本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體涉及一株解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

我國是世界上最大的梨果生產(chǎn)和出口國，2016年我國梨果總產(chǎn)量達(dá)到1930萬噸，占世界總產(chǎn)量的75％，出口量也逐漸超越歐盟和阿根廷成為世界最大的梨果出口國(孫平平與王文輝，2016)；但是我國梨園生產(chǎn)管理水平落后(張紹鈴，2013)，病害發(fā)生嚴(yán)重，農(nóng)藥殘留超標(biāo)(王田利，2015)，果實平均產(chǎn)量、品質(zhì)和價格顯著低于發(fā)達(dá)國家(王文輝等，2014)。隨著我國梨果產(chǎn)量的增加，提高果實品質(zhì)，增強樹體抗病性，減少病害發(fā)生和化學(xué)農(nóng)藥施用是實現(xiàn)梨產(chǎn)業(yè)減損、增收和增強國際競爭力的主要措施。

梨生產(chǎn)和儲藏過程中受到梨輪紋病、灰霉病、青霉病等多種病害的侵染，其中梨輪紋病是由葡萄座腔菌(botryosphaeriaberengeriana)引起，危害果實、枝干和葉片，病原菌b.berengeriana在幼果期從枝條或果實的皮孔或者傷口侵入，集中在采后40-60天發(fā)病(田路明等，2013)，每年造成果實減產(chǎn)約25％，嚴(yán)重時爛果率高達(dá)80％以上(王艷娜等，2008)，造成嚴(yán)重?fù)p失。

目前對梨果輪紋病的防治主要在幼果期、果實生長中期和采收前施用多菌靈、退菌特、乙磷鋁、甲基硫菌靈等有機磷殺菌劑和波爾多液等(馬廣民，2007)，但是化學(xué)藥劑的施用嚴(yán)重危害人類健康，污染環(huán)境，而且易引起病原菌的抗藥性，大量施用引起的農(nóng)藥殘留等問題嚴(yán)重限制了果品的安全和出口(ragsdale&sisler，1994)，因此迫切需要尋找一種高效且無公害的防治方法。

以有效微生物取代化學(xué)殺菌劑用于防治采后病害已顯示出巨大的應(yīng)用前景，植物病害生物防治的作用機制多樣，安全、環(huán)保，具有持效性和減少抗性產(chǎn)生等優(yōu)勢，成為替代化學(xué)防治的主要方法(cook,1993)。生防菌可以通過分泌抗性物質(zhì)、寄生作用、空間和營養(yǎng)競爭及誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性等方式抑制植物病害(palaniyandietal.，2013)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題為：如何提供一種能有效拮抗梨果病害的微生物，從而解決梨果病害嚴(yán)重以及化學(xué)藥劑防治引起的高殘留等問題。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：拮抗梨果病害的解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)l-1，為枯草芽孢桿菌屬，于2017年06月30日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為：cgmccno.14373。

菌株l-1或其代謝產(chǎn)物在防治輪紋病菌上的應(yīng)用。

菌株l-1或其代謝產(chǎn)物在防治梨黑斑病菌、灰霉病菌、褐腐病菌、青霉病菌上的應(yīng)用。

菌株l-1或其代謝產(chǎn)物在防治蘋果炭疽病菌和霉心病菌上的應(yīng)用。

菌株l-1或其代謝產(chǎn)物在增強梨的過氧化物酶、過氧化氫酶活性上的應(yīng)用。

菌株l-1或其代謝產(chǎn)物在降低梨丙二醛在果實內(nèi)積累的應(yīng)用。

菌株l-1或其代謝產(chǎn)物在梨保存過程中延緩果實衰老上的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

1、本發(fā)明分離鑒定出一株解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)l-1，研究結(jié)果顯示菌株l-1能夠有效抑制梨果輪紋病害的擴展，造成病原菌菌絲畸形，對梨果輪紋病以及蘋果與梨果常見真菌病害均具有顯著拮抗活性。

2、菌株l-1能誘導(dǎo)果實抗性相關(guān)酶(pod、cat)的活性表達(dá)，減少丙二醛在果實內(nèi)的積累，延緩果實衰老；l-1對果實品質(zhì)無損傷，而且能夠增加果實內(nèi)的vc含量；l-1可以在果實傷口中成功快速繁殖；菌株耐鹽，活性次生代謝產(chǎn)物活性穩(wěn)定，耐紫外照射、耐酸堿、高溫和金屬離子等，具有很大的應(yīng)用潛力。

