本發(fā)明屬于殼聚糖酶技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種枯草芽孢桿菌殼聚糖酶及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

殼聚糖酶(chitosanases，ec.3.2.1.132)廣泛存在于古菌、細(xì)菌及真核生物中，在糖苷水解酶(glycosidehydrolases，gh)家族3、5、7、8、46、75及80中均有分布，其中，家族46、75及80中僅包含殼聚糖酶。在工業(yè)上，由于缺乏經(jīng)濟(jì)高效的特異性殼聚糖酶，往往使用蛋白酶及纖維素酶等非特異性商品酶類水解殼聚糖以制備殼寡糖。由于具有殼聚糖酶水解活性的酶類在這些商品酶中所占比例極低，用酶量較大，殼寡糖的生產(chǎn)成本也相應(yīng)增加。因此，迫切需要研發(fā)出一系列經(jīng)濟(jì)高效的殼聚糖酶以滿足工業(yè)殼寡糖生產(chǎn)的需求。

本發(fā)明研發(fā)人員前期在多種食品級商品酶中篩選具有殼聚糖水解酶活性的酶制劑時(shí)發(fā)現(xiàn)，使用枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)的淀粉酶及中性蛋白酶均具有較好的殼聚糖水解活性(1g粗酶干粉約可徹底水解30g殼聚糖)，提示這些商品酶的來源菌株枯草芽孢桿菌中具有殼聚糖酶編碼基因。我們通過基因組檢索發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌中存在殼聚糖酶的編碼基因。為獲得更安全高效的殼聚糖酶，我們對該基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化并在畢赤酵母中進(jìn)行分泌表達(dá)。表達(dá)的殼聚糖酶能夠替代現(xiàn)有的商品酶用于殼寡糖的規(guī)模生產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是，提供一種枯草芽孢桿菌殼聚糖酶及其制備方法和應(yīng)用；旨在提供一種經(jīng)濟(jì)高效的特異性殼聚糖酶。

本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明通過對枯草芽孢桿菌殼聚糖酶編碼基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，以利于其在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)，從而高效快速的獲得水解活性高的枯草芽孢桿菌殼聚糖酶。

本發(fā)明提供的一種枯草芽孢桿菌殼聚糖酶，其氨基酸序列如seqidno.1所示。所述枯草芽孢桿菌殼聚糖酶的編碼基因，其核苷酸序列如seqidno.2所示。

本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌殼聚糖酶的制備方法為：將核苷酸序列如seqidno.2所示的殼聚糖酶基因構(gòu)建至表達(dá)載體中，然后導(dǎo)入畢赤酵母細(xì)胞，誘導(dǎo)并獲得分泌表達(dá)的殼聚糖酶。

所述枯草芽孢桿菌殼聚糖酶的具體制備步驟包括：(1)根據(jù)畢赤酵母密碼子使用的偏好性，對來源于枯草芽孢肝菌的殼聚糖酶基因原始序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化；(2)將優(yōu)化后的基因進(jìn)行全合成并構(gòu)建至表達(dá)載體pgbg1中；(3)對構(gòu)建的表達(dá)載體進(jìn)行酶切線性化后，舍棄含有抗性基因的片段，回收含有殼聚糖酶基因的片段并導(dǎo)入畢赤酵母細(xì)胞gs115中，誘導(dǎo)并獲得分泌表達(dá)的殼聚糖酶；(4)利用誘導(dǎo)表達(dá)的殼聚糖粗酶上清對殼聚糖底物進(jìn)行水解并使用高效液相色譜方法對產(chǎn)物的聚合度進(jìn)行分析。本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌殼聚糖酶可單獨(dú)用于殼聚糖的降解制備殼寡糖；或者所述枯草芽孢桿菌殼聚糖酶與其他殼聚糖酶或幾丁質(zhì)酶混合使用，協(xié)同降解殼聚糖或幾丁質(zhì)。

