本發(fā)明涉及食品質(zhì)量安全檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種一步法微滴數(shù)字pcr定量檢測果蔬中g(shù)ii型諾如病毒的方法。

背景技術(shù)：

食源性病毒疾病是一個正在受到關(guān)注的社會問題。在世界范圍內(nèi)，50％以上的急性腸胃炎事件是由諾如病毒所造成，其中主要的基因型為gii。諾如病毒最早在1972年被kapikan等人所檢出。它具有感染劑量低，能忍受大范圍溫度變化等特點(diǎn)，是造成非細(xì)菌性急性腸胃炎的重要原因。它主要傳播途徑為“糞--口”傳播，可通過人與人之間直接傳播，或接觸到被污染的水和食物而進(jìn)行傳播，常受到污染的食品有蔬菜，軟質(zhì)水果，貝類等。如何檢測食品中的諾如病毒并進(jìn)行定量，是一個熱點(diǎn)問題。目前諾如病毒的檢測方法通常采用熒光定量qpcr進(jìn)行定性和定量分析。2017年國家頒布食品中諾如病毒檢測的熒光定量pcr方法--《gb4789.42-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)諾如病毒檢驗(yàn)》。然而在qpcr方法的實(shí)際檢測應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)：若檢測樣品存在pcr抑制物，則會降低其靈敏度和準(zhǔn)確性，易造成假陰性；同時rt-qpcr法需要依賴ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性才能對樣品進(jìn)行定量分析，存在一定的不確定性，難以檢測微小的拷貝數(shù)變化；靈敏度有限也是qpcr的一個不足之處。鑒于諾如病毒是一種高感染性病毒，在食品中的病毒量通常偏低，因此如何提高檢測靈敏度，建立可信的檢測方法，科學(xué)評估受感染食品的安全風(fēng)險是一個急需解決的問題。

微滴數(shù)字pcr(ddpcr)是一種與qpcr不同的定量技術(shù)，ddpcr中單個核酸分子被分配到體積極小(0.5fl～0.5nl)的油包水微滴中，使大部分微滴中的核酸分子數(shù)目為1或0，這允許在1μl的乳化劑中形成大約10⁷個反應(yīng)，然后通過pcr擴(kuò)增和熒光信號的累計(jì)讀取陽性微滴數(shù)目，再根據(jù)泊松分布計(jì)算出樣本中的核酸分子數(shù)。ddpcr對檢測目標(biāo)的定量無需標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以實(shí)現(xiàn)核酸絕對定量分析。相比現(xiàn)有的常規(guī)和實(shí)時定量pcr，ddpcr的反應(yīng)受擴(kuò)增效率的影響大大降低，對pcr反應(yīng)抑制物的耐受能力極大地提高，微滴離散技術(shù)同時可以規(guī)避樣品pcr抑制物的影響，從而提高了檢測靈敏度。ddpcr現(xiàn)在比較多用于轉(zhuǎn)基因食品中檢測，但用于食源性病毒上并未見到有應(yīng)用，因此若能將ddpcr應(yīng)用到食源性病毒的檢測之中，將有效擴(kuò)大病毒檢測方法的范圍，并能有效提高檢測隱藏于食品抑制物中的病毒。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種一步法微滴數(shù)字pcr定量檢測果蔬中g(shù)ii型諾如病毒的方法。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一步法微滴數(shù)字pcr定量檢測果蔬中g(shù)ii型諾如病毒的方法，包括如下步驟：

(1)對果蔬樣品中病毒進(jìn)行洗脫，得到洗脫懸浮液，然后加入氯仿/正丁醇溶液，混合，室溫靜置，離心，收集上層水相；

(2)以步驟(1)得到的上層水相進(jìn)行病毒rna提取，得到病毒rna樣品；

(3)利用逆轉(zhuǎn)錄微滴數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(rt-ddpcr)，結(jié)合已報道用于實(shí)時熒光定量rt-qpcr檢測gii型諾如病毒的引物和探針，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，建立一步法rt-ddpcr高靈敏快速檢測gii型諾如病毒的方法，實(shí)現(xiàn)gii型諾如病毒的高靈敏快速檢測。