3、l-1的推廣和應(yīng)用，將為減少梨果化學(xué)藥劑殘留，實現(xiàn)綠色、安全的果品生產(chǎn)提供更多的基礎(chǔ)。本發(fā)明的生防制劑在果實病害的生物防治中具有持效性、穩(wěn)定性、無污染、對人畜安全、無殘留、特異性強等特點，具有保護(hù)環(huán)境，維持生態(tài)平衡。

附圖說明

圖1為菌株l-1對輪紋病菌的皿內(nèi)拮抗活性實驗，其中，a為菌株l-1對輪紋病菌的皿內(nèi)拮抗及對其菌絲生長的影響，b為輪紋病菌的正常菌絲，c和d為菌株l-1引起輪紋病菌菌絲畸形；

圖2為菌株l-1對梨輪紋、青霉和灰霉病菌的拮抗活性；

圖3中a為菌株l-1的16srdna，b為gyra序列建立系統(tǒng)分類進(jìn)化樹，其中黑點表示菌株l-1的分類地位；

圖4為菌株l-1誘導(dǎo)梨果pod、cat酶活，減緩mda積累；

圖5為室溫儲藏過程中解淀粉芽孢桿菌l-1在梨果傷口的定植；

圖6為菌株l-1對梨果實硬度、可溶性固形物、vc和可滴定酸含量影響；

圖7為菌株l-1次生代謝產(chǎn)物在不同酸堿、紫外、高溫、金屬離子和蛋白酶降解酶作用活性。

具體實施方式

實施例1菌株的分離

2015年9月在遼寧省興城市采集梨樹的根際土壤，利用稀釋平板法(herr，1959)分離土壤中的細(xì)菌。稱取10g經(jīng)過干燥處理的土壤樣品進(jìn)行充分研磨，研磨后轉(zhuǎn)入含90ml無菌水的三角瓶中，4℃120r/min充分振蕩30min。在超凈工作臺內(nèi)將土壤樣品懸浮液逐級稀釋，吸取100ul稀釋液均勻涂布于nba(nutrientbrothagar)(3g牛肉膏,5g蛋白胨,2.5g葡萄糖,20g瓊脂粉，1l水)培養(yǎng)基上，32℃培養(yǎng)1d，挑取單個菌落在nba培養(yǎng)基上純化。純化后的90個單菌落轉(zhuǎn)入新的nba培養(yǎng)基中保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例2活性菌株篩選

采用平板對峙法(khamnaetal.，2009)測定分離到的90株細(xì)菌對梨輪紋病菌的抑制活性，具體操作如下：分別挑取在pda培養(yǎng)基上(potatodextroseagar)(6g馬鈴薯提取粉，20g葡萄糖，20g瓊脂粉，1l蒸餾水)培養(yǎng)5d，直徑6mm的輪紋病菌菌餅置于pda平板中央，在距離病原菌菌餅3cm的兩側(cè)打孔，扣掉培養(yǎng)基后接種在nba培養(yǎng)基上生長2d的待篩選細(xì)菌菌餅，置于25℃恒溫培養(yǎng)。每個處理重復(fù)3次，以不接種放線菌的平皿為對照，待對照菌落長滿平板時，觀察并記錄抑菌圈直徑。結(jié)果如圖1所示：菌株l-1對梨果輪紋病菌具有顯著的拮抗活性(圖1中的a)，抑菌圈制劑達(dá)到20mm以上。分別對對照的輪紋病菌菌絲與拮抗圈周圍的輪紋病菌菌絲進(jìn)行顯微鏡觀察，結(jié)果顯示，相對于對照菌絲(圖1中的b)，經(jīng)菌株l-1處理的菌絲表現(xiàn)出腫脹、畸形等(圖1中的c、d)。

實施例3活性菌株l-1對蘋果、梨常見果實采后病害的防治效果

利用牛津杯法測定l-1對梨黑斑病菌、灰霉病菌、褐腐病菌、青霉病菌，以及蘋果炭疽病菌和霉心病菌等梨果與蘋果常見果實病害的拮抗效果。將l-1菌株轉(zhuǎn)入100mlnb培養(yǎng)液中，28℃180r/min培養(yǎng)2d。在pda平板的中央接種待測病原菌菌餅，兩側(cè)放置滅菌的牛津杯，并在牛津杯中加入200ul的l-1發(fā)酵液，以加入不含l-1孢子的nb培養(yǎng)液為對照，25℃恒溫培養(yǎng)，每處理重復(fù)3次。待對照長滿皿測定病原菌生長直徑，利用(防效(％)＝(1-處理病斑直徑/對照病斑直徑)*100)計算防效。結(jié)果如表1所示，菌株l-1對梨黑斑病菌、灰霉病菌、褐腐病菌、青霉病菌，以及蘋果炭疽病菌和霉心病菌均具有顯著的拮抗活性，抑菌譜廣。

