本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種鑒別肝螺桿菌的熒光定量pcr方法和熒光定量pcr試劑盒。

背景技術(shù)：

肝螺桿菌屬于螺桿菌屬，長(zhǎng)約為1.5～5μm，呈革蘭氏陰性，氧化酶、過(guò)氧化氫酶和尿素酶陽(yáng)性。2003年，肝螺桿菌全基因組序列公布，全長(zhǎng)1799146bp，與幽門(mén)螺桿菌和空腸彎曲桿菌的同源性為50％左右。肝螺桿菌的分離培養(yǎng)條件嚴(yán)格，需要在微需氧環(huán)境中生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)要求嚴(yán)苛、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，這些培養(yǎng)特性制約了肝螺桿菌的分離和鑒定。pcr方法是這類生長(zhǎng)環(huán)境苛刻菌株首選的檢測(cè)方法，在螺桿菌屬和種水平上的高特異性和敏感性的pcr檢測(cè)方法已經(jīng)普遍用于嚙齒類螺桿菌的檢測(cè)中。如常規(guī)pcr的檢測(cè)條件為：pcr反應(yīng)體系為：10μm的上游引物1μl，10μm的下游引物1μl，taqmix10μl，基因組dna1μl，ddh2o7μl；反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸15s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。雖然采用常規(guī)pcr檢測(cè)方法在一定程度上提高了檢測(cè)肝螺桿菌的敏感性，但在靈敏度上仍存在不足。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，而提供一種鑒別肝螺桿菌的熒光定量pcr方法，熒光定量pcr在反應(yīng)體系中加入與dna雙鏈結(jié)合的熒光染料，通過(guò)熒光信號(hào)的改變，實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀能夠靈敏的分析pcr擴(kuò)增的變化，提高檢測(cè)結(jié)果的靈敏度。

本發(fā)明提供了一種鑒別肝螺桿菌的熒光定量pcr方法，將包含有pcr引物的反應(yīng)體系進(jìn)行熒光定量pcr反應(yīng)；

所述pcr引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如seqidno.2所示；

所述反應(yīng)體系每20μl包括以下組分：10μm的上游引物0.8μl，10μm的下游引物0.8μl，sybrpremixextaqⅱ10μl，roxreferencedyeⅱ0.4μl，樣品dna模版1μl，ddh2o7μl；

所述熒光定量pcr反應(yīng)的程序包括：95℃預(yù)變性30s，95℃5s，52℃30s，72℃30s，40個(gè)循環(huán)，95℃15s，60℃1min，95℃15s；

當(dāng)ct值小于33時(shí)，檢測(cè)出肝螺桿菌，當(dāng)ct值大于等于33時(shí)，未檢測(cè)出肝螺桿菌。

本發(fā)明還提供了一種熒光定量pcr試劑盒，包括：上游引物、下游引物、sybrpremixextaqii、roxreferencedyeii和陽(yáng)性質(zhì)控品；

所述上游引物的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如seqidno.2所示。

優(yōu)選的，所述上游引物的體積為200～600μl，下游引物的體積為200～600μl，sybrpremixextaqii的體積為3～7ml，roxreferencedyeii的體積為100～300μl，陽(yáng)性質(zhì)控品的體積為1～3ml。

優(yōu)選的，所述上游引物的濃度為10μm；

所述下游引物的濃度為10μm。

本發(fā)明實(shí)施例的結(jié)果顯示：采用本發(fā)明的熒光定量pcr方法，最低檢測(cè)限為5拷貝/μl，采用常規(guī)pcr方法，最低檢測(cè)限為5.0×10³拷貝/μl，與常規(guī)pcr方法相比，靈敏度提高了1000倍。

附圖說(shuō)明

圖1：2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)普通pcr引物特異性結(jié)果，條帶大小為183bp，1為肝螺桿菌陽(yáng)性樣品，2為膽螺桿菌陰性對(duì)照，3為嚙齒類螺桿菌陰性對(duì)照，4為空白對(duì)照，m為dl2000marker；

圖2：2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)普通pcr敏感性結(jié)果，m為dl2000marker，1為5.0×10⁹拷貝/μl，2為5.0×10⁸拷貝/μl，3為5.0×10⁷拷貝/μl，4為5.0×10⁶拷貝/μl，5為5.0×10⁵拷貝/μl，6為5.0×10⁴拷貝/μl，7為5.0×10³拷貝/μl，8為5.0×10²拷貝/μl，9為50拷貝/μl，10為5.0拷貝/μl，11為0.5拷貝/μl，12為空白對(duì)照；

