本發(fā)明涉及酶制劑領域，特別是涉及一種固定化漆酶及其制備方法。

背景技術：

酶的固定化是將酶結合在固體材料上或限制在一定空間內，仍能保持活力和特性，并且可以循環(huán)使用的一類技術。固定化酶的制備方法主要有四種：包埋法、交聯(lián)法、吸附法以及共價結合法。包埋法是指將酶分子包埋在多孔高分子材料的三維空間結構中使酶固定化，該方法制備工藝簡單，形成條件溫和并且對酶活性的影響較低，但是載體的孔徑大小會對酶促反應中各個物質的擴散產(chǎn)生影響。交聯(lián)法是利用交聯(lián)劑與氨基酸殘基反應形成共價鍵，使酶分子相互結合成網(wǎng)狀結構，從而達到酶固定化的效果。交聯(lián)法可以使固定化酶的穩(wěn)定性提高，使用壽命延長，但共價交聯(lián)減少了酶的反應位點，從而破壞了酶的活性。吸附法是指游離酶通過靜電作用或氫鍵等結合在載體上而制備固定化酶的方法，該方法具有可逆性、簡易性以及酶活力高等優(yōu)勢，但由于酶與載體的相互作用較弱，易于脫落。共價結合法是通過共價鍵結合的方法將酶固定在合適的載體上，酶與載體產(chǎn)生化學作用，結合力強，酶泄漏率低，具有較好的穩(wěn)定性和循環(huán)使用性能，但反應激烈，容易使酶活力損失。以上四種方法各有優(yōu)缺點，可以采用多種方法混合使用以提高固定化酶的使用品質。

漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，在自然界中分布于多種植物、真菌、少數(shù)昆蟲和細菌中，可以分為漆樹漆酶和真菌漆酶兩大類。漆酶能夠催化o-和p-聯(lián)苯酚、多酚、木質素、氨基苯酚、多胺、芳基二胺和特定的無機離子的氧化反應。漆酶已經(jīng)在多個領域有了廣泛的應用，例如紙漿漂白、紡織印染、以及有機污染物處理等。漆酶的活力會受到環(huán)境條件的影響，最適反應溫度為25℃到60℃；最適反應ph為2.2-2.8，同一種漆酶的作用底物的不同最適ph也有差異；反應過程中多種金屬離子也會影響漆酶的活性。將漆酶固定化后其可再用性、易回收性都有了顯著提高，可以有效的延長漆酶的使用壽命，降低使用成本。

中國專利cn201110247183.3公開了一種固定化漆酶，其以磁性介孔碳為載體，漆酶通過物理吸附作用固定于磁性介孔碳上，磁性介孔碳的孔道內嵌入有磁性納米顆粒，磁性介孔碳上的漆酶吸附量在140mg/g以上，固定化漆酶的酶活性回收率為60％～95％；該發(fā)明相應公開了該固定化漆酶的制備方法，包括以下步驟：先準備磁性介孔碳和漆酶溶液，漆酶溶液的濃度為0.3～1.0mg/ml，漆酶溶液的ph值為3.0～6.0；然后將磁性介孔碳加入至漆酶溶液中，在25℃～30℃的溫度下對該溶液振蕩3h以上；經(jīng)過后續(xù)處理得到固定化漆酶。該發(fā)明的固定化漆酶基于磁性介孔碳固定漆酶，使得漆酶具有優(yōu)異酶學性能。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種固定化漆酶及其制備方法，該固定化漆酶可以保持較高的活性，并且漆酶可以牢度的固定在載體上，并具有良好的穩(wěn)定性。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案：

一種固定化漆酶的制備方法，包括以下步驟：

(1)將硅酸乙酯滴加到鈦酸四丁酯的乙醇溶液中，劇烈攪拌，再滴加冰醋酸和無水乙醇的混合物，形成透明溶膠靜置60-72h，之后烘干后，研磨后在630℃條件下煅燒6h，制得sio2/tio2復合材料，將其抽真空后在硝酸銀溶液中浸漬36h，抽濾后，洗滌，干燥，研磨制得載銀sio2-tio2復合材料；

