本發(fā)明涉及一種鑭化合物在促進細菌生長中的應用。

背景技術：

稀土元素具有特殊電子層結構及良好的光、電、磁性能，并有類似鈣的性質，生物學效應廣泛。單在影響細胞生長及機理方面，很多研究發(fā)現(xiàn)稀土元素具有低促高抑的特點，影響機理也很多樣。以植物細胞為例，有的研究認為稀土元素可以提高葉綠素a的含量和碳酸酐酶活性，能促進植物光合作用，從而促進植物生長；有的認為稀土元素可以穩(wěn)定細胞膜蛋白，改善細胞膜結構，促進細胞內外物質交換從而加速細胞生長和分裂；也有研究發(fā)現(xiàn)稀土元素可以促進線粒體代謝來加速植物生長。雖然許多學者對稀土元素的生理效應及機理進行了總結和綜述，提供了很好的參考，但還很不系統(tǒng)。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供鑭化合物在促進細菌生長中的應用，基于細胞壁的結構變化研究鑭化合物對大腸桿菌生長的影響，具體是以penicillin(青霉素)和lysozyme(溶菌酶)對細菌細胞壁作用靶點為參照，比濁法表征細菌的生長，紅外光譜法表征細菌細胞壁肽聚糖(3427cm^-1和1654cm^-1)和β-1,4糖苷鍵(890cm^-1)結構，掃描電鏡觀察菌體形態(tài)。

本發(fā)明提供了la(no3)3·6h2o在促進細菌繁殖中的應用。

所述la(no3)3·6h2o可以逆轉penicillin和lysozyme對所述細菌繁殖的抑制作用。

所述la(no3)3·6h2o可以保護所述細菌的結構。

所述la(no3)3·6h2o保護細菌的細胞壁肽聚糖結構和β-1,4糖苷鍵，進而促進所述細菌的繁殖；所述la(no3)3·6h2o可以逆轉penicillin和lysozyme對細菌細胞壁的破壞作用，增強細胞完整性起到促進細菌繁殖的目的；

所述細菌為大腸桿菌。

上述應用中，紅外光譜顯示penicillin使大腸桿菌細胞壁相應位點透過率下降，所述la(no3)3·6h2o使其透過率增加；lysozyme使相應位點透過率增加，所述la(no3)3·6h2o使其透過率下降或基本不變，表明la(no3)3·6h2o總是可以逆轉penicillin和lysozyme對大腸桿菌細胞壁的破壞作用，即所述la(no3)3·6h2o保護細菌的細胞壁肽聚糖結構和β-1,4糖苷鍵，這是la(no3)3·6h2o能夠促進細菌生長的原因之一。

本發(fā)明還更進一步提供了促進細胞繁殖的方法，包括如下步驟：

向細菌的培養(yǎng)基中添加所述鑭化合物；

所述鑭化合物的添加濃度可為5.0～200.0mg/l，具體可為10.0～50.0mg/l。

本發(fā)明以penicillin和lysozyme的作用靶點為參照，發(fā)現(xiàn)la(no3)3·6h2o可以逆轉penicillin的生理作用使細胞壁中相鄰多糖鏈交聯(lián)保護細胞壁肽聚糖，逆轉lysozyme的生理作用保護細胞壁β-1,4糖苷鍵，增強細胞完整性，促進細菌繁殖。

附圖說明

圖1為添加la(no3)3·6h2o和penicillin(1×10⁵iu/l)后e.coli的生長曲線。

圖2為添加la(no3)3·6h2o和lysozyme(0.5g/l)后e.coli的生長曲線。

圖3為la(no3)3·6h2o、penicillin和lysozyme處理后e.coli菌體結構的電鏡照片。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1、la(no3)3·6h2o對大腸桿菌的增殖作用

菌株大腸桿菌(escherichiacoli)，購自中國科學院微生物研究所菌種保藏中心。

水合硝酸鑭(la(no3)3·6h2o)、酵母膏、蛋白胨、氫氧化鈉、溶菌酶(lysozyme，均由國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn))。青霉素鈉(penicillin，華北制藥股份有限公司)。