圖3：熒光pcr溶解曲線分析圖；

圖4：熒光pcr擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線，1為5.0×10⁸拷貝/μl，2為5.0×10⁷拷貝/μl，3為5.0×10⁶拷貝/μl，4為5.0×10⁵拷貝/μl，5為5.0×10⁴拷貝/μl，6為5.0×10³拷貝/μl，7為500拷貝/μl；

圖5：熒光pcr標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，1為5.0×10²拷貝/μl，2為5.0×10³拷貝/μl，3為5.0×10⁴拷貝/μl，4為5.0×10⁵拷貝/μl，5為5.0×10⁶拷貝/μl，6為5.0×10⁷拷貝/μl，7為5.0×10⁸拷貝/μl；

圖6：熒光pcr靈敏度檢測(cè)結(jié)果，1為5.0×10⁸拷貝/μl，2為5.0×10⁷拷貝/μl，3為5.0×10⁶拷貝/μl，4為5.0×10⁵拷貝/μl，5為5.0×10⁴拷貝/μl,6為5.0×10³拷貝/μl，7為5.0×10²拷貝/μl，8為5.0×10¹拷貝/μl，9為5.0×10⁰拷貝/μl，10為空白對(duì)照；

圖7：熒光pcr特異性檢測(cè)結(jié)果，1為陽(yáng)性樣品，2為膽螺桿菌陰性對(duì)照，3為嚙齒類螺桿菌陰性對(duì)照，4為空白對(duì)照；

圖8：熒光pcr樣品檢測(cè)結(jié)果，1為陽(yáng)性對(duì)照，2～14為樣品，15為空白對(duì)照。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了一種鑒別肝螺桿菌的熒光定量pcr方法，其特征在于，將包含有pcr引物的反應(yīng)體系進(jìn)行熒光定量pcr反應(yīng)；所述pcr引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如seqidno.2所示；所述反應(yīng)體系每20μl包括以下組分：10μm的上游引物0.8μl，10μm的下游引物0.8μl，sybrpremixextaqⅱ10μl，roxreferencedyeⅱ0.4μl，樣品dna模版1μl，ddh2o7μl；所述熒光定量pcr反應(yīng)的程序包括：95℃預(yù)變性30s，95℃5s，52℃30s，72℃30s，40個(gè)循環(huán)，95℃15s，60℃1min，95℃15s；當(dāng)ct值小于33時(shí)，檢測(cè)出肝螺桿菌，當(dāng)ct值大于等于33時(shí)，未檢測(cè)出肝螺桿菌。

在本發(fā)明中，將包含有pcr引物的反應(yīng)體系進(jìn)行熒光定量pcr反應(yīng)。

在本發(fā)明中，所述pcr引物優(yōu)選根據(jù)genbank提供的cdtb基因序列，使用primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)得到，所述cdtb基因序列的序列號(hào)為af163667.1。在本發(fā)明中，所述cdtb基因?yàn)楦温輻U菌的毒力基因。

在本發(fā)明中，所述pcr引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列為：5'-tgcagcacctgttttcaag-3'；

所述下游引物的核苷酸序列為：5'-acactccagagtaacagttt-3'。

在本發(fā)明中，所述反應(yīng)體系每20μl包括以下組分：10μm的上游引物0.8μl，10μm的下游引物0.8μl，sybrpremixextaqⅱ10μl，roxreferencedyeⅱ0.4μl，樣品dna模版1μl，ddh2o7μl。本發(fā)明對(duì)上述試劑的來(lái)源沒(méi)有特殊限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)選用的市售產(chǎn)品即可。

本發(fā)明優(yōu)選采用ddh2o將上游引物和下游引物進(jìn)行稀釋。

在本發(fā)明中，所述樣品dna模版的來(lái)源優(yōu)選包括：采用常規(guī)dna提取方法從菌種、動(dòng)物肝組織、動(dòng)物糞便或腸道內(nèi)容物中提取dna。本發(fā)明對(duì)所述菌種、動(dòng)物肝組織、動(dòng)物糞便或腸道內(nèi)容物的前處理沒(méi)有特殊限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)處理即可。在本發(fā)明中，所述菌種包括肝螺桿菌、膽螺桿菌和嚙齒類螺桿菌。

在本發(fā)明中，所述熒光定量pcr反應(yīng)的程序包括：95℃預(yù)變性30s，95℃5s，52℃30s，72℃30s，40個(gè)循環(huán)，95℃15s，60℃1min，95℃15s。本發(fā)明對(duì)熒光定量pcr反應(yīng)使用的儀器沒(méi)有特殊限定，在本發(fā)明實(shí)施例中優(yōu)選使用熒光定量pcr儀。