所述表達(dá)載體pgbg1的獲得方式是：通過對表達(dá)載體ppic9中的信號肽序列(詳見seqidno.4所示)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，獲得適合在畢赤酵母中表達(dá)的新的信號肽序列(詳見seqidno.5所示)，并利用nsii/xhoi雙酶切將seqidno.5所示的信號肽序列替代原先的seqidno.4所示信號肽，得到表達(dá)載體pgbg1。該表達(dá)載體pgbg1能夠使目的蛋白在畢赤酵母中更高效的分泌表達(dá)。

其中，表達(dá)載體ppic9和畢赤酵母細(xì)胞gs115均為商業(yè)化產(chǎn)品。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

1.本發(fā)明的殼聚糖酶基因來源于枯草芽孢桿菌，使用巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)分泌表達(dá)?？莶菅挎邨U菌已被用于包括淀粉酶、蛋白酶及木聚糖酶等多種食品用酶制劑的發(fā)酵制備，菌株及其來源的酶類安全性有保障，而巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)表達(dá)系統(tǒng)也已被用于乳糖酶及磷脂酶c等食品級酶制劑的表達(dá)，其自身也用于木聚糖酶的生產(chǎn)(gb2760-2014)。因此，使用枯草芽孢桿菌來源的殼聚糖酶基因在畢赤酵母中分泌表達(dá)，其產(chǎn)物殼聚糖酶可成為食品級殼寡糖的生產(chǎn)用酶制劑。

2.本發(fā)明中的殼聚糖酶基因由于根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏愛性進(jìn)行了優(yōu)化，可實(shí)現(xiàn)在畢赤酵母中高效分泌表達(dá)。酶活測定結(jié)果顯示，發(fā)酵上清中的粗酶酶活為281800u/g，比現(xiàn)有專利文獻(xiàn)(cn102816751a)中通過蠟樣芽胞桿菌固體發(fā)酵并純化獲得的殼聚糖酶活性提高約10倍，且本發(fā)明中的粗酶液無需經(jīng)過純化即可直接用于食品級殼寡糖的制備。同時(shí)，我們將本發(fā)明的粗酶液與商品中性蛋白酶(來源于枯草芽孢桿菌)進(jìn)行了水解殼聚糖活性對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明0.3mg酶可完全水解5g殼聚糖，而商品酶的對應(yīng)用量則為150mg。因此，與商品酶相比，分泌表達(dá)的殼聚糖酶效率提高達(dá)500倍，具有替代現(xiàn)有商品酶用于規(guī)模制備殼寡糖的巨大應(yīng)用潛力。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例中的重組表達(dá)載體bscsn-pgbg1及其酶切產(chǎn)物凝膠電泳圖譜。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例中含殼聚糖酶基因的畢赤酵母工程菌的發(fā)酵液上清的sds-page圖譜。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例中殼寡糖cos-94-bscsn的高效液相色譜圖。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例中殼寡糖cos-62-bscsnmaldi-tof質(zhì)譜圖。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例中殼寡糖cos-94-bsnp的高效液相色譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說明。以下采用的試劑和生物材料如未特別說明，均為商業(yè)化產(chǎn)品。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。

實(shí)施例1殼聚糖酶基因的密碼子優(yōu)化及全基因合成

在不改變氨基酸序列的前提下，對來源于枯草芽孢桿菌的殼聚糖酶編碼基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后的密碼子全部為畢赤酵母偏愛密碼子，具體序列見seqidno.2。優(yōu)化后的核苷酸序列bscsn與原始序列(genbankaccessionnumber:al009126，如seqidno.3所示)相比，有195個(gè)核苷酸發(fā)生了變化，核酸序列同源性為74％。同時(shí)，為了使殼聚糖酶在畢赤酵母中能夠高效穩(wěn)定的分泌表達(dá)，優(yōu)化后的殼聚糖酶基因少了編碼5’端信號肽序列的35個(gè)氨基酸，具體序列見seqidno.1。優(yōu)化后的基因序列委托生工進(jìn)行全合成，合成獲得的基因序列命名為殼聚糖酶基因bscsn。

