本發(fā)明涉及一株貧營養(yǎng)低溫脫氮菌及其應用。

背景技術(shù)：

氮是自然界水體中一種常見的污染物，過度積累會造成水體富營養(yǎng)化，生態(tài)系統(tǒng)失衡等嚴重后果。傳統(tǒng)脫氮方法主要有物理、化學和生物法。相比于物理化學法，生物脫氮具有成本低，二次污染小，抗沖擊性能好等優(yōu)點。

在我國北方地區(qū)，特別是東北地區(qū)，由于冬季地表水水溫過低，不利于傳統(tǒng)脫氮菌的生長，而且由于地表水中c、n等營養(yǎng)物質(zhì)的貧瘠，更是對傳統(tǒng)生物法帶來了極大地難度。因此，篩選出高效的，能夠在低濃度營養(yǎng)物質(zhì)下進行低溫脫氮細菌，以及加強對低溫細菌的實際應用，對于北方地區(qū)低溫水體，特別是地表水，地下水等貧營養(yǎng)狀態(tài)下的微污染水體的治理，是十分必要的。

近年來，由于異養(yǎng)硝化好氧反硝化細菌的不斷發(fā)現(xiàn)，關(guān)于其較于傳統(tǒng)自養(yǎng)型細菌的優(yōu)勢也日趨得到關(guān)注，特別是其對于極端環(huán)境的適應能力，也不斷被研究者所發(fā)現(xiàn)。目前，關(guān)于低溫脫氮細菌的報道比較少，少數(shù)篩選出的低溫細菌也只針對于污水處理，并且溫度在處理4℃以上。因此篩選出能夠在低溫下，對地表水，地下水等水體進行生物處理的低溫脫氮菌株是具有重要的研究和實際應用價值的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是要解決現(xiàn)有脫氮菌不適宜于貧營養(yǎng)低溫水體的問題，提供了一株貧營養(yǎng)低溫脫氮菌及其應用。

本發(fā)明的一株貧營養(yǎng)低溫脫氮菌為紫色桿菌(janthinobacteriumsp.)m-11，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期是2017年07月03日，保藏編號為cgmccno.14380。

本發(fā)明的一株貧營養(yǎng)低溫脫氮菌的應用是指在貧營養(yǎng)低溫水體脫氮上的應用。

本發(fā)明從松花江水進行處理的中式反應器中填料中篩選出的高效耐低溫脫氮細菌janthinobacteriumsp.m-11，經(jīng)鑒定為革蘭氏陰性菌，兼性厭氧菌，生長溫度為2-35℃，最適溫度為25-30℃，菌體長度為1-1.5μm，寬度為0.5-1μm，呈短桿狀，無芽孢。菌落呈半徑為1-2mm白色半透明規(guī)則圓形，濕潤有光澤。

janthinobacteriumsp.m-11的dna提取采用ctab法。pcr擴增16srdna基因，采取16srdna基因的通用引物。pcr擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后直接進行雙向測序。將該序列輸入genbank,用blast軟件與數(shù)據(jù)庫序列進行比對分析，結(jié)果表明與janthinobacteriumsp.的16srdna序列相似性較高，為紫色桿菌屬。根據(jù)16srdna基因的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果分析以及生理生化特征，該細菌紫色桿菌屬(janthinobacterium)一株菌株。最終命名為紫色桿菌(janthinobacteriumsp.)m-11。

本發(fā)明采用對松花江水進行處理的中式反應器中填料所篩選出的高效耐低溫脫氮細菌janthinobacteriumsp.m-11，該菌株可在2℃條件下對以nh4⁺-n,no2^--n和no3^-n為唯一氮源的富營養(yǎng)水體分別進行脫氮處理。初始n濃度為5mg/l左右，接種濃度為4×10⁶cfu/ml，初始od600約為0.03，貧營養(yǎng)低溫脫氮菌janthinobacteriumsp.m-11可在2℃下生長，48小時氨氮去除率達到在90％以上，且沒有亞硝態(tài)氮和硝酸鹽態(tài)氮的積累；在2℃對亞硝酸鹽和硝酸鹽進行去除，去除率達80％以上，且亞硝酸鹽積累對該細菌沒有抑制作用，說明貧營養(yǎng)低溫脫氮菌janthinobacteriumsp.m-11相比其他菌種接種量更小，更適宜貧營養(yǎng)低溫水體的處理。