在本發(fā)明中，使用熒光定量pcr擴(kuò)增儀進(jìn)行熒光定量pcr，根據(jù)pcr儀得出的ct值判定結(jié)果，檢測(cè)結(jié)果ct值小于33時(shí)，表明檢測(cè)出肝螺桿菌；當(dāng)ct值大于等于33時(shí)，表明未檢測(cè)出肝螺桿菌。

本發(fā)明還提供了一種熒光定量pcr試劑盒，包括：上游引物、下游引物、sybrpremixextaqii、roxreferencedyeii和陽(yáng)性質(zhì)控品；

所述上游引物的核苷酸序列為：5'-tgcagcacctgttttcaag-3'；

所述下游引物的核苷酸序列為：5'-acactccagagtaacagttt-3'。

在本發(fā)明中，所述上游引物和下游引物優(yōu)選根據(jù)genbank提供的cdtb基因序列，使用primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)得到，所述cdtb基因序列的序列號(hào)為af163667.1。在本發(fā)明中，所述cdtb基因?yàn)楦温輻U菌的毒力基因。

在本發(fā)明中，所述上游引物的核苷酸序列為：5'-tgcagcacctgttttcaag-3'；

所述下游引物的核苷酸序列為：5'-acactccagagtaacagttt-3'。

本發(fā)明將上游引物優(yōu)選溶于ddh2o中，使上游引物的濃度為10μm。本發(fā)明將下游引物優(yōu)選溶于ddh2o中，使下游引物的濃度為10μm。

在本發(fā)明中，所述試劑盒中上游引物的體積優(yōu)選為200～600μl，更優(yōu)選為300～500μl，最優(yōu)選為400μl。本發(fā)明對(duì)盛放上游引物的容器沒(méi)有特殊限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)選用的容器即可。

在本發(fā)明中，所述試劑盒中下游引物的體積優(yōu)選為200～600μl，更優(yōu)選為300～500μl，最優(yōu)選為400μl。本發(fā)明對(duì)盛放下游引物的容器沒(méi)有特殊限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)選用的容器即可。

在本發(fā)明中，所述試劑盒中sybrpremixextaqii的體積優(yōu)選為3～7ml，更優(yōu)選為4～6ml，最優(yōu)選為5ml。本發(fā)明對(duì)盛放sybrpremixextaqii的容器沒(méi)有特殊限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)選用的容器即可。

在本發(fā)明中，所述試劑盒中roxreferencedyeii的量?jī)?yōu)選為100～300μl，更優(yōu)選為150～250μl，最優(yōu)選為200μl。本發(fā)明對(duì)盛放roxreferencedyeii的容器沒(méi)有特殊限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)選用的容器即可。

本發(fā)明對(duì)sybrpremixextaqⅱ和roxreferencedyeⅱ的來(lái)源沒(méi)有特殊限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)選用的市售產(chǎn)品即可。

在本發(fā)明中，所述陽(yáng)性質(zhì)控品的組分包括攜帶cdtb片段載體。本發(fā)明使用所述pcr引物以肝螺桿菌的基因組為模板，經(jīng)過(guò)pcr擴(kuò)增后，得到cdtb片段，將cdtb片段與plb載體連接，測(cè)序正確后，得到攜帶cdtb片段載體。

在本發(fā)明中，所述陽(yáng)性質(zhì)控品中攜帶cdtb片段載體的濃度優(yōu)選為160～200ng/μl，更優(yōu)選為170～190ng/μl，最優(yōu)選為184.1ng/μl。當(dāng)陽(yáng)性質(zhì)控品中攜帶cdtb片段載體的濃度為184.1ng/μl時(shí)，經(jīng)計(jì)算為5.0×10¹⁰拷貝/μl。

在本發(fā)明中，擴(kuò)增cdtb片段的反應(yīng)體系優(yōu)選為：10μm的上游引物1μl，10μm的下游引物1μl，taqmix10μl，基因組dna1μl，ddh2o7μl；反應(yīng)程序優(yōu)選為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸15s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。

本發(fā)明對(duì)cdtb片段與plb載體連接的條件沒(méi)有特殊限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)選用的基因片段與plb載體連接的條件即可。

在本發(fā)明中，所述試劑盒中陽(yáng)性質(zhì)控品的體積優(yōu)選為1～3ml。更優(yōu)選為1.5～2.5ml，最優(yōu)選為2.0ml。本發(fā)明對(duì)盛放陽(yáng)性質(zhì)控品的容器沒(méi)有特殊限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)選用的容器即可。

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的一種鑒別肝螺桿菌的熒光定量pcr方法進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明，但是不能把它們理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。

