本發(fā)明屬于海洋生物活性物質(zhì)制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從條斑紫菜干品中提取藻紅蛋白的方法。

背景技術(shù)：

藻紅蛋白(phycoerythrin)是許多海藻的重要捕光色素蛋白，主要出現(xiàn)于紅藻和部分藍(lán)藻中，是由脫輔基寡聚蛋白與開鏈的四吡咯發(fā)色團(tuán)共價(jià)結(jié)合而成，組成寡聚蛋白的亞基有α、β、γ等，通常紅藻中的藻紅蛋白是以(αβ)6γ的形式存在，結(jié)合在亞基半胱氨酸殘基上的色素分子有藻紅膽素和藻尿膽素。藻紅蛋白在可見光區(qū)的480～570nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)有較強(qiáng)的吸收，可產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光。

藻紅蛋白在經(jīng)過提取與純化后，成為具有高附加值的產(chǎn)品，可廣泛用于食品、化妝品、生物醫(yī)藥以及檢測(cè)劑等領(lǐng)域，有研究表明，藻紅蛋白可制成光敏劑應(yīng)用于腫瘤光動(dòng)力學(xué)治療。另外，藻紅蛋白也是一種重要的生理活性物質(zhì)，具有抗腫瘤，抗病毒，增強(qiáng)免疫力等多種藥理作用，極具研究?jī)r(jià)值。

紫菜是一種生長(zhǎng)于淺海巖石上的藻類植物，素有“巖礁嬌子”之稱，紫菜是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)栽培海藻之一，年銷售額達(dá)7億元，且紫菜含有豐富的藻紅蛋白，因此紫菜是獲取藻紅蛋白的理想資源。新鮮紫菜含水量高，貯藏難度大，因此其干燥制品是目前常見的銷售和保存的形式。而目前的研究多針對(duì)從鮮紫菜中提取藻紅蛋白，對(duì)于從紫菜干品中提取藻紅蛋白的研究較少。因此，充分利用紫菜干品作為藻紅蛋白提取來源將極大地提高藻紅蛋白的產(chǎn)量，建立完善的提取方法是十分必要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種從條斑紫菜干品中提取藻紅蛋白的方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為：

一種從條斑紫菜干品中提取藻紅蛋白的方法：

(1)將條斑紫菜干品用粉碎機(jī)攪碎，過80目篩；

(2)將上述所得的條斑紫菜粉末與磷酸鹽緩沖液按1:10～1:40(質(zhì)量/體積)的比例混勻；

(3)將上述條斑紫菜懸浮液反復(fù)凍融3～6次，在冰水浴下采用超聲細(xì)胞破碎機(jī)中超聲處理，得到細(xì)胞破碎液；

(4)將上述所得破碎液在8000g～10000g下離心10min～20min，收集上清液；

(5)向上述所得上清液中加入40％～50％的硫酸銨，放置12～24h，在8000g～10000g下離心10min～20min，收集上清液；

(6)將所得上清液透析并冷凍干燥，即得藻紅蛋白。

所述步驟(2)中的磷酸鹽緩沖液的ph為7.0，濃度為0.01mol/l～0.1mol/l。

所述步驟(3)中一次凍融為置于-20℃冷凍過夜，而后再于室溫下解凍。

所述步驟(3)中超聲處理?xiàng)l件為：200w～600w，工作10s，暫停10s，共2～10min。

所述步驟(6)中透析過程的截留分子量為3.5kda。

采用紫外分光光度計(jì)對(duì)上述蛋白進(jìn)行測(cè)定，藻紅蛋白提取液在280nm、617nm、560nm和650nm下的吸光度，根據(jù)下式計(jì)算得率和純度：

其中，ρpe＝0.123a560-0.068a617+0.015a650，vpe為提取液體積(ml)，mpe為條斑紫菜質(zhì)量(g)。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明提供一種從紫菜干品中提取藻紅蛋白的方法，該方法簡(jiǎn)單易行，成本低廉，提取過程只采用水作為提取溶劑，對(duì)環(huán)境友好，所制備的藻紅蛋白純度和得率高，該方法可為紫菜干品的開發(fā)利用提供思路。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)例中所制備的藻紅蛋白在不同ph環(huán)境下在560nm處的吸光度。

圖2為本發(fā)明實(shí)例中藻紅蛋白在不同溫度下保存1h之后在560nm處的吸光度。

圖3為本發(fā)明實(shí)例中藻紅蛋白在光照下保存不同時(shí)間之后在560nm處的吸光度。

具體實(shí)施例

下面結(jié)合說明書附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，并且本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅局限于以下實(shí)施例。

實(shí)施例1

1)取10g條斑紫菜干品，采用粉碎機(jī)粉碎，過80目篩，備用。

2)取0.5g條斑紫菜粉末，加入15ml0.1m的磷酸鹽緩沖液(ph7.0)懸浮，在-20℃條件下過夜冰凍，然后室溫下解凍為一次凍融過程，反復(fù)凍融三次。而后冰浴下，以600w的功率破碎細(xì)胞，以超聲10s，間歇10s的方式進(jìn)行處理2min。將得到的藻體破碎液以8000g離心15min，離心重復(fù)兩次，收集上清液；