掃描電鏡(s-4800，日本日立)、紫外可見分光光度計(uv-3600,日本島津)、高速冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)、恒溫恒濕振蕩培養(yǎng)箱(bs-4g,常州國華電器有限公司)、超聲波細胞粉碎機(jy92-2d，寧波新芝生物科技股份有限公司)、傅里葉紅外光譜儀(irprestige-21，日本島津)。

1、比濁法測定添加la(no3)3·6h2o、penicillin和lysozyme后細菌的生長狀況

配制牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，分別添加la(no3)3·6h2o濃度為5.0～200.0mg/l，高壓滅菌，將不同濃度penicillin(5×10⁴～2×10⁵iu/l)和lysozyme(0.5g/l)溶液膜過濾后加入，接入菌種培養(yǎng)(37℃，150r/min，12h)，每隔2h測一次菌懸液吸光度a600，繪制生長曲線。

2、結果與分析

掃描電鏡表征細菌形態(tài)結構：

取適量細菌發(fā)酵液，3000r/min離心10min，收集菌體沉淀，取適量菌體涂于蓋玻片上，干燥固定后，掃描電鏡觀察。

紅外光譜法表征細菌細胞壁結構：

取適量細菌發(fā)酵液，冰浴降溫至4℃，3000r/min離心10min，收集菌體沉淀；4℃生理鹽水洗滌3次后置于100℃沸水浴中滅活處理20min。將滅活菌體于冰浴中超聲處理10min(功率400w、間隔2s、破碎2min)后，1000r/min離心15min，去除沉淀，上清液再以10000r/min離心15min，收集沉淀即為細胞壁，將沉淀烘箱中干燥備用，溴化鉀壓片進行紅外光譜分析。

2.1、添加la(no3)3·6h2o、penicillin和lysozyme后細菌的生長狀況

細菌生長一般分為4個時期：遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期，對數(shù)期時細菌繁殖速度最快，呈對數(shù)級增長。以時間為橫軸，細胞濃度為縱軸，可以形象描述細菌生長的“s”形規(guī)律，即生長曲線，如圖1-圖2所示。實驗中稀土元素濃度均是5.0～200.0mg/l，penicillin濃度均是5×10⁴～2×10⁵iu/l。

圖1中，曲線1表示對照，曲線2表示青霉素(1×10⁵iu/l)+硝酸鑭(50mg/l)，曲線3表示青霉素(1×10⁵iu/l)+硝酸鑭(10mg/l)，曲線4表示青霉素(1×10⁵iu/l)。

圖2中，曲線1表示溶菌酶(0.5g/l)和硝酸鑭(40mg/l)，曲線2表示對照，曲線3表示溶菌酶(0.5g/l)和硝酸鑭(20mg/l)，曲線4表示溶菌酶(0.5g/l)和硝酸鑭(10mg/l)，曲線5表示溶菌酶(0.5g/l)。

圖1-圖2的曲線變化表明，由于penicillin和lysozyme破壞了細胞壁，抑制了e.coli的繁殖，而la(no3)3·6h2o可加速e.coli繁殖，逆轉penicillin和lysozyme對其增殖的抑制作用。

2.2、添加la(no3)3·6h2o、penicillin和lysozyme后細菌的菌體結構

細菌從形態(tài)上常見有球狀和桿狀，菌體微小，光學顯微鏡下難以觀察清楚；掃描電鏡(sem)具有較高的放大倍數(shù)(20～20萬倍)，并有很大的景深和視野，成像富有立體感，可直接觀察菌體表面凹凸不平的細微結構，如圖3所示，其中，圖片1表示對照，圖片2表示溶菌酶(0.5g/l)，圖片3表示青霉素(1×10⁵iu/l)，圖片4表示青霉素(1×10⁵iu/l)+硝酸鑭(50mg/l)，圖片5表示溶菌酶(0.5g/l)+硝酸鑭(40mg/l)。