實(shí)施例1

1)熒光定量pcr特異性引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)genbank中序列號(hào)為af163667.1提供的cdtb基因序列，使用primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，所擴(kuò)增的cdtb基因序列長(zhǎng)度為183bp，設(shè)計(jì)得到的上游引物和下游引物的核苷酸序列如下所示：

上游引物：tgcagcacctgttttcaag；

下游引物：acactccagagtaacagttt。

2)pcr擴(kuò)增方法的建立

采用常規(guī)dna提取方法提取細(xì)菌基因組dna，以細(xì)菌基因組dna為模版進(jìn)行pcr反應(yīng)，pcr反應(yīng)的每20μl反應(yīng)體系為：10μm的上游引物1μl，10μm的下游引物1μl，taqmix10μl，基因組dna1μl，ddh2o7μl；pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸15s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。反應(yīng)結(jié)束后，將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳，電壓為100v，電泳時(shí)間為30min，根據(jù)擴(kuò)增的條帶大小判定結(jié)果，當(dāng)擴(kuò)增的條帶為183bp時(shí)，表明得到cdtb基因序列，結(jié)果見(jiàn)1。

3)陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備

上述pcr擴(kuò)增產(chǎn)物使用天根凝膠回收試劑盒回收，回收的片段使用plb載體連接試劑盒與plb載體連接，經(jīng)過(guò)dh5α大腸桿菌轉(zhuǎn)化，篩選正確的菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，使用質(zhì)粒小提試劑盒提取，得到帶有cdtb片段的plb載體，濃度為184.1ng/μl，經(jīng)計(jì)算為5.0×10¹⁰拷貝/μl。經(jīng)測(cè)序plb-cdtb的cdtb片段與cdtb的genbank序列一致，測(cè)序引物為plb載體試劑盒所帶引物。

比較例1

普通pcr敏感性實(shí)驗(yàn)

將實(shí)施例1制備得到的質(zhì)粒用ddh2o進(jìn)行10倍梯度稀釋，最終稀釋為5.0×10^-1～5.0×10⁹拷貝/μl，共11組梯度濃度，作為不同拷貝的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，其中，1為5.0×10⁹拷貝/μl，2為5.0×10⁸拷貝/μl，3為5.0×10⁷拷貝/μl，4為5.0×10⁶拷貝/μl，5為5.0×10⁵拷貝/μl，6為5.0×10⁴拷貝/μl，7為5.0×10³拷貝/μl，8為5.0×10²拷貝/μl，9為50拷貝/μl，10為5.0拷貝/μl，11為0.5拷貝/μl，12為空白對(duì)照。按照實(shí)施例1的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進(jìn)行pcr反應(yīng)，將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳30min，結(jié)果如圖2所示。

根據(jù)圖2可以得出，采用普通pcr時(shí)，當(dāng)質(zhì)粒的最低濃度為5.0×10³拷貝/μl時(shí)，可檢測(cè)出肝螺桿菌。

實(shí)施例2

熒光定量pcr反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將實(shí)施例1制備的質(zhì)粒稀釋為5.0×10²～5.0×10⁸拷貝/μl的7個(gè)梯度濃度，作為模板進(jìn)行熒光定量pcr反應(yīng)，其中，1為5.0×10⁸拷貝/μl，2為5.0×10⁷拷貝/μl，3為5.0×10⁶拷貝/μl，4為5.0×10⁵拷貝/μl，5為5.0×10⁴拷貝/μl，6為5.0×10³拷貝/μl，7為500拷貝/μl，并制作溶解曲線和動(dòng)力學(xué)曲線，熔解曲線結(jié)果見(jiàn)圖3，動(dòng)力學(xué)曲線見(jiàn)圖4。將實(shí)施例1制備的質(zhì)粒稀釋為5.0×10²～5.0×10⁸拷貝/μl的7個(gè)梯度濃度，作為模板進(jìn)行熒光定量pcr反應(yīng)，其中，1為5.0×10²拷貝/μl，2為5.0×10³拷貝/μl，3為5.0×10⁴拷貝/μl，4為5.0×10⁵拷貝/μl，5為5.0×10⁶拷貝/μl，6為5.0×10⁷拷貝/μl，7為5.0×10⁸拷貝/μl，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖5。

熒光定量pcr反應(yīng)體系為：sybrpremixextaqⅱ10μl，10μm的上游引物0.8μl，10μm的下游引物0.8μl，roxreferencedyeⅱ0.4μl，基因組dna1μl，ddh2o7μl。

反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃30s；95℃5s，52℃30s，72℃30s，40個(gè)循環(huán)；95℃15s，60℃1min，95℃15s。