(2)將納米fe3o4分散于在卵磷脂的乙醇溶液中，在40-50℃條件下浸泡16-24h，之后離心分離改性納米fe3o4，烘干后，將改性納米fe3o4放入聚乙烯醇的水溶液中，加入步驟(1)制得的載銀sio2-tio2復合材料，檸檬酸，超聲分散3-4h，加入戊二醛攪拌混合均勻，調節(jié)ph為2-3，加熱至60-80℃反應4-6h，之后在室溫下靜置12-18h，用攪拌器打散，制得pva復合顆粒，水洗后備用；

(3)將液態(tài)漆酶和緩沖液加入到海藻酸鈉溶液中攪拌混合，控制溫度為30-40℃，調節(jié)ph值為3-7，加入步驟(2)制備的pva復合顆粒，超聲分散30-45min，降溫至3-8℃靜置12-24h，過濾后，用水清洗，冷藏保存。

優(yōu)選的，所述所述載銀sio2-tio2復合材料中sio2和tio2的質量比為5:2。

優(yōu)選的，所述步驟(2)中納米fe3o4和卵磷脂的質量比為3:1。

優(yōu)選的，所述步驟(2)中各組分的使用量為：

聚乙烯醇100份，改性fe3o410-15份，載銀sio2-tio2復合材料20-36份，檸檬酸10-22份，戊二醛5-9份。

優(yōu)選的，所述步驟(3)中海藻酸鈉溶液中的海藻酸鈉的濃度為7-9％；液態(tài)漆酶的活性為30u/ml；液態(tài)漆酶和海藻酸鈉溶液的使用量體積比1：9。

優(yōu)選的，所述步驟(3)中的緩沖液為磷酸鹽緩沖液

優(yōu)選的，所述步驟(3)中pva復合顆粒的使用量為15g/l。

一種固定化漆酶，由上述方法制備而成。

本發(fā)明具有以下有益效果，

制備納米級載銀sio2-tio2復合材料為介孔材料，具有較多的孔洞，可以有效的提高制備的pva復合顆粒的比表面積，使得該pva復合顆?？梢栽谄浔砻娣e吸附較多的漆酶。利用海藻酸鈉將漆酶包覆在pva復合顆粒上，有效的提高了酶在載體上的固定牢度，延長了固定化酶的使用壽命。在將漆酶固定在pva復合顆粒的處理過程中采用超聲處理，可以將酶充分的浸入到載體內部，提高載體的負載能力。

具體實施方式

為了更好的理解本發(fā)明，下面通過實施例對本發(fā)明進一步說明，實施例只用于解釋本發(fā)明，不會對本發(fā)明構成任何的限定。

實施例1

一種固定化漆酶的制備方法，包括以下步驟：

(1)將硅酸乙酯滴加到鈦酸四丁酯的乙醇溶液中，劇烈攪拌，再滴加冰醋酸和無水乙醇的混合物，形成透明溶膠靜置60h，之后烘干后，研磨后在630℃條件下煅燒6h，制得sio2/tio2復合材料，將其抽真空后在硝酸銀溶液中浸漬36h，抽濾后，洗滌，干燥，研磨制得載銀sio2-tio2復合材料，載銀sio2-tio2復合材料中sio2和tio2的質量比為5:2；

(2)將納米fe3o4分散于在卵磷脂的乙醇溶液中，納米fe3o4和卵磷脂的質量比為3:1，在40-50℃條件下浸泡16h，之后離心分離改性納米fe3o4，烘干后，將改性納米fe3o4放入聚乙烯醇的水溶液中，加入步驟(1)制得的載銀sio2-tio2復合材料，檸檬酸，超聲分散3h，加入戊二醛攪拌混合均勻，調節(jié)ph為2，加熱至60℃反應4h，之后在室溫下靜置12h，用攪拌器打散，制得pva復合顆粒，水洗后備用；

(3)將液態(tài)漆酶和磷酸鹽緩沖液加入到海藻酸鈉溶液中攪拌混合，控制溫度為30℃，調節(jié)ph值為3，加入步驟(2)制備的pva復合顆粒，使用量為15g/l，超聲分散30min，降溫至3-8℃靜置12h，過濾后，用水清洗，冷藏保存。