所述的果蔬樣品的水果為軟質(zhì)水果。

所述的對果蔬樣品中病毒進(jìn)行洗脫的方法，包括如下步驟：

1)將果蔬樣品切成約2.5cm*2.5cm*2.5cm的小塊，裝入錐形瓶中，加入tgbe溶液(對于水果還要額外加入1140ua.aculeatus果膠酶)，用錫紙蓋好瓶口；

2)室溫250r/min，振蕩20min±1min，若ph低于9.0則需要用1mol/l的naoh調(diào)節(jié)至ph＝9.5±0.1；

3)將振蕩液轉(zhuǎn)移至離心管，8698～10000r/min，4±1℃離心30min±5min；取上清，用1mol/l的hcl調(diào)ph至7.0±0.5；

4)加入1/3體積的4xpeg8000/nacl溶液，使終濃度為100g/lpeg8000，0.3mol/lnacl；60s搖勻，在4±1℃，200r/min頻率下振蕩60±5min；

5)在4±1℃，8698～10000r/min離心30min±5min；棄上清，再在4±1℃，8698～10000r/min離心5±1min，緊實(shí)沉淀，棄上清；

6)加入磷酸緩沖液(pbs)進(jìn)行懸浮沉淀，得到洗脫懸浮液。

步驟(1)中所述的洗脫懸浮液與氯仿/正丁醇溶液的體積比為1:1；

步驟(1)中所述的氯仿/正丁醇溶液中氯仿與正丁醇的體積比為1:1；

步驟(1)中所述的室溫靜置的時間為5±1min；

步驟(1)中所述的離心的條件為4±1℃、8698～10000r/min離心15min±1min。

步驟(2)中所述的病毒rna提取采用試劑盒提取。

步驟(3)中所述的引物和探針：

上游引物qnif2：5′-atgttcagrtggatgagrttctcwga-3′；

下游引物cog2r：5′-tcgacgccatcttcattcaca-3′；

探針qnifs：5′-fam-agcacgtgggagggcgatcg-bhq1-3′。

步驟(3)中所述的rt-ddpcr的反應(yīng)體系為：采用伯樂公司one-steprt-ddpcradvancedkitforprobes試劑盒。

優(yōu)選的，步驟(3)中所述的rt-ddpcr的反應(yīng)體系為：

所述的rt-ddpcr的反應(yīng)條件為：

逆轉(zhuǎn)錄42℃60min，95℃10min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，95℃30s，54℃±2℃1min，45個循環(huán)，98℃10min，爬坡速度為1℃/s。

通過試驗(yàn)證明：本發(fā)明檢測方法靈敏、準(zhǔn)確、直觀，對農(nóng)業(yè)部、檢驗(yàn)檢疫局等政府部門以及相關(guān)檢測機(jī)構(gòu)和企業(yè)提供了新的檢測方法并具有指導(dǎo)意義。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

(1)引物特異性好，與其他食源性病毒無交叉反應(yīng)。

(2)靈敏度高，qpcr的靈敏度通常為10copies/μl左右，而ddpcr的靈敏度可達(dá)約2copies/μl。

(3)擴(kuò)增效率高，擴(kuò)增效率為95.4％，r²＝0.9973。

(4)穩(wěn)定性好，對病毒樣品經(jīng)過不同時間后進(jìn)行檢測，組內(nèi)cv小于4％，組間cv結(jié)果小于2％，說明重現(xiàn)性高。

(5)受抑制物影響小，qpcr的檢測容易受反應(yīng)抑制物的影響呈現(xiàn)假陰性，而利用ddpcr的微滴反應(yīng)體系，能有效避免假陰性的出現(xiàn)。

(6)ddpcr檢測效果等于或優(yōu)于qpcr。病毒濃度較高時，ddpcr檢測效果與qpcr無顯著差異。低濃度下未經(jīng)氯仿/丁醇處理的ddpcr病毒回收率顯著優(yōu)于qpcr(p<0.05)。