表1.菌株l-1對梨、蘋果常見6種果實病害的離體防效

實施例4菌株l-1對梨果病害的活體防效

參考sadeghian等(2016)的方法測定菌株l-1對梨輪紋病、青霉病和灰霉病菌的活體抑制活性，每個處理重復(fù)3次，每個重復(fù)6個果。首先，參照zhang等(2005)的方法對果實進(jìn)行表面消毒：將健康新鮮的黃冠梨果實放置于2％次氯酸鈉中浸泡3min，自來水沖洗后晾干。用無菌打孔器在梨果實赤道部兩側(cè)致5mm(直徑)×3mm(深)的傷口，然后將在nb培養(yǎng)基中150rpm，32℃培養(yǎng)2d的l-1孢懸液，用無菌水稀釋致1×10⁸cfu/ml的孢懸液，在每個傷口中加入30μl孢懸液，以致傷后加入同體積nb培養(yǎng)基的黃冠梨為對照。處理后的果實放置于鋪有紗布的塑料盒中，用保鮮膜密封，20℃保濕培養(yǎng)。在傷口上分別接種輪紋、灰霉和青霉病菌菌餅，繼續(xù)培養(yǎng)1d后揭掉病原菌菌餅，繼續(xù)保濕培養(yǎng)并測量病斑直徑。結(jié)果如圖2所示，接種l-1菌株能顯著抑制梨輪紋病、青霉病和灰霉病的病斑擴展，接種后11天對輪紋病的防治效果達(dá)到76.55％，接種后25天對青霉病菌的防治效果達(dá)到77.47％，接種9天后對灰霉病的防治效果達(dá)到92.88％。

實施例5菌株l-1的鑒定

對l-1的菌落培養(yǎng)特征、形態(tài)特征和對乳糖、半乳糖、木糖、麥芽糖、淀粉、葡萄糖和果糖的利用特性進(jìn)行觀察和評估，結(jié)果表明菌株l-1可能屬于細(xì)菌，能夠利用多種碳源。

按照ezup柱式細(xì)菌基因組dna提取試劑盒(sk8255)方法提取l-1總dna。采用通用引物27f(5’-agtttgatcmtggctcag-3’)/1492r(5’-ggttaccttgttacgactt-3’),andgyra-f(5’-cagtcaggaaatgcgtacgtcctt-3’)/gyra-r(5’-caaggtaatgctccaggcattgct-3’),分別擴增菌株的16srdna與gyra基因(戴蓬博等，2016)。25μlpcr反應(yīng)體系包括：premixtaq0.2μl、10×buffer2.5μl、引物各0.5μl、templatedna0.5μl，滅菌水補平至25μl。pcr反應(yīng)條件：94℃4min，35個擴增循環(huán)(94℃30s，54℃45s，72℃90s)，72℃10min。反應(yīng)結(jié)束后取5l反應(yīng)液用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用sanprep柱式dnaj膠回收試劑盒(sk8131)回收目的條帶，連接到p^topo-t質(zhì)粒上(aidlab)，轉(zhuǎn)入e.colidh5α(takarabioinc.)載體，經(jīng)過檢測為陽性后送交上海生工測序。使用vectorntiadvance11軟件將測序結(jié)果進(jìn)行校正和拼接，用blastn對拼接的序列進(jìn)行同源序列檢索，確定其分類地位，提交并存儲到genbank數(shù)據(jù)庫。采用dnastarlasergenemegalign分析序列間一致性。應(yīng)用mega5.0軟件，采用clustalw算法對序列進(jìn)行比對，用比鄰法(nj)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，校正值設(shè)定為1000，并以50％為閾值。結(jié)果顯示：菌株l-1與解淀粉芽孢桿菌聚到一支，基于16srdna構(gòu)建進(jìn)化樹顯示菌株l-1與解淀粉芽孢桿菌caub946(he617159)和fzb42(nr_075005)聚到一支，其同源性分別達(dá)到99.9％與99.7％(圖3中a)?；趃yra序列構(gòu)建進(jìn)化樹中菌株l-1與解淀粉芽孢桿菌kctc1660^t(af272015)聚到一支，其同源性達(dá)到99.8％(圖3中b)，因此菌株l-1被鑒定為解淀粉芽孢桿菌。

