本發(fā)明屬于基因檢測領域，具體涉及一種適用于胚胎植入前染色體異常檢測的方法。

背景技術：

近年來，受現(xiàn)代飲食、環(huán)境、生活習慣等因素影響，我國不孕不育越來越高發(fā)，局部地區(qū)發(fā)病率高達15％，意味著每10對育齡夫妻中就有1對患不孕不育。特別是在國家取消獨生子女政策后，全面放開二孩政策，曾期盼已久、卻受政策限制不能生、不敢生的家庭、再婚家庭、失獨家庭、被拐家庭、高齡家庭等，再生育的欲望被廣泛激發(fā)，但隨之而來的是不孕不育的困撓，給不孕不育診療帶來了不少新命題。

輔助生殖技術可有效解決這一問題，其中，試管嬰兒就是最被普遍認可的技術之一。我國輔助生殖領域在高速發(fā)展階段，但妊娠率和活產(chǎn)率低的情況仍普遍存在，造成巨大的醫(yī)療資源的浪費和經(jīng)濟、健康損失，提高試管嬰兒成功率成為各大輔助生殖中心面臨的重要問題。據(jù)報道，通過試管嬰兒技術獲得的胚胎通常有40％～60％存在染色體異常，這是導致試管嬰兒失敗的主要原因之一，通過對植入前的胚胎進行遺傳學檢測，確保染色體數(shù)目以及結構正常以后再進行胚胎植入，可以有效提高植入健康胚胎的概率，改善妊娠結果，因此胚胎植入前遺傳學篩查(preimplantationgeneticscreening，pgs)技術開始越來越受到重視。

胚胎植入前遺傳學篩查是指胚胎植入著床前，對早期胚胎進行染色體數(shù)目和結構異常的檢測，通過一次性檢測胚胎23對染色體的結構和數(shù)目，分析胚胎是否有遺傳物質(zhì)異常的一種早期產(chǎn)前篩查方法。常見的染色體數(shù)目異常的情況有18三體綜合征、唐氏綜合癥等；染色體結構異常的會導致胎兒的先天缺陷。胚胎植入前遺傳學篩查可以阻斷在胚胎著床前，避免患兒出生，從而避免和減少遺傳病的發(fā)生，減輕家庭和社會經(jīng)濟負擔。

目前，胚胎著床前遺傳學篩查主要采用熒光原位雜交(fish)和微陣列比較基因組雜交技術^[1](arraycgh)，而應用fish進行胚胎篩選，受探針限制，不能同時檢測所有染色體狀態(tài)，最多只能檢測23條染色體中的11條染色體的缺失或者重復等染色體異常。同時由于需要多輪洗脫和探針雜交、同一種熒光信號要被不同的探針反復使用，因而假陽性率很高。arraycgh檢測的準確度高，但只能檢測到芯片覆蓋區(qū)域，未知區(qū)域檢測不到，同樣不能檢測到所有染色體狀態(tài)。近年來，隨著下一代高通量測序(nextgenerationsequencing，ngs)技術的迅速發(fā)展，由于其存在分辨率高，通量大等優(yōu)勢，目前已經(jīng)被廣泛應用于植入前染色體異常篩查。例如使用傳統(tǒng)的全基因組擴增方法聯(lián)合傳統(tǒng)建庫方法，可以檢測到染色體的所有狀態(tài)，但該方法獲得的測序數(shù)據(jù)波動大，導致染色體異常檢測的準確度降低，這一問題在染色體上部分區(qū)域結果異常如dna拷貝數(shù)變異(copynumbervariations，簡稱cnv)等的檢測結果影響尤為嚴重。增加誤診風險，影響試管嬰兒的種植成功率和出生成功率，造成出生缺陷率增高。

非專利文獻

[1]munne,s.preimplantationgeneticdiagnosisforaneuploidyandtranslocat-ionsusingarraycomparativegenomichybridization.curr.genomics,2012,13:463-470.

技術實現(xiàn)要素：

鑒于上述現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種適用于胚胎植入前染色體異常檢測的方法。

本發(fā)明人為解決上述問題進行了深入研究，結果發(fā)現(xiàn)：通過對全基因組擴增方法和傳統(tǒng)文庫構建方法進行改進，有效提高了染色體異常檢測準確度，從而完成了本發(fā)明。

