本發(fā)明涉及分子生物學檢測領域，尤其是涉及一種遺傳性結直腸癌易感基因檢測用的多重pcr引物系統(tǒng)、檢測方法和應用。
背景技術：
：結直腸癌(colorectalcancer，crc)為結腸癌和直腸癌的總稱，指大腸粘膜上皮在環(huán)境或遺傳等多種致癌因素作用下發(fā)生的癌變，是全世界第三大常見惡性腫瘤，其死亡率較高。研究發(fā)現(xiàn)35％的crc存在家族易感性，其中最常見的是遺傳性非息肉病性結直腸癌(hereditarynonpolyposiscolorectalcancer，hnpcc)，此外，家族性腺瘤性息肉(familialadenomatouspolyposis，fap)和錯構息肉綜合征(hamartomatouspolyposissyndromes，hps)也比較常見。因此，開展對遺傳性結直腸癌的易感基因的分析和研究對遺傳性結直腸癌的發(fā)病機理和輔助早期診斷具有重要的應用價值。技術實現(xiàn)要素：基于此，有必要提供一種遺傳性結直腸癌易感基因檢測用的多重pcr引物系統(tǒng)、檢測方法和應用。本發(fā)明解決上述技術問題的技術方案如下。一種遺傳性結直腸癌易感基因檢測用的多重pcr引物系統(tǒng)，包括第一多重pcr引物組合和/或第二多重pcr引物組合；其中，所述第一多重pcr引物組合含有112對pcr引物對，且該112對pcr引物對的序列分別如seqidno:1～seqidno:224所示；所述第一多重pcr引物組合含有113對pcr引物對，且該113對pcr引物對的序列分別如seqidno:225～seqidno:450所示。在其中一個實施例中，所述第一多重pcr引物組合中的各對引物等摩爾量混合。在其中一個實施例中，所述第二多重pcr引物組合中的各對引物等摩爾量混合。上述任一實施例所述的遺傳性結直腸癌易感基因檢測用的多重pcr引物系統(tǒng)可應用在制備檢測遺傳性直結腸癌的檢測試劑中。一種遺傳性結直腸癌易感基因檢測用試劑盒，含有上述任一實施例所述的遺傳性結直腸癌易感基因檢測用的多重pcr引物系統(tǒng)。在其中一個實施例中，所述遺傳性結直腸癌易感基因檢測用試劑盒還包括dna提取試劑、pcr擴增試劑、和/或dna純化試劑。一種遺傳性結直腸癌易感基因的檢測方法，包括如下步驟：使用上述任一實施例所述的遺傳性結直腸癌易感基因檢測用的多重pcr引物系統(tǒng)，以獲取的基因組dna為模板進行多重pcr擴增；對多重pcr擴增的產物構建測序文庫；對構建的測序文庫進行高通量測序，并將測序結果比對到人類基因組參考序列上。在其中一個實施例中，所述構建測序文庫依次包括：對多重pcr擴增的產物進行末端修復、末端加a、連接測序接頭、文庫擴增、對擴增后的文庫進行純化和片段篩選。在其中一個實施例中，所述人類基因組參考序列為hg19。在其中一個實施例中，所述遺傳性結直腸癌易感基因的檢測方法還包括對比對結果進行突變篩查分析和對篩選的突變進行功能注釋的步驟。本發(fā)明經過研究發(fā)現(xiàn)，遺傳性非息肉病性結直腸癌、家族性腺瘤性息肉和錯構息肉綜合征等具有家族易感性的癌癥跟11個基因的家系突變有關，其中，遺傳性非息肉病性結直腸癌的影響基因包括msh2、mlh1、pms2、msh6、epcam，其中mlh1占有害家系突變的50％，msh2占40％，msh6占7％～10％，pms2占<5％，epcam占1％，家族性腺瘤性息肉包括經典型fap和衰弱型fap，其影響基因包括apc、mutyh，錯構息肉綜合征包括幼年性息肉病、cowden綜合征和peutzjeghers綜合征，其影響基因包括bmpr1a、smad4、pten、stk11。本發(fā)明的遺傳性結直腸癌易感基因檢測用的多重pcr引物系統(tǒng)能同時檢測結直腸癌相關的11個易感基因，各引物之間相互干擾性小，特異性強，擴增效果好，引物偏向性擴增的程度低，可提高檢測效率，降低檢測成本，并且可配合高通量測序技術，具有檢測通量高、準確性和靈敏度高、重復性好等特點，對結直腸癌易感人群，尤其是具有結直腸癌家族遺傳史的人群有一定的輔助診斷和提示作用。附圖說明圖1為具體實施例中293t-1文庫2100結果；圖2為具體實施例中293t-2文庫2100結果。具體實施方式為了便于理解本發(fā)明，下面將參照相關附圖對本發(fā)明進行更全面的描述。附圖中給出了本發(fā)明的較佳實施例。但是，本發(fā)明可以以許多不同的形式來實現(xiàn)，并不限于本文所描述的實施例。相反地，提供這些實施例的目的是使對本發(fā)明的公開內容的理解更加透徹全面。除非另有定義，本文所使用的所有的技術和科學術語與屬于本發(fā)明的
技術領域：