3)藻膽蛋白粗提液使用50％(w/v)的硫酸銨進(jìn)行沉淀靜置過夜。在4℃下以8000g離心15分鐘，取沉淀?xiàng)壣锨?。加水溶解沉淀，透?截留量3500da)，除去硫酸銨，透析冷凍干燥，即得藻紅蛋白。

所得的藻紅蛋白純度為1.08，得率為0.83％。

檢測(cè)所得的藻紅蛋白在不同環(huán)境下的穩(wěn)定性：

1)ph穩(wěn)定性

取藻紅蛋白提取液6份，每份2ml，用0.1mol/l的hcl或0.1mol/l的naoh調(diào)節(jié)ph＝2.0、5.0.6.0、7.0、7.0、9.0、11.0，并且在10min之內(nèi)測(cè)定各溶液在560nm處的od值，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明藻紅蛋白在ph為5.0環(huán)境下的穩(wěn)定性最高。

2)金屬離子穩(wěn)定性

取cacl2、znso4、mgso4、al(no3)3、cuso4、nacl、kcl，配制成濃度為0.01mol/l的水溶液，吸取每種金屬離子溶液0.5ml，分別加入0.5ml藻紅蛋白提取液中，搖勻，放置24h后，稀釋，測(cè)定各溶液在560nm處的od值。

表1金屬離子穩(wěn)定性結(jié)果

由表1結(jié)果表明藻紅蛋白保存時(shí)應(yīng)避免與cu²⁺、al³⁺、k⁺、mg²⁺、zn²⁺等離子接觸。

3)溫度穩(wěn)定性

取藻紅蛋白提取液6份，每份1ml，分別在4℃、30℃、40℃、50℃、60℃下放置1h，待冷卻后，稀釋，測(cè)定各溶液在560nm處的od值，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明藻紅蛋白在4℃條件下最穩(wěn)定。

4)氧化還原穩(wěn)定性

取藻紅蛋白提取液6份，每份0.5ml，分別加入濃度0.01mol/l的k2cr2o7、na2so3、na2s2o3、feso4、草酸、kmno4溶液0.5ml，搖勻，放置24h后，稀釋，測(cè)定各溶液在560nm處的od值。

表2氧化還原穩(wěn)定性結(jié)果

由表2結(jié)果表明不同的氧化還原劑對(duì)藻紅蛋白的穩(wěn)定性均有較大的影響，藻紅蛋白的保存過程應(yīng)避免與氧化還原劑相接觸。

5)光照穩(wěn)定性

取藻紅蛋白提取液5份，每份1ml，取一份避光放置，其他樣品在光照培養(yǎng)箱中放置在2h、4h、6h、8h，稀釋，測(cè)定各溶液在560nm處的od值，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明藻紅蛋白在光照下不穩(wěn)定，應(yīng)在暗處保存。

實(shí)施例2

1)取10g條斑紫菜干品，采用粉碎機(jī)粉碎，過80目篩，備用。

2)取0.5g條斑紫菜粉末，加入15ml0.1m的磷酸鹽緩沖液(ph7.0)懸浮，在-20℃條件下過夜冰凍，然后室溫下解凍為一次凍融過程，反復(fù)凍融三次。冰浴下，以600w的功率破碎細(xì)胞，以超聲10s，間歇10s的方式進(jìn)行處理2min。將得到的藻體破碎液以8000g離心15min，離心重復(fù)兩次，收集上清液；

3)藻膽蛋白粗提液使用50％(w/v)的硫酸銨進(jìn)行沉淀靜置過夜。在4℃下以8000g離心15分鐘，取沉淀?xiàng)壣锨?。加水溶解沉淀，透?截留量3500da)，除去硫酸銨，透析冷凍干燥，即得藻紅蛋白。

所得的藻紅蛋白純度為1.09，得率為0.84％。

實(shí)施例3

1)取10g條斑紫菜干品，采用粉碎機(jī)粉碎，過80目篩，備用。

2)取0.5g條斑紫菜粉末，加入15ml0.1m的磷酸鹽緩沖液(ph7.0)懸浮，在-20℃條件下過夜冰凍，然后室溫下解凍為一次凍融過程，反復(fù)凍融三次。冰浴下，以600w的功率破碎細(xì)胞，以超聲10s，間歇10s的方式進(jìn)行處理2min。將得到的藻體破碎液以8000g離心15min，離心重復(fù)兩次，收集上清液；

3)藻膽蛋白粗提液使用50％(w/v)的硫酸銨進(jìn)行沉淀靜置過夜。在4℃下以8000g離心15分鐘，取沉淀?xiàng)壣锨?。加水溶解沉淀，透?截留量3500da)，除去硫酸銨，透析冷凍干燥，即得藻紅蛋白。

所得的藻紅蛋白純度為1.05，得率為1.04％。