實施例6菌株l-1對果實pod、cat活性以及丙二醛含量的影響

參考zhang等(2016)的方法測定果實過氧化物酶peroxidase(pod)與過氧化氫酶catalase(cat)酶活性，以及丙二醛malondialdehyde(mda)含量。對黃冠梨進(jìn)行消毒、致傷，在傷口接種50μl濃度為1×10⁸cfuml^-1的l-1孢懸液或者無菌水，20℃保濕培養(yǎng)。于0(2h)、1、2、3、4和5d取傷口周圍1cm的梨果肉，液氮凍存后放置-80℃冰箱備用。以1s引起od值變化0.01的新鮮樣品量為pod和cat的1個酶活力單位(u)，結(jié)果用u·kg^-1s^-1表示，用μmol每kg鮮樣(μmol·kg^-1)表示丙二醛含量，每個測定重復(fù)3次。結(jié)果如圖4所示：相對于對照，l-1處理能夠顯著增加皇冠梨果實的pod與cat酶活性，在接種后3天分別達(dá)到對照的25.56倍與3倍，在接種后5天的活性仍高于對照。丙二醛的含量表示果實的衰老程度，在本研究中l(wèi)-1處理后果實的mda含量顯著低于對照處理(圖4中的c)。以上結(jié)果表明菌株l-1能顯著誘導(dǎo)果實抗性相關(guān)的pod、cat等酶活性，降低mda在果實體內(nèi)積累，延緩果實衰老。

實施例7菌株l-1在果實傷口中的定植

按照實例3的方法將皇冠梨果實消毒、打孔后加入30μl的l-1菌株孢懸液，20℃保濕培養(yǎng)。在接種后的0d(2h)、1d、2d、3d、4d、5d、6d分別利用7mm打孔器取傷口及周圍大約0.5g的果肉，無菌水研磨、稀釋到一定的濃度后，均勻涂在nba培養(yǎng)基上，32℃培養(yǎng)2d，計算克隆數(shù)。結(jié)果顯示菌株l-1在果實傷口中能快速繁殖，接種2h的數(shù)量為5.075×10⁶cfu，培養(yǎng)3d時增加到6.886×10⁸，4d時數(shù)量達(dá)到7.275×10⁸cfu，為接種時的101.8倍并且在儲藏中一直保持較高的數(shù)量，接種后6d的克隆數(shù)維持在6.933×10⁸cfu。如圖5所示。

實施例8菌株l-1對果實品質(zhì)的影響

參照zhangetal.(2008)的方法測定l-1對果實品質(zhì)指標(biāo)的影響，每次測定選取15個果。將經(jīng)表面消毒的‘皇冠梨’果實在含有l(wèi)-1孢懸液的培養(yǎng)基中浸泡30s，放置于20℃儲存，定期測定果實的硬度、可溶性固形物、可滴定酸和vc的含量。使用gs-15水果質(zhì)地分析儀測定果肉硬度，結(jié)果用kg·cm^-2表示。采用pr-101α折糖儀測定果實的可溶性固形物含量，結(jié)果用％表示。采用metrohm808titrando電位滴定儀測定果實的可滴定酸和vc含量，用naoh標(biāo)定可滴定酸，結(jié)果用％表示，利用2,6-二氯酚靛酚標(biāo)定果實中的vc含量，結(jié)果用mg·kg^-1鮮重表示。結(jié)果表明菌株l-1對果實的品質(zhì)無損害：果實硬度維持在4.90±0.42到5.49±0.48kg·cm^-2之間，可溶性固形物含量在9.85±0.70％到11.01±0.82％之間，另外l-1處理的皇冠梨果實vc含量高于對照處理，ta含量在0.075±0.001％與0.093±0.002％之間(圖6)。

實施例9菌株l-1的穩(wěn)定性評價

菌株穩(wěn)定性是保證其防效的基本前提，評估了活性生防菌l-1發(fā)酵液的穩(wěn)定性。將l-1置于nb培養(yǎng)基，以180r/min，28℃條件下培養(yǎng)48h。l-1菌株發(fā)酵液于8000rpm離心10min，取上清液過0.22um濾膜得到不含孢子發(fā)酵液。利用牛津杯法測定l-1發(fā)酵液的ph穩(wěn)定性、抗紫外、熱處理、金屬離子及蛋白酶降解的屬性，結(jié)果如圖7所示。

ph穩(wěn)定性：用naoh和hcl分別將l-1發(fā)酵液的ph值調(diào)為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12用牛津杯法測定活性變化；結(jié)果顯示菌株l-1發(fā)酵濾液的最適ph為6-7，其發(fā)酵液耐酸堿，在ph為12時其對病原菌的拮抗活性仍達(dá)到40％以上。