(7)優(yōu)化后的蔬菜病毒洗脫步驟與原來國標(biāo)步驟相比，在qpcr上有顯著差異(p<0.05)，ddpcr上沒有顯著差異，但平均回收率有所提升。

附圖說明

圖1是rt-ddpcr檢測novgii最佳退火溫度探究實(shí)驗(yàn)，其中從左往右的溫度分別為(℃)：60，58，57，56，54，52，51，50。

圖2是rt-ddpcr檢測novgii最佳引物濃度探究實(shí)驗(yàn)，引物濃度左至右分別為1.2μm，0.9μm，0.6μm，0.3μm，陰性對照。

圖3是rt-ddpcr檢測novgii最佳探針濃度探究實(shí)驗(yàn)，探針濃度左至右分別為450nm，350nm，250nm，150nm，陰性對照(陰性對照采用了250nm探針濃度)。

圖4是rt-ddpcr檢測novgii引物特異性試驗(yàn)。

圖5是rt-ddpcr檢測novgii敏感性試驗(yàn)，其中從左至右標(biāo)準(zhǔn)品的基因拷貝數(shù)分別為：陰性，2.116copies/μl，4.232copies/μl，8.465copies/μl，8.465*10¹copies/μl，8.465*10²copies/μl，8.465*10³copies/μl，8.465*10⁴copies/μl，8.465*10⁵copies/μl，8.465*10⁶copies/μl。

圖6是rt-qpcr檢測novgii敏感性試驗(yàn)，曲線1～8：標(biāo)準(zhǔn)品的基因拷貝數(shù)分別為：8.47*10⁶～8.47copies/μl，陰性。

圖7是根據(jù)靈敏度計(jì)算出的rt-ddpcr檢測novgii的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖8是根據(jù)靈敏度計(jì)算出的rt-qpcr檢測novgii的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖9是生菜未經(jīng)氯仿/丁醇處理qpcr檢測，經(jīng)氯仿/丁醇處理qpcr檢測，未經(jīng)氯仿/丁醇處理ddpcr檢測，經(jīng)氯仿/丁醇處理ddpcr檢測四種方法下的生菜中諾如病毒gii回收率。

圖10是草莓未經(jīng)氯仿/丁醇處理qpcr檢測，經(jīng)氯仿/丁醇處理qpcr檢測，未經(jīng)氯仿/丁醇處理ddpcr檢測，經(jīng)氯仿/丁醇處理ddpcr檢測四種方法下的草莓中諾如病毒gii回收率。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例用到的諾如病毒gii型(norovirusgenegroupii，novgii)、諾如病毒gi型(norovirusgenegroupi，novgi)、札如病毒(sapovirus，sav)、輪狀病毒(rotavirus，rv)、星狀病毒(astrovirus，astv)、腺病毒(adenovirus，adv)，均由廣東省疾病預(yù)防控制中心提供。

實(shí)施例1rt-ddpcr擴(kuò)增退火溫度優(yōu)化

按照loisy中諾如病毒gii型的上游引物和探針序列及kageyama中的諾如病毒gii型下游引物合成引物探針(見備注1，2)：

上游引物qnif2：5′-atgttcagrtggatgagrttctcwga-3′；

下游引物cog2r：5′-tcgacgccatcttcattcaca-3′；

探針qnifs：5′-agcacgtgggagggcgatcg-3′，探針5′端標(biāo)記熒光報告基團(tuán)fam，3′端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)為bhq1。以同一病毒核酸為模板，按照儀器的梯度溫度設(shè)置，從50～60℃(具體為50℃，51℃，52℃，54℃，56℃，57℃，58℃，60℃)選擇8個溫度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。反應(yīng)條件為：伯樂公司one-steprt-ddpcradvancedkitforprobes試劑盒中supermix5μl，rt-enzymemix2μl，dtt1μl，采用0.9μmol/l的上、下游引物和0.35μmol/l探針濃度，模板添加量為2μl，用rnasefree水補(bǔ)充至20μl。逆轉(zhuǎn)錄42℃60min，95℃10min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，95℃30s，50～60℃1min，45個循環(huán)，98℃10min，爬坡速度為1℃/s。結(jié)果顯示54℃下檢測結(jié)果達(dá)最大值，因此選用54℃作為最優(yōu)退火溫度。(圖1)