即，本發(fā)明包括：

1.一種用于胚胎植入前染色體異常檢測的方法，該方法包括：

步驟a：將樣本細胞進行細胞裂解，獲得裂解產(chǎn)物；

步驟b：將裂解產(chǎn)物進行pcr擴增，獲得預擴增產(chǎn)物；

步驟c：將預擴增產(chǎn)物進行pcr擴增，純化，獲得擴增dna片段；

步驟d：利用dsdnafragmentase對擴增的dna片段進行打斷，純化，獲得打斷的dna片段；

步驟e：將所述打斷的dna片段進行末段修復，純化，得到平末端dna片段；

步驟f：將所述平末端dna片段進行3'端加a，得到3'端加a的dna片段；

步驟g：將所述3'端加a的dna片段進行加接頭，純化，得到加接頭的dna片段；

步驟h：將所述加接頭的dna片段進行pcr擴增，純化，得到擴增產(chǎn)物；

其中，步驟a中所述裂解反應條件為50℃30分鐘，99℃4分鐘，4℃保存；

步驟c中所述pcr擴增的反應條件為95℃3分鐘，(94℃30秒，65℃5分鐘)19個循環(huán)，4℃保存；

步驟e中所述末端修復使用試劑包括：1μlt4dna聚合酶，1μlt4多聚核苷酸激酶、1μlklenow片段、5μl10×多聚核苷酸激酶緩沖液及1μldntp；

步驟f中所述3'端加a使用試劑包括：0.5μlklenow片段(3'-5'exo-)、2.5μldatp及2.5μl10×緩沖液；

步驟g中所述加接頭使用試劑包括：1μlt4dna連接酶，25μlt4dna連接酶緩沖液，1μl接頭；

步驟h中所述pcr擴增的擴增引物包括：

ann引物序列(seqidno:1)：

5'-aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgac-3'

index引物序列(seqidno:2)：

5'-caagcagaagacggcatacgagatannnnnnngtgactggagttc-3'；

其中，n為隨機堿基。

2.根據(jù)項1所述的方法，其中，所述步驟a中所述的樣本為囊胚滋養(yǎng)外層細胞、減數(shù)分裂期極體細胞、卵裂期單個卵裂球中任意一種。

3.根據(jù)項1所述的方法，其中，所述步驟d的打斷的條件為37℃30分鐘。

4.根據(jù)項1所述的方法，其中，所述步驟e的末端修復的條件為20℃30分鐘。

5.根據(jù)項1所述的方法，其中，所述步驟f的3'端加a的反應條件為37℃30分鐘。

6.根據(jù)項1所述的方法，其中，所述步驟h的pcr擴增條件為94℃預變性2分鐘、(94℃變性15秒、62℃退火30秒、72℃延伸30秒)11個循環(huán)、72℃延伸10分鐘、4℃保存。

7.一種用于胚胎植入前染色體異常檢測的試劑盒，其用于實施項1～6中任一項所述的方法，其包括：

用于所述打斷的試劑；

用于所述末端修復的試劑；

用于所述3'端加a的試劑；

用于所述加接頭的試劑；

用于所述pcr擴增的試劑；

用于所述純化的試劑。

發(fā)明效果

根據(jù)本發(fā)明，通過優(yōu)化全基因組擴增方法，獲得了均一性的擴增產(chǎn)物，再通過優(yōu)化的文庫構建方法進行構建，提高了染色體核型和cnv結果準確度，有效提高了染色體異常檢測的準確度。

發(fā)明的具體實施方式

本說明書中提及的科技術語具有與本領域技術人員通常理解的含義相同的含義，如有沖突以本說明書中的定義為準。

首先，本發(fā)明提供一種用于胚胎植入前染色體異常檢測的方法，其包括：

步驟a：將樣本細胞進行細胞裂解，獲得裂解產(chǎn)物；

步驟b：將裂解產(chǎn)物進行預擴增，獲得預擴增產(chǎn)物；

步驟c：將預擴增產(chǎn)物進行pcr擴增，純化，獲得擴增dna片段；

步驟d：利用dsdnafragmentase對擴增的dna片段進行打斷，純化，獲得打斷的dna片段；

步驟e：將所述打斷的dna片段進行末段修復，純化，得到平末端dna片段；

步驟f：將所述平末端dna片段進行3'端加a，得到3'端加a的dna片段；

步驟g：將所述3'端加a的dna片段進行加接頭，純化，得到加接頭的dna片段；

步驟h：將所述加接頭的dna片段進行pcr擴增，純化，得到擴增產(chǎn)物；

其中，步驟a中所述裂解反應條件為50℃25～60分鐘，99℃4分鐘，4℃保存；優(yōu)選地，裂解反應條件為50℃30～40分鐘，99℃4分鐘，4℃保存；更優(yōu)選地裂解反應條件為50℃30分鐘，99℃4分鐘，4℃保存。

步驟c中所述pcr擴增的反應條件為95℃3分鐘，(94℃30秒，65℃5分鐘)15～25個循環(huán)，4℃保存；優(yōu)選地，循環(huán)數(shù)為15～20；更優(yōu)選地，循環(huán)數(shù)為19個。