紫外線穩(wěn)定性：將l-1菌株發(fā)酵液放在功率20w紫外燈下垂直距離40cm處，分別照射10、20、30、40、50、60、90、120min后，以不經(jīng)紫外線照射的活性粗提物為對照，用牛津杯法測定活性變化；結(jié)果顯示紫外照射2h之內(nèi)對l-1發(fā)酵液的拮抗活性物顯著影響。

熱穩(wěn)定性：發(fā)酵液在40、50、60、70、80、90、100℃溫度下處理20min后，冷卻至室溫，并以室溫處理的為對照，用牛津杯法測定其活性變化；結(jié)果顯示高溫處理對l-1發(fā)酵液的活性物顯著影響。

不同金屬離子對化合物活性影響：將cacl2、znso4·7h2o,cuso4·5h2o、nacl、mgso4·7h2o、mncl2·4h2o、feso4·7h2o、kcl配成1mol/l溶液，在1000μl發(fā)酵液種加入100μl金屬離子溶液，配成0.1mol/l，震蕩混勻，37℃水浴處理1h。利用牛津杯法測定不同金屬離子對發(fā)酵液活性影響。結(jié)果顯示菌株l-1發(fā)酵液耐重金屬，其在0.1mol/l金屬離子中對病原菌的拮抗活性仍達(dá)到50％以上。

蛋白酶降解穩(wěn)定性：胰蛋白酶，胃蛋白酶，蛋白酶k配制成1mg/ml溶液，在37℃反應(yīng)1h，然后在80℃處理30min后立即4℃冷卻，測定其拮抗活性，結(jié)果顯示胰蛋白酶、胃蛋白酶與蛋白酶k處理對l-1發(fā)酵液產(chǎn)物的拮抗活性沒有影響，推測其活性化合物不屬于蛋白。

菌株l-1耐鹽性：在nb培養(yǎng)液中分別加入0.1、0.5、1、2、5、10％的nacl，將l-1轉(zhuǎn)入含不同濃度的含鹽培養(yǎng)液中，180r/min,28℃條件培養(yǎng)，600nm測定od值。結(jié)果顯示：菌株l-1在10％nacl中仍能生長，其菌株耐鹽。

以上結(jié)果說明了菌株l-1具有很好的環(huán)境適應(yīng)性和抗逆性，為其商品化生產(chǎn)奠定了良好的基礎(chǔ)。

實施例10菌株l-1凍干粉制備

將100μl保存在-80℃，20％甘油中的l-1轉(zhuǎn)入100ml的nb培養(yǎng)液中，180r/min，28℃條件下培養(yǎng)48h，形成l-1母液。取1ml母液轉(zhuǎn)入新的100mlnb培養(yǎng)液中，180r/min，28℃繼續(xù)培養(yǎng)2d，經(jīng)培養(yǎng)的l-1菌株4℃，6000rpm離心10min，收集沉淀，利用10％脫脂奶粉作為保護(hù)劑，真空冷凍干燥20h。凍干粉放入4℃保存。凍干粉保存6月后利用稀釋法測定孢子存活率，結(jié)果顯示菌株l-1的存活率仍達(dá)到91.25％。

結(jié)論：

本發(fā)明分離鑒定出一株解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)l-1，研究結(jié)果顯示菌株l-1能夠有效抑制梨果輪紋病害的擴展，造成病原菌菌絲畸形，對梨果輪紋病以及蘋果與梨果常見真菌病害均具有顯著拮抗活性，能誘導(dǎo)果實抗性相關(guān)酶(pod、cat)的活性表達(dá)，減少丙二醛在果實內(nèi)的積累，延緩果實衰老；l-1對果實品質(zhì)無損傷，而且能夠增加果實內(nèi)的vc含量；l-1可以在果實傷口中成功快速繁殖；菌株耐鹽，活性次生代謝產(chǎn)物活性穩(wěn)定，耐紫外照射、耐酸堿、高溫和金屬離子等，具有很大的應(yīng)用潛力。該l-1的推廣和應(yīng)用，將為減少梨果化學(xué)藥劑殘留，實現(xiàn)綠色、安全的果品生產(chǎn)提供更多的基礎(chǔ)。本發(fā)明的生防制劑在果實病害的生物防治中具有持效性、穩(wěn)定性、無污染、對人畜安全、無殘留、特異性強等特點，具有保護(hù)環(huán)境，維持生態(tài)平衡。

以上所述實施例僅表達(dá)了本申請的具體實施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對本申請保護(hù)范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本申請技術(shù)方案構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本申請的保護(hù)范圍。