步驟(2)中各組分的使用量為：

聚乙烯醇100份，改性fe3o410份，載銀sio2-tio2復合材料20份，檸檬酸10份，戊二醛5份。

步驟(3)中海藻酸鈉溶液中的海藻酸鈉的濃度為7％；液態(tài)漆酶的活性為30u/ml；液態(tài)漆酶和海藻酸鈉溶液的使用量體積比1：9。

經(jīng)過測定，制備的固定化漆酶經(jīng)過20次反應后，酶活回收率為82％。

實施例2

一種固定化漆酶的制備方法，包括以下步驟：

(1)將硅酸乙酯滴加到鈦酸四丁酯的乙醇溶液中，劇烈攪拌，再滴加冰醋酸和無水乙醇的混合物，形成透明溶膠靜置72h，之后烘干后，研磨后在630℃條件下煅燒6h，制得sio2/tio2復合材料，將其抽真空后在硝酸銀溶液中浸漬36h，抽濾后，洗滌，干燥，研磨制得載銀sio2-tio2復合材料，載銀sio2-tio2復合材料中sio2和tio2的質量比為5:2；

(2)將納米fe3o4分散于在卵磷脂的乙醇溶液中，納米fe3o4和卵磷脂的質量比為3:1，在40-50℃條件下浸泡24h，之后離心分離改性納米fe3o4，烘干后，將改性納米fe3o4放入聚乙烯醇的水溶液中，加入步驟(1)制得的載銀sio2-tio2復合材料，檸檬酸，超聲分散4h，加入戊二醛攪拌混合均勻，調節(jié)ph為3，加熱至60-80℃反應6h，之后在室溫下靜置18h，用攪拌器打散，制得pva復合顆粒，水洗后備用；

(3)將液態(tài)漆酶和磷酸鹽緩沖液加入到海藻酸鈉溶液中攪拌混合，控制溫度為40℃，調節(jié)ph值為3-7，加入步驟(2)制備的pva復合顆粒，使用量為15g/l，超聲分散45min，降溫至8℃靜置24h，過濾后，用水清洗，冷藏保存。

步驟(2)中各組分的使用量為：

聚乙烯醇100份，改性fe3o415份，載銀sio2-tio2復合材料36份，檸檬酸22份，戊二醛9份。

步驟(3)中海藻酸鈉溶液中的海藻酸鈉的濃度為9％；液態(tài)漆酶的活性為30u/ml；液態(tài)漆酶和海藻酸鈉溶液的使用量體積比1：9。

經(jīng)過測定，制備的固定化漆酶經(jīng)過20次反應后，酶活回收率為85％。

實施例3

一種固定化漆酶的制備方法，包括以下步驟：

(1)將硅酸乙酯滴加到鈦酸四丁酯的乙醇溶液中，劇烈攪拌，再滴加冰醋酸和無水乙醇的混合物，形成透明溶膠靜置60h，之后烘干后，研磨后在630℃條件下煅燒6h，制得sio2/tio2復合材料，將其抽真空后在硝酸銀溶液中浸漬36h，抽濾后，洗滌，干燥，研磨制得載銀sio2-tio2復合材料，載銀sio2-tio2復合材料中sio2和tio2的質量比為5:2；

(2)將納米fe3o4分散于在卵磷脂的乙醇溶液中，納米fe3o4和卵磷脂的質量比為3:1，在50℃條件下浸泡16h，之后離心分離改性納米fe3o4，烘干后，將改性納米fe3o4放入聚乙烯醇的水溶液中，加入步驟(1)制得的載銀sio2-tio2復合材料，檸檬酸，超聲分散4h，加入戊二醛攪拌混合均勻，調節(jié)ph為2，加熱至60-80℃反應6h，之后在室溫下靜置12h，用攪拌器打散，制得pva復合顆粒，水洗后備用；

(3)將液態(tài)漆酶和磷酸鹽緩沖液加入到海藻酸鈉溶液中攪拌混合，控制溫度為30℃，調節(jié)ph值為7，加入步驟(2)制備的pva復合顆粒，使用量為15g/l，超聲分散30min，降溫至8℃靜置12h，過濾后，用水清洗，冷藏保存。