實(shí)施例2殼聚糖酶基因bscsn的表達(dá)載體構(gòu)建

首先使用限制性內(nèi)切酶xhoi及noti對含有殼聚糖酶基因bscsn的克隆載體進(jìn)行雙酶切，獲得目的基因片段，同時(shí)使用相同的內(nèi)切酶對表達(dá)載體pgbg1進(jìn)行雙酶切，回收大片段。兩個(gè)回收產(chǎn)物進(jìn)行連接，獲得重組載體，命名為bscsn-pgbg1。為確定目標(biāo)殼聚糖酶基因已經(jīng)構(gòu)建至載體中，我們分別使用xhoi/noti及bglii對該重組載體進(jìn)行雙酶切及單酶切，并對產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1所示：經(jīng)雙酶切后，出現(xiàn)了稍大于750bp的片段，與bscsn的片段762bp相符；經(jīng)bglii酶切后，出現(xiàn)了預(yù)期的兩個(gè)片段，依次為含有目的基因的大片段和含有抗性基因的小片段。

實(shí)施例3殼聚糖酶畢赤酵母工程菌的篩選及殼聚糖酶制備

將獲得的重組質(zhì)粒bscsn-pgbg1經(jīng)限制性內(nèi)切酶bglii線性化后，凝膠電泳分離并切取含有目的基因的核苷酸片段(如圖2所示的較大的片段)，電擊導(dǎo)入畢赤酵母gs115中，將通過組氨酸營養(yǎng)缺陷md平板上篩選得到的重組子平鋪在含有膠體殼聚糖(0.5％)的bmmy瓊脂平板上進(jìn)行培養(yǎng)，從中進(jìn)一步篩選出水解圈最大的單克隆菌株。將篩選的單克隆菌株的單菌落接種于200mlbmgy培養(yǎng)基中，30℃及250rpm下培養(yǎng)48小時(shí)，離心棄上清，加入200ml的bmmy培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。24h后補(bǔ)加甲醇至其終濃度為1％，以后每隔24h補(bǔ)加一次，共計(jì)誘導(dǎo)120h后離心，上清液即為含有殼聚糖酶(記為殼聚糖酶bscsn)的粗酶液。使用sds-page檢測蛋白表達(dá)情況，其結(jié)果如圖2所示。bradford法測定粗酶液中的蛋白質(zhì)濃度為0.3mg/ml；dns法測定其比酶活為84.54u/ml，因此，理論上1g殼聚糖酶bscsn的酶活為281800u。上述的md瓊脂平板、bmmy瓊脂平板、bmgy培養(yǎng)基、bmmy培養(yǎng)基為酵母表達(dá)系統(tǒng)常用的培養(yǎng)基，可直接購買或者按照現(xiàn)有文獻(xiàn)技術(shù)配制均可。

實(shí)施例4殼聚糖酶bscsn水解高脫乙酰度殼聚糖制備殼寡糖

稱取50g殼聚糖(脫乙酰度：94％)，加至1000ml1.5％乙酸水溶液中，ph5-6。充分溶解后，加入10ml發(fā)酵的殼聚糖酶bscsn粗酶液，40℃下攪拌反應(yīng)48小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，離心去除不容物，上清經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40℃下濃縮至約300ml，后經(jīng)冷凍干燥得成品殼寡糖，命名為cos-94-bscsn。稱取一定量制備的殼寡糖cos-94-bscsn，配置成濃度為20mg/ml的水溶液，過濾后用于高效液相色譜分析。高效液相色譜儀連接蒸發(fā)光散射檢測器用于殼寡糖的信號檢測，使用xamide色譜柱(華譜新創(chuàng)科技有限公司)對殼寡糖進(jìn)行分離，乙腈濃度遞減(70％-50％)方式洗脫，柱溫為30℃，檢測器氣壓23psi，流速：1ml/min。流動相為0.1m甲酸胺(ph3.2)、乙腈及水溶液。洗脫時(shí)間：40min。結(jié)果如圖3所示，從圖3可以看出，得到的殼寡糖產(chǎn)物為聚合度2-6的殼寡糖。

