本發(fā)明屬于試劑盒
技術領域：
，尤其是涉及一種用于ins-1大鼠胰島細胞培養(yǎng)的試劑盒。
背景技術：
：細胞試劑盒既是培養(yǎng)細胞中供給細胞營養(yǎng)和促使細胞生殖增殖的基礎物質(zhì)，也是培養(yǎng)細胞生長和繁殖的生存環(huán)境。細胞試劑盒是人工模擬細胞在體內(nèi)生長的營養(yǎng)環(huán)境，是提供細胞營養(yǎng)和促進細胞生長增殖的物質(zhì)基礎。試劑盒主要包括天然細胞試劑盒、合成細胞試劑盒和無血清細胞試劑盒等。天然細胞試劑盒是人們早期采用的細胞試劑盒，直接取自于動物組織提取液或體液，如血漿凝塊、血清、淋巴液、胚胎浸出液等。營養(yǎng)價值高，但成分復雜，差異大、不穩(wěn)定，來源也受到限制。水解乳蛋白和膠原是兩種較好的天然試劑盒，富含氨基酸。血清是天然試劑盒中最有效和最常用的試劑盒，但其組成成分復雜，其中一些成分與功能不明確。合成細胞試劑盒是用化學成分明確的試劑配制的試劑盒，組分穩(wěn)定，主要包括糖類、必需氨基酸、維生素、無機鹽類等。自1950年199細胞試劑盒問世以來，合成細胞試劑盒發(fā)展至今已有幾十種，除了沿用半個世紀的基礎合成細胞試劑盒之外，近年來還出現(xiàn)了營養(yǎng)成分更加豐富的低血清細胞試劑盒。由于細胞種類和培養(yǎng)條件不同，適宜的合成細胞試劑盒也不同，在動物細胞培養(yǎng)中最常用基礎細胞試劑盒有6～7種，如bme、mem、dmem、hamf12、prmi1640、m199等。由于天然試劑盒的一些營養(yǎng)成分不能被合成細胞試劑盒完全代替，因此一般需在合成細胞試劑盒中添加5％～10％的小牛血清。小牛血清的加入對細胞培養(yǎng)非常有效，但小牛血清的成分復雜，這對培養(yǎng)產(chǎn)物的分離純化和檢測會帶來一定的不便，為減少小牛血清的影響，開發(fā)了營養(yǎng)成分更加豐富的低血清細胞試劑盒，可以將小牛血清的使用量降低到1～3％?，F(xiàn)有用于ins-1大鼠胰島細胞培養(yǎng)的試劑盒主要使用成分明確的prmi1640試劑盒，然而該試劑盒會導致細胞狀態(tài)下降、甚至是死亡；必須添加血清及其他的添加物才行；這些添加物的成分并不明確，未見專利論文報道且atcc并未收錄技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術的缺陷，目的在于提供了一種用于ins-1大鼠胰島細胞培養(yǎng)的試劑盒，該試劑盒細胞倍增時間更短、擴增效率高、收獲細胞量較常規(guī)培養(yǎng)方式更多且細胞的形態(tài)更為穩(wěn)定。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明取的技術方案如下：一種用于ins-1大鼠胰島細胞培養(yǎng)的試劑盒，所述試劑盒配方的組成為：prmi164培養(yǎng)基80％，氨基酸類2.5×10-5mol/l～1.1×10-3mol/l，維生素類3.7×10-9mol/l～1.9×10-4mol/l，谷胱甘肽3.0×10-6mol/l，無機鹽類4.0×10-4mol/l～1.03×10-1mol/l，d-葡萄糖1.1×10-2mol/l，其他化合物5.0×10-5mol/l～1.0×10-2mol/l，占試劑盒體積百分比為5％的胎牛血清；其中，所述其他化合物為酚紅1.3×10-5mol/l、hepes1.0×10-2mol/l、na-pyruvate1.0×10-3mol/l、2-mercaptoethanol5.0×10-5mol/l、igf-11.0×10-5mol/l和igf-21.0×10-5mol/l。優(yōu)選的，所述氨基酸為l-精氨酸1.1×10-3mol/l、l-天冬酰胺1.7×10-3mol/l、l-天冬氨酸1.5×10-4mol/l、l-半胱氨酸2.1×10-4mol/l、l-谷氨酸1.4×10-4mol/l、l-谷氨酰胺4.1×10-3mol/l、甘氨酸1.3×10-4mol/l、l-組氨酸9.7×10-5mol/l、l-羥脯胺酸1.5×10-4mol/l、l-異亮氨酸3.8×10-4、l-亮氨酸3.8×10-4、l-賴氨酸hcl2.2×10-4mol/l、l-甲硫氨酸1.0×10-4mol/l、l-苯丙氨酸9.1×10-5mol/l、l-脯氨酸1.7×10-4mol/l、l-絲氨酸2.9×10-4mol/l、l-蘇氨酸1.7×10-4mol/l、l-色氨酸2.5×10-5mol/l、l-酪氨酸1.1×10-4mol/l和l-纈氨酸1.7×10-4mol/l中的一種或多種。