附圖說明

圖1為培養(yǎng)基中氨氮，硝酸鹽氮，亞硝酸鹽氮，總氮及細菌濃度隨時間的變化圖；其中a為氨氮濃度，b為總氮濃度，c為亞硝氮濃度，d為硝態(tài)氮濃度，e為細菌濃度；

圖2為以亞硝酸鈉為唯一氮源的反硝化培養(yǎng)基中硝酸鹽氮和亞硝酸鹽隨時間的變化圖；其中f為硝酸鹽，g為亞硝酸鹽；

圖3為以硝酸鈉為唯一氮源的反硝化培養(yǎng)基中硝酸鹽氮和亞硝酸鹽隨時間的變化圖；其中f為硝酸鹽，g為亞硝酸鹽；

圖4為不同ph下硝化培養(yǎng)基中氨氮濃度。

具體實施方式

具體實施方式一：本實施方式的一株貧營養(yǎng)低溫脫氮菌為紫色桿菌(janthinobacteriumsp.)m-11，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期是2017年07月03日，保藏編號為cgmccno.14380。

本實施方式從松花江水進行處理的中式反應器中填料中篩選出的高效耐低溫脫氮細菌janthinobacteriumsp.m-11，經(jīng)鑒定為革蘭氏陰性菌，兼性厭氧菌，生長溫度為2-35℃，最適溫度為25-30℃，菌體長度為1-1.5μm，寬度為0.5-1μm，呈短桿狀，無芽孢。菌落呈半徑為1-2mm白色半透明規(guī)則圓形，濕潤有光澤。

janthinobacteriumsp.m-11的dna提取采用ctab法。pcr擴增16srdna基因，采取16srdna基因的通用引物。pcr擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后直接進行雙向測序。將該序列輸入genbank,用blast軟件與數(shù)據(jù)庫序列進行比對分析，結(jié)果表明與janthinobacteriumsp.的16srdna序列相似性較高，為紫色桿菌屬。根據(jù)16srdna基因的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果分析以及生理生化特征，該細菌紫色桿菌屬(janthinobacterium)一株菌株。最終命名為紫色桿菌(janthinobacteriumsp.)m-11。

本實施方式采用對松花江水進行處理的中式反應器中填料所篩選出的高效耐低溫脫氮細菌janthinobacteriumsp.m-11，該菌株可在2℃條件下對以nh4⁺-n,no2^--n和no3^-n為唯一氮源的富營養(yǎng)水體分別進行脫氮處理。

具體實施方式二：本實施方式一株貧營養(yǎng)低溫脫氮菌的應用是指在貧營養(yǎng)低溫水體脫氮上的應用。

本實施方式貧營養(yǎng)低溫脫氮菌janthinobacteriumsp.m-11可在2℃下生長，48小時氨氮去除率達到在90％以上，且沒有亞硝態(tài)氮和硝酸鹽態(tài)氮的積累；在2℃對亞硝酸鹽和硝酸鹽進行去除，去除率達80％以上，且亞硝酸鹽積累對該細菌沒有抑制作用，說明貧營養(yǎng)低溫脫氮菌janthinobacteriumsp.m-11相比其他菌種接種量更小，更適宜貧營養(yǎng)低溫水體的處理。

具體實施方式三：本實施方式與具體實施方式二不同的是：貧營養(yǎng)低溫水體中低溫脫氮菌的投加量為4×10⁶cfu/ml。其他與具體實施方式二相同。

具體實施方式四：本實施方式貧營養(yǎng)低溫脫氮菌janthinobacteriumsp.m-11的篩選方法為：取穩(wěn)定運行的反應器中的填料，震蕩離心取上清液。采用稀釋平板涂布法進行分離，在2℃下，初始nh4⁺-n濃度為5mg/l，對分離出來的菌株置于培養(yǎng)基中進行nh4⁺-n去除實驗，對于nh4⁺-n去除率最高的菌株即為所需低溫脫氮菌株。具體菌種篩選步驟為:從運行穩(wěn)定的反應器中取得填料10g。放置于50ml離心管中加入30ml無菌水，震蕩均勻使細菌均勻分散至無菌水中。然后，從細菌懸浮液中取1ml接入裝有9ml無菌水的試管中，得到濃度為10¹梯度的細菌懸浮液，重復此步驟，依次得到菌種濃度為10²、10³…10⁷梯度的細菌懸浮液。然后采用平板涂布法，從各梯度的細菌懸浮液中取100μl放入平板培養(yǎng)基中進行2℃低溫培養(yǎng)，分別挑取不同形態(tài)，菌落清晰的典型菌落，在平板培養(yǎng)基上進行劃線分離，重復3-4次直至出現(xiàn)菌落特征一致的單一菌落。上述所有操作均在無菌條件下進行。