的技術人員通常理解的含義相同。本文中在本發(fā)明的說明書中所使用的術語只是為了描述具體的實施例的目的，不是旨在于限制本發(fā)明。本文所使用的術語“和/或”包括一個或多個相關的所列項目的任意的和所有的組合。實施例1一、引物設計本實施例引物設計針對的目標區(qū)域為結直腸癌相關11個易感基因的編碼外顯子和外顯子-內含子邊界10堿基。因部分基因的最長編碼外顯子長達幾千，單對引物無法擴增該長度的區(qū)域，且測序讀長達不到該長度，所以需要將長度過大的外顯子進行劃分，分到多個pcr反應體系中進行。本實施例設計的遺傳性結直腸癌易感基因檢測多重pcr引物設計概況如表1所示。表1遺傳性結直腸癌易感基因檢測多重pcr引物設計概況二、實驗材料本實施例涉及的細胞系293t來源于廣州賽庫生物技術有限公司，并按要求進行復蘇、培養(yǎng)和傳代。所有引物純度達到電泳級(page)，不含雜帶。主要試劑如：kodmuti&epi和2×pcrbufferforkod-muti&epi(toyobo，貨號kme-101)、vahtsnanodnalibraryprepkitforillumina(諾唯贊，貨號nd601-02)、vahtsdnaadaptersset1/set2forillumina(諾唯贊，貨號n801-01)、vahtsdnacleanbeads(諾唯贊，貨號n411-02)、hipureblood&tissuednakit(magen，貨號d3018-03)等。主要儀器如：illuminanextseq500測序儀、agilent2100bioanalyzer、qubit熒光定量儀、pcr儀、高速離心機、水浴鍋、漩渦震蕩儀、冰箱、移液器等。三、多重pcr擴增，文庫構建和ngs測序將225對引物按設計方案混合成2個mix，以293t細胞系為標準品進行目標序列富集和文庫構建，設2個重復，分別為293t-1和293t-2。(一).dna模板的多重pcr擴增1.引物加入滅菌純化水溶解，終濃度為400nm。seqidno:1～seqidno:224所示的引物等物質的量混合，成為引物mix1，seqidno:225～seqidno:450所示的引物等物質的量混合，成為引物mix2。引物mix1/2的終濃度均為50nm。2.樣本dna提取。使用hipureblood&tissuednakit，抽提293t細胞的dna。3.將同一待測樣本分成a、b兩管進行反應。擴增體系見下表2。表2試劑體積(μl)2×pcrbufferforkod-multi&epi10kod-multi&epi(1.0u/μl)0.4引物mix1/2(50μm)7.6dna樣本(5ng/μl)2總體積20pcr擴增程序見下表3。表34.同一樣本的pcr擴增產物等物質的量混合后，使用磁珠(來自vahtsdnacleanbeads(諾唯贊))進行純化。(二).使用vahtsnanodnalibraryprepkitforillumina(諾唯贊)試劑盒，進行文庫構建1.末端修復：把20μl的endprepmix和30μl的純化后pcr擴增產物混合后，30℃孵育30min。2.使用磁珠對末端修復產物進行純化。3.末端加a：把12.5μl的da-tailingmix和17.5μl的純化后末端修復產物混合均勻后，37℃孵育30min，70℃孵育5min,4℃孵育5min。4.測序接頭連接：往步驟3中的產物中加入2.5μl的ligationmix和2.5μl的dnaadapterx(來自vahtsdnaadaptersset1/set2forillumina(諾唯贊))，混合均勻后，30℃孵育10min。5.使用磁珠對接頭連接產物進行純化。6.文庫擴增：使用純化后的連接產物作為dna模板，進行pcr擴增。擴增體系見下表4。表4dna模板20μlpcrprimermix5μlamplificationmix225μl總體積50μl擴增程序見下表5。表57.使用磁珠對擴增后的文庫進行純化和片段篩選。(三).文庫質檢和測序1.使用qubit熒光定量儀對文庫濃度進行定量。2.使用agilent2100bioanalyzer對文庫質量進行質檢。3.使用nextseq500測序儀對樣本文庫進行測序。四、實驗結果和數(shù)據(jù)分析測序數(shù)據(jù)分析使用bwa軟件與人類基因組參考序列hg19進行比對，用gatk工具軟件對比對結果進行突變篩查分析(篩查條件：1、比對質量大于20；2、測序深度大于100)，用annovar軟件對篩選的突變進行功能注釋。293t-1和293t-2高通量測序文庫2100分析的結果如圖1、2。由圖1和圖2可以看出，最后產生了高質量的測序文庫，且文庫的長度分布與各自的設計預期相符。上述文庫在illuminanextseq500進行上機測序，測序模式為pe150。對于測序數(shù)據(jù)，經過生物信息分析，一方面統(tǒng)計數(shù)據(jù)指標用于評價序列富集效果，另一方面進行單核苷酸多態(tài)性(snp)和短插入缺失(indel)突變檢測，評估遺傳性結直腸癌易感基因檢測的可行性。表6測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計如表6所示，目標區(qū)域大小約為32kb，本實施例的兩個文庫293t-1和293t-2測序產生了超過310萬條read序列，測序數(shù)據(jù)量分別為470mb和660mb。測序數(shù)據(jù)中超過95％的短序列能夠比對上基因組，比對上基因組的數(shù)據(jù)中97％以上比對到了目標區(qū)域，證明了多重pcr序列富集的高度特異性。此外，本實施例對目標區(qū)域序列的富集效果達到了100％覆蓋度，并且目標區(qū)域平均測序深度達1萬倍以上。本實施例僅需在2個pcr反應體系進行，一方面減少了實驗操作步驟，同時也將樣本起始量降低到了20ng(如表1所示)。本實施例的遺傳性結直腸癌易感基因檢測用的多重pcr引物系統(tǒng)的設計目的是為了對遺傳性結直腸癌進行基因檢測，即分析遺傳性結直腸癌易感基因上是否存在功能性的突變，包括單核苷酸多態(tài)性(snp)和短插入缺失(indel)。