步驟(2)中各組分的使用量為：

聚乙烯醇100份，改性fe3o410份，載銀sio2-tio2復合材料36份，檸檬酸10份，戊二醛9份。

步驟(3)中海藻酸鈉溶液中的海藻酸鈉的濃度為7％；液態(tài)漆酶的活性為30u/ml；液態(tài)漆酶和海藻酸鈉溶液的使用量體積比1：9。

經(jīng)過測定，制備的固定化漆酶經(jīng)過20次反應后，酶活回收率為84％。

實施例4

一種固定化漆酶的制備方法，包括以下步驟：

(1)將硅酸乙酯滴加到鈦酸四丁酯的乙醇溶液中，劇烈攪拌，再滴加冰醋酸和無水乙醇的混合物，形成透明溶膠靜置68h，之后烘干后，研磨后在630℃條件下煅燒6h，制得sio2/tio2復合材料，將其抽真空后在硝酸銀溶液中浸漬36h，抽濾后，洗滌，干燥，研磨制得載銀sio2-tio2復合材料，載銀sio2-tio2復合材料中sio2和tio2的質量比為5:2；

(2)將納米fe3o4分散于在卵磷脂的乙醇溶液中，納米fe3o4和卵磷脂的質量比為3:1，在45℃條件下浸泡20h，之后離心分離改性納米fe3o4，烘干后，將改性納米fe3o4放入聚乙烯醇的水溶液中，加入步驟(1)制得的載銀sio2-tio2復合材料，檸檬酸，超聲分散4h，加入戊二醛攪拌混合均勻，調節(jié)ph為2，加熱至70℃反應5h，之后在室溫下靜置16h，用攪拌器打散，制得pva復合顆粒，水洗后備用；

(3)將液態(tài)漆酶和磷酸鹽緩沖液加入到海藻酸鈉溶液中攪拌混合，控制溫度為35℃，調節(jié)ph值為5，加入步驟(2)制備的pva復合顆粒，使用量為15g/l，超聲分散35min，降溫至3-8℃靜置18h，過濾后，用水清洗，冷藏保存。

步驟(2)中各組分的使用量為：

聚乙烯醇100份，改性fe3o412份，載銀sio2-tio2復合材料30份，檸檬酸15份，戊二醛7份。

步驟(3)中海藻酸鈉溶液中的海藻酸鈉的濃度為8％；液態(tài)漆酶的活性為30u/ml；液態(tài)漆酶和海藻酸鈉溶液的使用量體積比1：9。

經(jīng)過測定，制備的固定化漆酶經(jīng)過20次反應后，酶活回收率為82％。

實施例5

一種固定化漆酶的制備方法，包括以下步驟：

(1)將硅酸乙酯滴加到鈦酸四丁酯的乙醇溶液中，劇烈攪拌，再滴加冰醋酸和無水乙醇的混合物，形成透明溶膠靜置72h，之后烘干后，研磨后在630℃條件下煅燒6h，制得sio2/tio2復合材料，將其抽真空后在硝酸銀溶液中浸漬36h，抽濾后，洗滌，干燥，研磨制得載銀sio2-tio2復合材料，載銀sio2-tio2復合材料中sio2和tio2的質量比為5:2；

(2)將納米fe3o4分散于在卵磷脂的乙醇溶液中，納米fe3o4和卵磷脂的質量比為3:1，在40℃條件下浸泡24h，之后離心分離改性納米fe3o4，烘干后，將改性納米fe3o4放入聚乙烯醇的水溶液中，加入步驟(1)制得的載銀sio2-tio2復合材料，檸檬酸，超聲分散3h，加入戊二醛攪拌混合均勻，調節(jié)ph為3，加熱至60-80℃反應4h，之后在室溫下靜置18h，用攪拌器打散，制得pva復合顆粒，水洗后備用；

(3)將液態(tài)漆酶和磷酸鹽緩沖液加入到海藻酸鈉溶液中攪拌混合，控制溫度為40℃，調節(jié)ph值為3，加入步驟(2)制備的pva復合顆粒，使用量為15g/l，超聲分散45min，降溫至3-8℃靜置12h，過濾后，用水清洗，冷藏保存。

步驟(2)中各組分的使用量為：

聚乙烯醇100份，改性fe3o414份，載銀sio2-tio2復合材料33份，檸檬酸18份，戊二醛7份。

步驟(3)中海藻酸鈉溶液中的海藻酸鈉的濃度為9％；液態(tài)漆酶的活性為30u/ml；液態(tài)漆酶和海藻酸鈉溶液的使用量體積比1：9。

經(jīng)過測定，制備的固定化漆酶經(jīng)過20次反應后，酶活回收率為81％。