上述的平板培養(yǎng)基的成分為(g/l)：醋酸鈉1，氯化銨1，磷酸氫二鈉0.2，磷酸二氫鈉0.2，瓊脂18和2ml微量元素溶液。微量元素溶液成分(g/l)：氯化錳0.5，硫酸亞鐵0.5，硫酸鎂1，氯化鈣1，硫酸鋅0.5和氯化鈷0.2。

將初篩所得到的20株菌株分別加入到富集培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)，富集培養(yǎng)基的成分為(g/l):氯化銨0.4，醋酸鈉1，磷酸氫二鈉0.2，氯化鉀0.1和2ml微量元素溶液；微量元素溶液成分(g/l)：氯化錳0.5，硫酸亞鐵0.5，硫酸鎂1，氯化鈣1，硫酸鋅0.5和氯化鈷0.2。

取富集后的菌液離心，pbs溶液清洗三次后分別加入硝化培養(yǎng)基中，硝化培養(yǎng)基成分為(g/l)：氯化銨0.02，醋酸鈉0.09，磷酸氫二鈉0.02，氯化鉀0.01和1ml微量元素溶液；微量元素溶液成分(g/l)：氯化錳0.5，硫酸亞鐵0.5，硫酸鎂1，氯化鈣1，硫酸鋅0.5和氯化鈷0.2。

接種后的硝化培養(yǎng)基在2℃下進行培養(yǎng)并測量氨氮的去除效率，對氨氮去除效率最高的菌種進行鑒定。其主要生物學特性為革蘭氏陰性菌，菌體為短桿狀，菌落為規(guī)則乳白色半透明圓形。dna提取采用ctab法。pcr擴增16srdna基因，采取16srdna基因的通用引物。pcr擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后直接進行雙向測序。將該序列輸入genbank,用blast軟件與數(shù)據(jù)庫序列進行比對分析，結(jié)果表明與janthinobacteriumsp.的16srdna序列相似性較高，為紫色桿菌屬。根據(jù)16srdna基因的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果分析以及生理生化特征，該細菌紫色桿菌屬(janthinobacterium)一株菌株。最終命名為紫色桿菌(janthinobacteriumsp.)m-11。

對本實施方式的貧營養(yǎng)低溫脫氮菌janthinobacteriumsp.m-11在貧營養(yǎng)低溫水體脫氮上的功能性驗證：

試驗1、janthinobacteriumsp.m-11的低溫氨氮去除能力

將貧營養(yǎng)低溫脫氮菌janthinobacteriumsp.m-11在富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，接種于處于2℃下的硝化培養(yǎng)基中，接種后od600約為0.03，150rpm轉(zhuǎn)速好氧培養(yǎng)，測量培養(yǎng)基中氨氮，硝酸鹽氮，亞硝酸鹽氮，總氮及細菌濃度隨時間的變化，結(jié)果如圖1所示。

圖1中檢測結(jié)果顯示，該細菌可在2℃下生長，在48小時候去除率達到在90％以上，在氨氮降低的過程中，沒有亞硝態(tài)氮和硝酸鹽態(tài)氮的積累，說明該細菌能直接將氨氮轉(zhuǎn)化成氮氣等氣體。

試驗2、janthinobacteriumsp.m-11低溫反硝化性能

將貧營養(yǎng)低溫脫氮菌janthinobacteriumsp.m-11在富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，分別接種于以亞硝酸鈉和硝酸鈉為唯一氮源的反硝化培養(yǎng)基中，接種后od600約為0.03，150rpm轉(zhuǎn)速好氧培養(yǎng)，分別測量培養(yǎng)基中硝酸鹽氮和亞硝酸鹽隨時間的變化，結(jié)果如圖2和圖3所示。

圖2，3結(jié)果顯示該細菌可在2℃對亞硝酸鹽和硝酸鹽進行去除，去除率達80％以上，且亞硝酸鹽積累對該細菌沒有抑制作用，說明該細菌對于亞硝酸鹽有一定耐受性。

反硝化培養(yǎng)基成分為(g/l)：硝酸鈉0.03或亞硝酸鈉0.025，醋酸鈉0.09，磷酸氫二鈉0.02，氯化鉀0.01和1ml微量元素溶液。微量元素溶液成分(g/l)：氯化錳0.5，硫酸亞鐵0.5，硫酸鎂1，氯化鈣1，硫酸鋅0.5和氯化鈷0.2。