優(yōu)選的，所述維生素類為p-氨苯甲酸7.30×10-6mol/l、生物素8.20×10-7mol/l、氧化膽堿2.10×10-5mol/l、葉酸2.30×10-6mol/l、1-肌醇1.9×10-4mol/l、煙酰胺8.2×10-6mol/l、d-偏多酸鈣1.1×10-6mol/l、吡哆醇4.9×10-6mol/l、核黃素5.3×10-7mol/l、硫胺素3.0×10-6mol/l和維生素b123.7×10-9mol/l中的一種或多種。優(yōu)選的，所述無機鹽類為kcl5.3×10-3mol/l、mgso44.0×10-4mol/l、nacl1.03×10-1mol/l、nahco32.3×10-2mol/l、na2hpo45.6×10-3mol/l中的一種或多種。與現(xiàn)有的技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：本發(fā)明所提供的ins-1細胞試劑盒中添加了多種其他化合物，其中，酚紅為酸堿指示劑，ph對細胞的生長影響顯著、hepes為緩沖鹽，對細胞無毒且能平衡培養(yǎng)體系的ph、na-pyruvate是能源物質(zhì)為細胞提供能量、2-mercaptoethanol為強還原劑，能保護細胞免受氧化損傷、igf-1igf-2生長因子，能夠促進細胞增殖，因此，本發(fā)明試劑盒細胞倍增時間更短、擴增效率高、收獲細胞量較常規(guī)培養(yǎng)方式更多且細胞的形態(tài)更為穩(wěn)定。附圖說明：圖1本發(fā)明實施例1和對比例1-2不同培養(yǎng)體系ins-1細胞生長曲線圖；圖2本發(fā)明實施例1和對比例1-2不同培養(yǎng)體系培養(yǎng)ins-1細胞峰值圖；圖3本發(fā)明實施例1和對比例1-2不同培養(yǎng)體系ins-1細胞培養(yǎng)擴增倍數(shù)圖；圖4本發(fā)明實施例1和對比例1-2不同培養(yǎng)體系ins-1細胞細胞活率圖；圖5本發(fā)明實施例1和對比例1-2不同培養(yǎng)體系ins-1細胞克隆形成率圖。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。實施例1一種用于ins-1大鼠胰島細胞培養(yǎng)的試劑盒，所述試劑盒配方的組成為：l-精氨酸1.1×10-3mol/l，p-氨苯甲酸7.30×10-6mol/l，谷胱甘肽3.0×10-6mol/l，kcl5.3×10-3mol/l，d-葡萄糖1.1×10-2mol/l，酚紅1.3×10-5mol/l、hepes1.0×10-2mol/l、na-pyruvate1.0×10-3mol/l、2-mercaptoethanol5.0×10-5mol/l、igf-11.0×10-5mol/l和igf-21.0×10-5mol/l，占試劑盒體積百分比為5％的胎牛血清。實施例2一種用于ins-1大鼠胰島細胞培養(yǎng)的試劑盒，所述試劑盒配方的組成為：l-天冬酰胺1.7×10-3mol/l，生物素8.20×10-7mol/l，谷胱甘肽3.0×10-6mol/l，mgso44.0×10-4mol/l，nacl1.03×10-1mol/l，d-葡萄糖1.1×10-2mol/l，酚紅1.3×10-5mol/l，hepes1.0×10-2mol/l，na-pyruvate1.0×10-3mol/l，2-mercaptoethanol5.0×10-5mol/l，igf-11.0×10-5mol/l和igf-21.0×10-5mol/l，占試劑盒體積百分比為5％的胎牛血清。實施例3一種用于ins-1大鼠胰島細胞培養(yǎng)的試劑盒，所述試劑盒配方的組成為：l-天冬氨酸1.5×10-4mol/l、l-半胱氨酸2.1×10-4mol/l，氧化膽堿2.10×10-5mol/l，葉酸2.30×10-6mol/l，谷胱甘肽3.0×10-6mol/l，nacl1.03×10-1mol/l，nahco32.3×10-2mol/l，d-葡萄糖1.1×10-2mol/l，酚紅1.3×10-5mol/l，hepes1.0×10-2mol/l，na-pyruvate1.0×10-3mol/l，2-mercaptoethanol5.0×10-5mol/l，igf-11.0×10-5mol/l和igf-21.0×10-5mol/l，占試劑盒體積百分比為5％的胎牛血清。