備注1.loisy,f.,etal.,real-timert-pcrfornorovirusscreeninginshellfish.journalofvirologicalmethods,2005.123(1):p.1-7

備注2.kageyama,t.,etal.,broadlyreactiveandhighlysensitiveassayfornorwalk-likevirusesbasedonreal-timequantitativereversetranscription-pcr.jclinmicrobiol,2003.41(4):p.1548-57.

實(shí)施例2rt-ddpcr擴(kuò)增引物濃度優(yōu)化

采用與實(shí)施例1相同的引物探針序列進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以同一病毒核酸為模板，分別選用0.3μm，0.6μm，0.9μm，1.2μm的引物濃度進(jìn)行探究，其余反應(yīng)條件為：伯樂公司one-steprt-ddpcradvancedkitforprobes試劑盒中supermix5μl，rt-enzymemix2μl，dtt1μl，終濃度0.35μmol/l探針濃度，模板添加量為2μl，用rnasefree水補(bǔ)充至20μl。逆轉(zhuǎn)錄42℃60min，95℃10min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，95℃30s，54℃1min，45個循環(huán)，98℃10min，爬坡速度為1℃/s。結(jié)果顯示在0.9μm引物濃度中反應(yīng)檢測結(jié)果達(dá)最大值，因此采用0.9μm的引物濃度(圖2)。

實(shí)施例3rt-ddpcr擴(kuò)增探針濃度優(yōu)化

采用與實(shí)施例1相同的引物探針序列進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以同一病毒核酸為模板，分別選用150nm，250nm，350nm，450nm的探針濃度進(jìn)行探究，其余反應(yīng)條件為：伯樂公司one-steprt-ddpcradvancedkitforprobes試劑盒中supermix5μl，rt-enzymemix2μl，dtt1μl，終濃度0.9μm的引物濃度，模板添加量為2μl，用rnasefree水補(bǔ)充至20μl。逆轉(zhuǎn)錄42℃60min，95℃10min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，95℃30s，54℃1min，45個循環(huán)，98℃10min，爬坡速度為1℃/s。結(jié)果顯示在350nm探針濃度中反應(yīng)檢測結(jié)果達(dá)最大值，因此采用350nm的探針濃度(圖3)。

實(shí)施例4

用建立的ddpcr方法分別對諾如病毒gii型(norovirusgenegroupii，novgii)、諾如病毒gi型(norovirusgenegroupi，novgi)，札如病毒(sapovirus，sav)，輪狀病毒(rotavirus，rv)，星狀病毒(astrovirus，astv)，腺病毒(adenovirus，adv)進(jìn)行檢測，驗(yàn)證該方法的特異性。結(jié)果顯示，該方法對諾如病毒gii型有擴(kuò)增，對其他病毒均無擴(kuò)增，標(biāo)明該方法特異性較好(圖4)。