測序數(shù)據(jù)突變分析在293t-1、293t-2、中均檢測到15個snp，未檢測到indel，兩個結果的一致性100％。經過對這15個snp的進一步分析，其功能分類均屬于正常多態(tài)性。綜上，本發(fā)明的遺傳性結直腸癌易感基因檢測用的多重pcr引物系統(tǒng)是一種高效、可靠的高通量測序擴增用pcr引物系統(tǒng)，其能同時檢測結直腸癌相關的11個易感基因，提高檢測效率，且降低檢測成本，還具有檢測通量高、準確性和靈敏度高、重復性好等特點，對結直腸癌易感人群，尤其是具有結直腸癌家族遺傳史的人群有一定的輔助診斷和提示作用。以上所述實施例的各技術特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術特征的組合不存在矛盾，都應當認為是本說明書記載的范圍。以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。sequencelisting<110>廣州永諾健康科技有限公司，廣州永諾生物科技有限公司<120>遺傳性結直腸癌易感基因檢測用的多重pcr引物系統(tǒng)、檢測方法和應用<130>2017<160>450<170>patentinversion3.3<210>1<211>22<212>dna<213>homosapiens<400>1ggagagaggacaaggagaggat22<210>2<211>22<212>dna<213>homosapiens<400>2tgaggctatatccacaggccta22<210>3<211>22<212>dna<213>homosapiens<400>3ctcttggcttgagtagggttcg22<210>4<211>21<212>dna<213>homosapiens<400>4gtctgcaaaggagctctgctt21<210>5<211>22<212>dna<213>homosapiens<400>5ccaggagtcttgggtgtcttat22<210>6<211>22<212>dna<213>homosapiens<400>6gatgagagcctctactttgggg22<210>7<211>22<212>dna<213>homosapiens<400>7ctaccatggagaagacgggtag22<210>8<211>22<212>dna<213>homosapiens<400>8ggcctcaaaatttggcctcatt22<210>9<211>22<212>dna<213>homosapiens<400>9ggctgggcctaactattcaaac22<210>10<211>22<212>dna<213>homosapiens<400>10tcccttctttgtctcatgggtc22<210>11<211>22<212>dna<213>homosapiens<400>11gctttacaaacagcggttgaca22<210>12<211>27<212>dna<213>homosapiens<400>12tcactagccttgtcaaaaatgaaattg27<210>13<211>26<212>dna<213>homosapiens<400>13agcatatgcacatttttagaattcca26<210>14<211>23<212>dna<213>homosapiens<400>14agagatgttcagtgagcagagaa23<210>15<211>26<212>dna<213>homosapiens<400>15atctccttttgtttctgctaacgatc26<210>16<211>26<212>dna<213>homosapiens<400>16tcacaaagtatctttttctgtggctt26<210>17<211>25<212>dna<213>homosapiens<400>17ctcactcgataatctggatgactca25<210>18<211>26<212>dna<213>homosapiens<400>18aattctcagatccaggaagaggaaag26<210>19<211>27<212>dna<213>homosapiens<400>19ctgtccttattttggatatttctccca27<210>20<211>26<212>dna<213>homosapiens<400>20aacacacatcacatacatacaagtca26<210>21<211>26<212>dna<213>homosapiens<400>21tgagctccatttgtagttatagctgt26<210>22<211>26<212>dna<213>homosapiens<400>22tccttttccctttatgtttcttagga26<210>23<211>24<212>dna<213>homosapiens<400>23ctggtagcattagactcagatggg24<210>24<211>23<212>dna<213>homosapiens<400>24gcccacatgggttaatttgcttt23<210>25<211>26<212>dna<213>homosapiens<400>25a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