實施例4一種用于ins-1大鼠胰島細胞培養(yǎng)的試劑盒，所述試劑盒配方的組成為：l-組氨酸9.7×10-5mol/l，l-羥脯胺酸1.5×10-4mol/l，1-肌醇1.9×10-4mol/l，煙酰胺8.2×10-6mol/l，d-偏多酸鈣1.1×10-6mol/l，谷胱甘肽3.0×10-6mol/l，nahco32.3×10-2mol/l，na2hpo45.6×10-3mol/l，d-葡萄糖1.1×10-2mol/l，酚紅1.3×10-5mol/l，hepes1.0×10-2mol/l，na-pyruvate1.0×10-3mol/l，2-mercaptoethanol5.0×10-5mol/l，igf-11.0×10-5mol/l和igf-21.0×10-5mol/l，占試劑盒體積百分比為5％的胎牛血清。實施例5一種用于ins-1大鼠胰島細胞培養(yǎng)的試劑盒，所述試劑盒配方的組成為：l-脯氨酸1.7×10-4mol/l，l-絲氨酸2.9×10-4mol/l，l-蘇氨酸1.7×10-4mol/l，l-色氨酸2.5×10-5mol/l，l-酪氨酸1.1×10-4mol/l，吡哆醇4.9×10-6mol/l，核黃素5.3×10-7mol/l，硫胺素3.0×10-6mol/l，維生素b123.7×10-9mol/l，谷胱甘肽3.0×10-6mol/l，kcl5.3×10-3mol/l，na2hpo45.6×10-3mol/l，d-葡萄糖1.1×10-2mol/l，酚紅1.3×10-5mol/l，hepes1.0×10-2mol/l，na-pyruvate1.0×10-3mol/l，2-mercaptoethanol5.0×10-5mol/l，igf-11.0×10-5mol/l和igf-21.0×10-5mol/l，占試劑盒體積百分比為5％的胎牛血清。實施例6一種用于ins-1大鼠胰島細胞培養(yǎng)的試劑盒，所述試劑盒配方的組成為：l-蘇氨酸1.7×10-4mol/l，l-色氨酸2.5×10-5mol/l，p-氨苯甲酸7.30×10-6mol/l，1-肌醇1.9×10-4mol/l，煙酰胺8.2×10-6mol/l，谷胱甘肽3.0×10-6mol/l，kcl5.3×10-3mol/l，nahco32.3×10-2mol/l，na2hpo45.6×10-3mol/l，d-葡萄糖1.1×10-2mol/l，酚紅1.3×10-5mol/l，hepes1.0×10-2mol/l，na-pyruvate1.0×10-3mol/l，2-mercaptoethanol5.0×10-5mol/l，igf-11.0×10-5mol/l和igf-21.0×10-5mol/l，占試劑盒體積百分比為5％的胎牛血清。對比例1一種用于ins-1大鼠胰島細胞培養(yǎng)的試劑盒，所述試劑盒配方的組成為：l-精氨酸1.1×10-3mol/l，p-氨苯甲酸7.30×10-6mol/l，谷胱甘肽3.0×10-6mol/l，kcl5.3×10-3mol/l，d-葡萄糖1.1×10-2mol/l，占試劑盒體積百分比為5％的胎牛血清。對比例2對比例2為dmem+5％胎牛血清，其中dmem成分如下：注：絕大多數(shù)濃度采用摩爾濃度，并以科學計數(shù)法表示，如3.0e-2＝3.0×10-2＝30mmol/l。