實(shí)施例5殼聚糖酶bscsn水解低脫乙酰度殼聚糖制備殼寡糖

稱取50g殼聚糖(脫乙酰度：62％)，加至1000ml1.5％乙酸水溶液中，(ph5-6)。充分溶解后，加入10ml發(fā)酵的殼聚糖酶bscsn粗酶液，40℃下攪拌反應(yīng)48小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，離心去除不容物，上清經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40℃下濃縮至約300ml，后經(jīng)冷凍干燥得成品殼寡糖命名為cos-62-bscsn。由于該產(chǎn)物組分較為復(fù)雜，難以通過液相對組分進(jìn)行有效分離，因此采用maldi-tof質(zhì)譜方法對其組分進(jìn)行分析。具體方法為：稱取一定量制備的cos-62-bscsn，配制成濃度為2mg/ml的水溶液，過濾后吸取1μl點(diǎn)樣至樣品板上，待其自然干燥后，加入1μl基質(zhì)2,5-二羥基苯甲酸(dhb)溶液，待其干燥后使用autoflexⅲsmartbeam型maldi-tof質(zhì)譜儀(bruker公司)進(jìn)行檢測(正離子反射模式)。質(zhì)譜檢測結(jié)果如圖4所示：為便于區(qū)分，以a代表n-乙酰氨基葡萄糖，d代表氨基葡萄糖，隨后的數(shù)字代表含有該單糖的個(gè)數(shù)，二者加和為寡糖的聚合度。從圖4的結(jié)果來看，低脫乙酰度殼寡糖cos-62-bscsn組分較復(fù)雜：質(zhì)譜方法可檢測到聚合度2-14的寡糖，且同一個(gè)聚合度下存在不同乙酰度的殼寡糖。

對比例6來源于枯草芽孢桿菌的中性蛋白酶制備殼寡糖

稱取50g殼聚糖(脫乙酰度：94％)，加至1000ml1.5％乙酸水溶液中，ph5-6。充分溶解后，加入1.5g商品中性蛋白酶(枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備)，40℃下攪拌反應(yīng)48小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，離心去除不容物，上清經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40℃下濃縮至約300ml，后經(jīng)冷凍干燥得成品殼寡糖，命名為cos-94-bsnp。稱取一定量制備的殼寡糖cos-94-bsnp，配置成濃度為20mg/ml的水溶液，過濾后用于高效液相色譜分析。高效液相色譜儀連接蒸發(fā)光散射檢測器用于殼寡糖的信號檢測，使用xamide色譜柱(華譜新創(chuàng)科技有限公司)對殼寡糖進(jìn)行分離，乙腈濃度遞減(70％-50％)方式洗脫，柱溫為30℃，檢測器氣壓23psi，流速：1ml/min。流動相為0.1m甲酸胺(ph3.2)、乙腈及水溶液。洗脫時(shí)間：40min。結(jié)果如圖5所示，得到的殼寡糖產(chǎn)物為聚合度2-6的殼寡糖。與本發(fā)明10ml粗酶液(約含蛋白3mg)完全水解50g殼聚糖相比，使用商品中性蛋白酶時(shí)，用量為1.5g，約為粗酶液用量的500倍。因此，本發(fā)明的殼聚糖酶應(yīng)用于殼寡糖的工業(yè)制備時(shí)，可大幅度降低用酶成本。

上述僅為本發(fā)明的部分優(yōu)選實(shí)施例，本發(fā)明并不僅限于實(shí)施例的內(nèi)容。對于本領(lǐng)域中的技術(shù)人員來說，在本發(fā)明技術(shù)方案的構(gòu)思范圍內(nèi)可以有各種變化和更改，所作的任何變化和更改，均在本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)。

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<110>中科榮信（蘇州）生物科技有限公司

<120>一種枯草芽孢桿菌殼聚糖酶及其制備方法和應(yīng)用

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