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：

y＝-3.8132x+34.521r²＝0.9934。

由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可知，不同濃度梯度與ct值成線性相關(guān)，且r²大于0.99，相關(guān)性良好。

由圖3可知，各個(gè)梯度的溶解曲線呈現(xiàn)同一峰值；由圖4可知，指數(shù)增長(zhǎng)期曲線平行，反映了pcr的擴(kuò)增效率相近，不同稀釋度之間的ct值相差均勻，ct值與拷貝數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

實(shí)施例3

熒光定量pcr靈敏度試驗(yàn)

將實(shí)施例1制備的質(zhì)粒稀釋為濃度為5.0×10⁰～5.0×10⁸拷貝/μl的標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行熒光定量pcr檢測(cè)，其中，1為5.0×10⁸拷貝/μl，2為5.0×10⁷拷貝/μl，3為5.0×10⁶拷貝/μl，4為5.0×10⁵拷貝/μl，5為5.0×10⁴拷貝/μl,6為5.0×10³拷貝/μl，7為5.0×10²拷貝/μl，8為5.0×10¹拷貝/μl，9為5.0×10⁰拷貝/μl，10為空白對(duì)照。當(dāng)ct值大于等于33時(shí)，視為陰性，表明未檢測(cè)出肝螺桿菌，當(dāng)ct值小于33時(shí)，視為陽(yáng)性，表明檢測(cè)出肝螺桿菌，結(jié)果見(jiàn)圖6。

熒光定量pcr反應(yīng)體系為：sybrpremixextaqⅱ10μl，10μm的上游引物0.8μl，10μm的下游引物0.8μl，roxreferencedyeⅱ0.4μl，基因組dna1μl，ddh2o7μl。

反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃30s；95℃5s，52℃30s，72℃30s，40個(gè)循環(huán)；95℃15s，60℃1min，95℃15s。

根據(jù)圖6可以得出，空白對(duì)照的ct值為33，陽(yáng)性樣品的ct值均小于33，采用本發(fā)明提供的熒光定量pcr檢測(cè)方法可以檢測(cè)到5拷貝/μl的標(biāo)準(zhǔn)品。

實(shí)施例4

熒光定量pcr的特異性試驗(yàn)

熒光定量pcr方法檢測(cè)肝螺桿菌、膽螺桿菌和嚙齒類螺桿菌，其中，1為陽(yáng)性樣品，2為膽螺桿菌陰性對(duì)照，3為嚙齒類螺桿菌陰性對(duì)照，4為空白對(duì)照，結(jié)果如圖7所示。肝螺桿菌、膽螺桿菌和嚙齒類螺桿菌的基因組dna的提取方法采用常規(guī)基因組dna提取方法。

熒光定量pcr反應(yīng)體系為：sybrpremixextaqⅱ10μl，10μm的上游引物0.8μl，10μm的下游引物0.8μl，roxreferencedyeⅱ0.4μl，基因組dna1μl，ddh2o7μl。

反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃30s；95℃5s，52℃30s，72℃30s，40個(gè)循環(huán)；95℃15s，60℃1min，95℃15s。

根據(jù)圖7可以得出，只有肝螺桿菌有熒光信號(hào)，發(fā)生了擴(kuò)增反應(yīng)，而嚙齒類螺桿菌和膽螺桿菌的ct值大于33，未發(fā)生任何擴(kuò)增，表明本申請(qǐng)的方法具有很好的特異性。

實(shí)施例5

熒光定量pcr的樣品檢測(cè)

收集不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房大小鼠糞便，共13個(gè)樣品，使用糞便dna提取試劑盒提取dna，根據(jù)實(shí)施例4記載的熒光pcr反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進(jìn)行熒光pcr反應(yīng)，其中，1為陽(yáng)性對(duì)照，2～14為樣品，15為空白對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)圖8所示。

根據(jù)圖8可以得出，編號(hào)為2和3的糞便中檢測(cè)到了肝螺桿菌，表明小鼠感染了肝螺桿菌，編號(hào)4～15顯示重疊，且未檢測(cè)出肝螺桿菌，表明小鼠未感染肝螺桿菌。

由以上實(shí)施例可以得出，采用本發(fā)明提供的檢測(cè)方法，與普通pcr相比，靈敏度提高了1000倍，并具有很好的特異性。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

sequencelisting

<110>揚(yáng)州大學(xué)

<120>一種鑒別肝螺桿菌的熒光定量pcr方法和熒光定量pcr試劑盒

<130>2017

<160>2

<170>patentinversion3.3

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<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

<400>2

acactccagagtaacagttt20