如圖3所示的e.coli菌體結構的光纖維照片可以看出，與對照(圖片1)相比，lysozyme處理后(圖片2)菌體有的呈細條狀，比penicillin處理后(圖片3)更不規(guī)則，可能是由于e.coli屬于革蘭氏陰性菌，對penicillin不敏感，菌體形態(tài)變化沒有l(wèi)ysozyme處理后顯著；圖片4中菌體形態(tài)基本正常，也可能是這一原因。圖片5中菌體相對圖片2中形態(tài)更規(guī)則，未見明顯變形，更接近于對照，可見la(no3)3·6h2o對保護e.coli結構有一定作用。

2.3、la(no3)3·6h2o、penicillin和lysozyme對細菌細胞壁結構的影響

penicillin是細菌細胞壁合成時糖肽轉肽酶的抑制劑，可以抑制細胞壁中肽聚糖的合成；lysozyme可以水解肽聚糖主鏈上n-乙酰胞壁酸和n-乙酰葡萄糖胺之間的β-1,4糖苷鍵。本發(fā)明以這兩個作用位點為參照研究稀土元素對細菌細胞壁影響的具體機理。為了使相應位點的紅外光譜變化更加直觀，下表列出的是這些位點的紅外光譜透過率數(shù)值而非相應紅外曲線圖譜。

表1la(no3)3·6h2o、penicillin和lysozyme處理e.coli細胞壁紅外吸收透過率

依據(jù)文獻(張正奇.分析化學[m].第2版.北京:科學出版社,2006:265-294zhangzq.analyticalchemistry[m].2nd.beijing:sciencepress,2006:265-294)對各峰進行歸屬，890cm^-1歸屬于β-1,4糖苷鍵的特征吸收，3427cm^-1屬仲酰胺游離的n-h伸縮振動，1654cm^-1屬酰胺的c＝o伸縮振動，稱酰胺ⅰ峰。以上三個波數(shù)是肽聚糖重要的歸屬位點。

表1數(shù)據(jù)顯示penicillin使相應位點透過率下降，la(no3)3·6h2o使其透過率增加；lysozyme使相應位點透過率增加，la(no3)3·6h2o使其透過率下降或基本不變，表明la(no3)3·6h2o也總是可以逆轉penicillin和lysozyme對e.coli細胞壁的破壞作用。這與已經(jīng)公開的la(no3)3·6h2o對b.subtilis的作用規(guī)律一致：以la(no3)3·6h2o，penicillin和lysozyme處理b.subtilis細胞壁的研究發(fā)現(xiàn)，la(no3)3·6h2o對這三個位點的影響恰好與penicillin和lysozyme對這三個位點的影響相反，即penicillin使透過率均下降，la(no3)3·6h2o(100.0mg/l)使其升高，lysozyme使透過率均升高，la(no3)3·6h2o(160.0mg/l)使其下降，表明la(no3)3·6h2o總是可以逆轉penicillin和lysozyme對細胞壁的不利影響。所以無論是革蘭氏陽性菌還是陰性菌，la(no3)3·6h2o可以保護其細胞壁肽聚糖結構和β-1,4糖苷鍵是促進生長的原因之一。

3、結論

大多數(shù)細菌細胞壁都含有肽聚糖，肽聚糖由肽和聚糖兩部分組成，肽有四肽尾和肽橋兩種，聚糖則是由n-乙酰葡糖胺(nag)和n-乙酰胞壁酸(nam)兩種單糖相互間隔連接成長鏈，組成網(wǎng)格狀的肽聚糖分子，形成細胞壁包覆在整個細胞上。細胞壁結構的完整性會影響到細菌的生長，生活和生理狀態(tài)，因此penicillin通過抑制肽聚糖合成達到抑菌或殺菌效果，lysozyme通過水解細胞壁β-1,4糖苷鍵使細菌裂解。本發(fā)明以penicillin和lysozyme的作用靶點為參照，發(fā)現(xiàn)la(no3)3·6h2o可以逆轉penicillin的生理作用使細胞壁中相鄰多糖鏈交聯(lián)保護細胞壁肽聚糖，逆轉lysozyme的生理作用保護細胞壁β-1,4糖苷鍵，增強細胞完整性，促進細菌繁殖。