試驗3、janthinobacteriumsp.m-11的生長適宜ph

將貧營養(yǎng)低溫脫氮菌janthinobacteriumsp.m-11在富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，在2℃下分別接種于ph為5-10下的硝化培養(yǎng)基中，接種后od600約為0.03，150rpm轉(zhuǎn)速下好氧培養(yǎng)，24h后測量硝化培養(yǎng)基中氨氮濃度。所測定的數(shù)值為離心菌體后上清液的氨氮濃度，結(jié)果如圖4所示。

圖4中結(jié)果顯示該耐冷細菌在ph＝7顯示出最高的氨氮去除率(76.33％)，酸性條件能夠明顯抑制該細菌的低溫脫氮效果，堿性雖然在一定程度上抑制了該細菌的低溫脫氮效果，但是相比于酸性條件下，該細菌在堿性條件下依然能夠表達出一定的脫氮能力。

試驗1～3中的富集培養(yǎng)基的成分為(g/l):氯化銨0.4，醋酸鈉1，磷酸氫二鈉0.2，氯化鉀0.1和2ml微量元素溶液；微量元素溶液成分(g/l)：氯化錳0.5，硫酸亞鐵0.5，硫酸鎂1，氯化鈣1，硫酸鋅0.5和氯化鈷0.2。

硝化培養(yǎng)基成分為(g/l)：氯化銨0.02，醋酸鈉0.09，磷酸氫二鈉0.02，氯化鉀0.01和1ml微量元素溶液；微量元素溶液成分(g/l)：氯化錳0.5，硫酸亞鐵0.5，硫酸鎂1，氯化鈣1，硫酸鋅0.5和氯化鈷0.2。

由上述試驗可知，貧營養(yǎng)低溫脫氮菌janthinobacteriumsp.m-11相比其他菌種接種量更小，更適宜貧營養(yǎng)低溫水體的處理。

序列表

<110>哈爾濱工業(yè)大學

<120>一株貧營養(yǎng)低溫脫氮菌及其應用

<160>1

<210>1

<211>1457

<212>dna

<213>紫色桿菌（janthinobacteriumsp.）

<400>1

accggtggtagcgccctccttagcggttaagctacctacttctggtaaaacccgctccca60

tggtgtgacgggcggtgtgtacaagacccgggaacgtattcaccgcgacatgctgatccg120

cgattactagcgattccaacttcatgcagtcgagttgcagactacaatccggactacgat180

acactttctgcgattagctccccctcgcgggttggcggcgctctgtatgtaccattgtat240

gacgtgtgaagccctacccataagggccatgaggacttgacgtcatccccaccttcctcc300

ggtttgtcaccggcagtctcattagagtgccctttcgtagcaactaatgacaagggttgc360

gctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacagccatgcagcac420

ctgtgtactggttctctttcgagcactccctgatctctcaaggattccagccatgtcaag480

ggtaggtaaggtttttcgcgttgcatcgaattaatccacatcatccaccgcttgtgcggg540

tccccgtcaattcctttgagttttaatcttgcgaccgtactccccaggcggtctacttca600

cgcgttagctgcgttaccaagtcaattaagacccgacaactagtagacatcgtttagggc660

gtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgtgcatgagcgtcaat720

cttgacccagggggctgccttcgccatcggtgttcctccacatatctacgcatttcactg780

ctacacgtggaattctacccccctctgccagattctagccttgcagtctccaatgcaatt840

cccaggttgagcccggggatttcacatcagacttacaaaaccgcctgcgcacgctttacg900

cccagtaattccgattaacgcttgcaccctacgtattaccgcggctgctggcacgtagtt960

agccggtgcttattcttcaggtaccgtcattagcaagagatattagctctcaccgtttct1020

tccctgacaaaagagctttacaacccgaaggccttcttcactcacgcggcattgctggat1080

caggctttcgcccattgtccaaaattccccactgctgcctcccgtaggagtctggaccgt1140

gtctcagttccagtgtggctggtcgtcctctcagaccagctactgatcgatgccttggta1200

ggcttttaccctaccaactagctaatcagatatcggccgctccacgagcatgaggtcttg1260

cgatcccccactttcatccttagatcgtatgcggtattagcgtaactttcgctacgttat1320

cccccactctagggtacgttccgatatattactcacccgttcgccactcgccaccagagc1380

aagctccgtgctgccgttcgacttgcatgtgtaaggcatgccgccagcgttcaatctgag1440

ccagaatcaaaactctg1457