實(shí)施例5ddpcr與rt-qpcr敏感性分析對比

將連續(xù)梯度倍比稀釋好的陽性標(biāo)準(zhǔn)品跟別進(jìn)行ddpcr與rt-qpcr，微滴pcr的反應(yīng)條件為：伯樂公司one-steprt-ddpcradvancedkitforprobes試劑盒中supermix5μl，rt-enzymemix2μl，dtt1μl，終濃度0.9μm的引物濃度，終濃度為350nm的探針濃度，模板添加量為2μl，用rnasefree水補(bǔ)充至20μl。逆轉(zhuǎn)錄42℃60min，95℃10min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，95℃30s，54℃1min，45個循環(huán)，98℃10min，爬坡速度為1℃/s。rt-qpcr的反應(yīng)條件為：大連寶生物公司onestepprimescriptrt-pcrkit(perfectrealtime)試劑盒中2*1stepbuffer10μl，rt-enzymemix0.4μl，extaqhs0.4μl，終濃度為0.8μmol/l的引物和0.4μmol/l探針，模板添加量為2μl。優(yōu)化后的反應(yīng)程序：逆轉(zhuǎn)錄：42℃15min，滅活逆轉(zhuǎn)錄酶：95℃10s；95℃5s，56℃30s，72℃30s，45個循環(huán)，在退火階段收集熒光信號。由圖5和6結(jié)果顯示，在熒光定量pcr中，對連續(xù)梯度倍的陽性質(zhì)粒進(jìn)行10次檢測，發(fā)現(xiàn)當(dāng)質(zhì)粒最低濃度為8.465copies/μl時，10次檢測僅4次檢出，其余濃度檢出率為100％，因此推斷熒光定量pcr的理論檢測限為8.465copies/μl，而實(shí)驗(yàn)檢測限為80.465copies/μl。ddpcr對低濃度的陽性質(zhì)粒有擴(kuò)增，最低檢測拷貝數(shù)為2.116copies/μl，即其靈敏度是熒光定量pcr最低檢測限的四倍。由圖7和8可知，熒光定量pcr的r值為0.9986，斜率為-3.4123，擴(kuò)增效率為96.36％。微滴數(shù)字pcr的r值為0.9973，擴(kuò)增效率為95.44％，表明ddpcr和qpcr均具有良好的線性關(guān)系。

實(shí)施例6rt-ddpcr的穩(wěn)定性試驗(yàn)

在確認(rèn)了最優(yōu)退火溫度，最優(yōu)引物及探針濃度后，為了確定該反應(yīng)體系的穩(wěn)定性，對病毒核酸樣品進(jìn)行組內(nèi)(n＝5)以及組間(n＝3)實(shí)驗(yàn)。ddpcr的反應(yīng)條件為：伯樂公司one-steprt-ddpcradvancedkitforprobes試劑盒中supermix5μl，rt-enzymemix2μl，dtt1μl，終濃度0.9μm的引物濃度，終濃度為350nm的探針濃度，模板添加量為2μl，用rnasefree水補(bǔ)充至20μl。逆轉(zhuǎn)錄42℃60min，95℃10min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，95℃30s，54℃1min，45個循環(huán)，98℃10min，爬坡速度為1℃/s。在三周內(nèi)進(jìn)行檢測，每周檢測一次，計(jì)算組內(nèi)與組間檢測結(jié)果的變異系數(shù)(coefficientofvariation,cv)，判斷該方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

結(jié)果顯示三周內(nèi)組內(nèi)cv均小于4％，組間cv結(jié)果為1.75％，說明本方法具有良好的重復(fù)性(表1)

表1一步法rt-ddpcr檢測novgii穩(wěn)定性性分析

實(shí)施例7

果蔬病毒粒子洗脫及通過人工染毒樣品的病毒回收率進(jìn)行微滴數(shù)字pcr的實(shí)用性檢測

經(jīng)測序確定為諾如病毒gii型(norovirusgenegroupii，novgii)的糞便標(biāo)本加入pbs制成10％的便懸液，混勻，再用pbs依次稀釋至10^-3并命名為高、中、低濃度，用于后續(xù)的食品染毒，每濃度留200μl用作提取rna用，病毒核酸拷貝數(shù)的測定通過病毒rna試劑盒直接對3個稀釋度的糞便樣本進(jìn)行核酸提取，并用rt-ddpcr進(jìn)行檢測定量。

果蔬染毒：將生菜，草莓每份25g分裝，每份樣品中加入100μlgii型諾如病毒陽性糞便染毒液，點(diǎn)狀涂布于果蔬表面約20個點(diǎn)，并放于4℃干燥過夜以增加附著量，做高、中、低三個濃度(其中染毒用的高濃度糞便樣本核酸經(jīng)rt-ddpcr測定值為1.70*10⁴copies/μl，中濃度測定值為1725copies/μl，低濃度測定值為160copies/μl)，每個濃度做三個重復(fù)，同時準(zhǔn)備未染毒果蔬樣品作為陰性對照。