給出的分子質(zhì)量是母體化合物的分子質(zhì)量；雖然一些配方中使用相應鹽或含水化合物，但摩爾濃度仍是相同的同名及縮略詞：amp，腺苷單磷酸；生物素＝維生素h；鈣化醇＝維生素d2；fad，黃素腺嘌呤二核苷酸；硫辛酸；甲萘醌＝維生素k3；myo-肌醇＝1-肌醇；煙堿＝煙酰胺；煙堿酸＝煙酸；吡哆醇＝維生素b6；硫胺素＝維生素b1；α-生育酚＝維生素e；視黃醇＝維生素a1；tpn，三磷酸比多核苷酸；utp，尿苷三磷酸；維生素b12＝鈷胺素本發(fā)明對實施例1和對比例1-2的試劑盒進行性能試驗：(1)不同培養(yǎng)體系ins-1細胞生長曲線：以一萬個細胞接種于12孔細胞培養(yǎng)板(corning)，各方案各接種8孔，連續(xù)一周每天計數(shù)；將細胞計數(shù)結(jié)果繪制成曲線，見說明書附圖1；其中實施例1配方細胞數(shù)量從第三天開始明顯要高于對比例1與對比例2；(2)不同培養(yǎng)體系培養(yǎng)ins-1細胞峰值：以一萬個細胞接種于12孔細胞培養(yǎng)板(corning)，各方案各接種8孔，連續(xù)一周每天計數(shù)得出該培養(yǎng)體系的峰值，見說明書附圖2；其中實施例1配方明顯優(yōu)于對比例1與對比例2，實施例1的峰值明顯高于對比例1與對比例2；(3)不同培養(yǎng)體系ins-1細胞培養(yǎng)擴增倍數(shù)與倍增時間：見說明書附圖3：其中專利配方實施例1明顯優(yōu)于對比例1與對比例2，細胞的擴增倍數(shù)實施例1明顯高于對比例1與對比例2。表1：ins-1不同培養(yǎng)體系的細胞倍增時間各培養(yǎng)體系細胞倍增時間的計算方法依據(jù)2015版中國藥典的描述進行。按生長曲線計算細胞的倍增時間。取細胞峰值前一天的細胞計數(shù)(y)、接種細胞數(shù)(x)及生長時間(t)計算。倍增時間＝t/aa＝log2y/x(細胞的倍增時間不應超過20小時)其中專利配方實施例1明顯優(yōu)于對比例1與對比例2，實施例1倍增時間為14.55h明顯短于對比例1的18.13h與對比例2的37.43h。(4)不同培養(yǎng)體系ins-1細胞細胞活率：表2：ins-1不同培養(yǎng)體系的細胞活率培養(yǎng)體系1天2天3天4天5天6天7天實施例1細胞活率：100.0％99.8％99.6％99.4％98.7％98.2％95.6％對比例1細胞活率：100.0％98.2％97.7％97.6％96.1％95.1％92.5％對比例2細胞活率：100.0％85.6％72.1％61.8％54.2％27.5％19.5％由說明書附圖4與表2其中專利配方實施例1明顯優(yōu)于對比例1與對比例2，實施例1(專利配方+5％胎牛血清)的細胞活率在達到峰值之前一直保持在98％以上峰值后的活率下降十分緩慢，說明該培養(yǎng)體系十分適宜ins-1細胞的培養(yǎng)；對比例1(rpmi1640+5％胎牛血清)的細胞活率在達到峰值之前一直保持在95％以上峰值后的活率下降緩慢，該培養(yǎng)體系較適宜ins-1細胞的培養(yǎng)；對比例2(dmem+5％胎牛血清)的細胞活率很低且一直在下降峰值后的活率下降更為劇烈，該培養(yǎng)體系不適宜ins-1細胞的培養(yǎng)。(5)不同培養(yǎng)體系ins-1細胞克隆形成率克隆率形成率的測定依據(jù)2015版中國藥典，按有限稀釋法將細胞稀釋至每50ul全培含1個活細胞的濃度，按每孔1個細胞(50ul)接種于96孔細胞培板在顯微鏡下拍照，每板至少接種60孔，于37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)，定期觀察細胞克隆生長情況，培養(yǎng)1周后計數(shù)每孔中的細胞克隆數(shù)，在顯微鏡下拍照并計算克隆率，應不低于70％?？寺⌒纬陕剩絘/b×100％(式中a為細胞克隆數(shù)；b為接種細胞的總孔數(shù))由說明書附圖5其中專利配方實施例1明顯優(yōu)于對比例1與對比例2，實施例1(專利配方+5％胎牛血清)的克隆形成率為98.6％，說明該培養(yǎng)體系非常適宜ins-1細胞的克隆培養(yǎng)；對比例1(rpmi1640+5％胎牛血清)的克隆形成率為78％，說明該培養(yǎng)體系比較適宜ins-1細胞的克隆培養(yǎng)；對比例2(dmem+5％胎牛血清)的克隆形成率僅為1％，說明該培養(yǎng)體系不能用于ins-1細胞的克隆培養(yǎng)。應當指出，以上所述具體實施方式可以使本領域的技術人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。因此，本領域技術人員應當理解，仍然可以對本發(fā)明進行修改或者等同替換；而一切不脫離本發(fā)明的精神和技術實質(zhì)的技術方案及其改進，其均應涵蓋在本發(fā)明專利的保護范圍當中。當前第1頁12