和8；
第三組：seqidno:9和10、seqidno:11和12；
第四組：seqidno:13和14、seqidno:15和16；
第五組：seqidno:17和18；
第六組：seqidno:19和20；
優(yōu)選的，同一組內(nèi)的引物對所帶有的熒光染料標記顏色不同；
使用如上所述的分組方法進行擴增，根據(jù)擴增產(chǎn)物的大小進行分組，可使得擴增進行的更為經(jīng)濟簡便。
優(yōu)選的，在上述的鹿科動物親子鑒定的引物、鹿科動物親子鑒定試劑盒以及鹿科動物親子鑒定方法中，所述鹿科動物包括鹿亞科、麂亞科、獐亞科和美洲鹿亞科動物；
更優(yōu)選的，所述鹿科動物包括花鹿屬、鹿屬、黇鹿屬和麋鹿屬動物；
更優(yōu)選的，所述鹿科動物包括馬鹿、白唇鹿、坡鹿、阿氏鹿、菲律賓黑麂、宿氏鹿、鬣鹿、沼鹿、水鹿以及梅花鹿。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
本發(fā)明提供的引物對能在鹿科動物的樣本中擴增出的條帶清晰、多態(tài)性高的微衛(wèi)星dna條帶，且累計非父排除率高達99.99％，鑒定方法簡便，鑒定結(jié)果可靠。
具體實施方式
下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
實施例
1.引物合成
合成用于鹿親子鑒定的10對微衛(wèi)星引物，引物5’端帶不同熒光標記(fam，hex，tamra)。具體的信息如下表：
表1用于鹿親子鑒定的10對微衛(wèi)星引物及其分組
2.對待檢測的梅花鹿進行基因組提取
取梅花鹿血液300ul，用biotake血液提取試劑盒提取梅花鹿基因組，用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測dna的完整性，酶標儀測定dna濃度和純度，-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>
3.以待檢測的梅花鹿基因組為模板，用pcr方法擴增上述10個微衛(wèi)星位點。
pcr擴增體系和條件見表2和表3。
表2pcr反應(yīng)體系
表格3pcr反應(yīng)程序
4.毛細管電泳的方法檢測pcr產(chǎn)物的大小。
pcr產(chǎn)物采用abi3730遺傳分析儀進行大小的檢測，然后用genescan和genotyper(abi)軟件進行基因分型。
5.基因分型結(jié)果采用cervus3.0軟件進行多態(tài)性和親子關(guān)系的分析。
(2)技術(shù)效果
我們用來自4個家系的16個梅花鹿個體驗證了本發(fā)明的10個微衛(wèi)星的親子鑒定效果。結(jié)果中，所有的子代均與其親生父本相匹配(f1的子代是z2，z3，z4；f5的子代是z6，z7，z8；f9的子代是z10，z11，z12；f13的子代是z14，z15，z16)。lod若是正數(shù)則可確信為成功匹配，且數(shù)值越大越可信，若是負數(shù)則說明匹配不可信，如表4中f1和f5無親緣關(guān)系的匹配lod值是負數(shù)，其他正確匹配的lod都是正數(shù)：
表4親子鑒定個體驗證結(jié)果
表510個微衛(wèi)星值的非父排除率和其他參數(shù)值
locus：位點的名稱；k:等位基因數(shù)；n:位點的基因型數(shù)；hobs:觀測雜合度；pic:多態(tài)信息含量；pe1:只有一個候選親本時的單個位點非父排除率；pe2:：已知一個親本，推測另一個親本時的單個位點非父排除率；pe3:推測一對父母時的單個位點非父排除率；i:兩個無關(guān)個體間的單個位點個體識別率；si:兩個有親緣關(guān)系個體間的單個位點個體識別率；cpe1:只有一個候選親本時的累計非父排除率；cpe2：已知一個親本，推測另一個親本時的累計非父排除率；cpe3:推測一對父母時的累計非父排除率；ci:兩個無關(guān)個體間的累計個體識別率；csi:兩個有親緣關(guān)系個體間的累計個體識別率.
其累計非父排除率為：
在雙方父母都未知的情況下為95.45％
在一方父母已知的情況下為99.66％
在雙方父母已知的情況下為99.99％
最后應(yīng)說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的范圍。
sequencelisting
<110>中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所
<120>用于鹿科動物親子鑒定的引物、試劑盒及方法
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