果蔬病毒粒子洗脫方法參考《gb4789.42-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)諾如病毒檢驗(yàn)》但修改為，1、將25g±0.3g果蔬樣品切成約2.5cm*2.5cm*2.5cm的小塊，裝入250ml錐形瓶中，加入40ml±1mltgbe溶液(對于水果還要額外加入1140ua.aculeatus果膠酶)，用錫紙蓋好瓶口。2、室溫250r/min，振蕩20min±1min。若ph低于9.0則需要用1mol/l的naoh調(diào)節(jié)至ph＝9.5±0.1。3、將振蕩液轉(zhuǎn)移至離心管，10000r/min，4±1℃離心30min±5min。取上清，用1mol/l的hcl調(diào)ph至7.0±0.5。4、加入1/3體積的4xpeg8000/nacl溶液，使終濃度為100g/lpeg8000，0.3mol/lnacl。60s搖勻，在4±1℃，200r/min頻率下振蕩60±5min。5、在4±1℃，10000r/min離心30min±5min。棄上清，再在4±1℃，10000r/min離心5±1min，緊實(shí)沉淀，棄上清。6、加入1000±10μlpbs進(jìn)行懸浮沉淀。取500±10μl的懸浮液在中加入氯仿/正丁醇溶液(1：1)，渦旋混合，室溫放置5±1min，于4±1℃、10000r/min離心15±1min。轉(zhuǎn)移上層水相到新離心管中。將得到的懸浮液和氯仿丁醇處理后的富集液放于－20℃保存準(zhǔn)備提取rna。

病毒rna核酸提?。河胵iagen公司的qiaampviralrnaminikit試劑盒進(jìn)行rna的提取。

提取的rna分別經(jīng)rt-ddpcr與rt-qpcr按照實(shí)施例5的條件進(jìn)行擴(kuò)增，未染毒樣品結(jié)果為陰性。根據(jù)不同染毒濃度和處理辦法在兩種檢測儀器上得出的回收率數(shù)據(jù)在spss22.0軟件中采用雙因素方差分析法進(jìn)行tukey差異顯著性方差分析，回收率結(jié)果見表2，表3及圖9，圖10。

表2rt-qpcr與rt-ddpcr對生菜不同染毒濃度和方法回收率計(jì)算結(jié)果對比

表3rt-qpcr與rt-ddpcr對草莓不同染毒濃度和方法回收率計(jì)算結(jié)果對比

^a：3個樣品中僅2個被檢出

從生菜的回收率結(jié)果中顯示，高、中濃度下，四種檢測方法沒有顯著性差異。低濃度下，未經(jīng)氯仿處理的qpcr(方法1)結(jié)果與另外三種方法均存在顯著性差異(p<0.05)。而各種濃度下，方法2與方法3與方法4之間沒有顯著性差異。

從草莓的回收率結(jié)果顯示，高濃度下，方法1與方法4存在顯著差異(p<0.05)。中濃度下，有經(jīng)過氯仿/丁醇處理的檢測方法均與沒有經(jīng)過氯仿/丁醇對應(yīng)的檢測方法有顯著差異(方法1與方法2，方法3與方法4)。于此同時，方法2與方法4沒有顯著差異。低濃度下，方法2與方法1有顯著差異，且使用ddpcr檢測的方法4與使用qpcr檢測的方法2存在顯著差異，但方法3與方法4沒有顯著差異。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>暨南大學(xué)

<120>一步法微滴數(shù)字pcr定量檢測果蔬中g(shù)ii型諾如病毒的方法

<130>1

<160>3

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>26

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>上游引物qnif2

<400>1

atgttcagrtggatgagrttctcwga26

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>下游引物cog2r

<400>2

tcgacgccatcttcattcaca21

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>探針qnifs

<220>

<221>fam修飾

<222>(1)..(1)

<220>

<221>bhq1修飾

<222>(20)..(20)

<400>3

agcacgtgggagggcgatcg20