步驟e中所述末端修復使用試劑包括：1μlt4dna聚合酶，1μlt4多聚核苷酸激酶、1μlklenow片段、5μl10×多聚核苷酸激酶緩沖液及1μldntp；

步驟f中所述3'端加a使用試劑包括：0.5μlklenow片段(3'-5'exo-)、2.5μldatp及2.5μl10×緩沖液；

步驟g中所述加接頭使用試劑包括：1μlt4dna連接酶，25μlt4dna連接酶緩沖液，1μl接頭；

步驟h中所述pcr擴增的擴增引物包括：

ann引物序列(seqidno:1)：

5'-aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgac-3'

index引物序列(seqidno:2)：

5'-caagcagaagacggcatacgagatannnnnnngtgactggagttc-3'；

其中，n為隨機堿基，nnnnnnn為標簽序列。在這里，標簽序列可作為不同樣本文庫的標記，不同樣本使用的標簽序列不同，測序后將測序數(shù)據(jù)按照標簽序列將樣本數(shù)據(jù)進行區(qū)分。

優(yōu)選地，所述步驟a中所述的樣本為囊胚滋養(yǎng)外層細胞、減數(shù)分裂期極體細胞、卵裂期單個卵裂球中任意一種。更優(yōu)選地，所述樣本為囊胚滋養(yǎng)外層3～5個細胞。

優(yōu)選地，所述步驟d的打斷的條件為37℃30分鐘。

優(yōu)選地，所述步驟e的末端修復條件為20℃30分鐘。

優(yōu)選地，所述步驟f的3'端加a的反應條件為37℃30分鐘。

優(yōu)選地，步驟h的pcr擴增條件為94℃預變性2分鐘、(94℃變性15秒、62℃退火30秒、72℃延伸30秒)11個循環(huán)、72℃延伸10分鐘、4℃保存。

優(yōu)選地，本發(fā)明的方法中，步驟c與步驟d之間、步驟d與步驟e之間、步驟e和步驟f之間、步驟g和步驟h之間、步驟h之后還包括產(chǎn)物純化步驟。本發(fā)明技術領域人員可以采用傳統(tǒng)建庫中用于純化的方法、試劑或裝置來進行。

在另一方面，本發(fā)明提供一種用于胚胎植入前染色體異常檢測的試劑盒(本發(fā)明的試劑盒)，其可用于實施本發(fā)明的方法。該試劑盒包括：

用于所述打斷的試劑，例如dsdnafragmentase及相應的酶切反應緩沖液等；

用于所述末端修復的試劑，例如t4dna聚合酶、t4多聚核苷酸激酶、dntp、klenow片段、10×多聚核苷酸激酶緩沖液等；

用于所述3'端加a的試劑，例如缺失外切酶活性的klenow片段及相應的反應緩沖液等；

用于所述加接頭的試劑，例如接頭、t4dna連接酶及相應的連接反應緩沖液；

用于所述pcr擴增的試劑，例如kapahifihotstartreadmix、ann公共引物、index引物等；

用于所述純化的試劑，例如核酸純化試劑(annoroad公司)、ampurexp純化磁珠(agencourt公司)等。

實施例

以下通過實施例對本發(fā)明進行更具體的說明。應當理解，此處所描述的實施例是用于解釋本發(fā)明，而非用于限定本發(fā)明。

實施例1

1全基因組擴增

選擇一個發(fā)育5～6天的處于囊胚期的胚胎，取3份滋養(yǎng)外層細胞，每份取細胞3～5個，分別命名為樣本1、樣本2和樣本3。樣本1～3分別用無菌ddh2o補足至9μl體系。

對樣本1進行如下操作。

1.1細胞裂解

配置裂解液mix，如下表1，

表1

取裂解液mix1μl加入位于pcr管的9μl體系中，注意將裂解液mix加到管壁上，勿使槍頭靠近管底液體。此時管內(nèi)體積為10μl，離心后上pcr儀。pcr裂解程序(熱蓋105℃)，程序如下表2，獲得裂解產(chǎn)物。

表2

1.2預擴增

準備解鏈增試劑(如表3)，總體積3μl，加入到的10μl細胞裂解產(chǎn)物中。

表3

pcr解鏈(熱蓋105℃)，95℃2分鐘，進行解鏈完畢后注意保持4℃，然后加入1μllibrarypreparationenzyme，進行pcr擴增。pcr預擴增程序(熱蓋105℃)，如下表4。獲得預擴增產(chǎn)物。

表4

1.3pcr擴增

擴增mix準備(如下表5)，震混離心后，取61μl擴增mix加入到14μl預擴增體系中，此時的總體積為75μl。

表5

pcr擴增程序(熱蓋105℃)，如下表6進行，獲得擴增產(chǎn)物。

表6

1.3.1純化

(1)取75μl(1×)純化磁珠懸浮液(annoroad公司)加入擴增產(chǎn)物中，充分混勻，靜置8分鐘。

(2)靜置時間到，短暫離心上磁力架，待吸附2分鐘后移除澄清液體。

(3)加入200μl70％乙醇，靜置30秒后移除，重復一次。

(4)待晾干，加入40μlddh2o后，將樣本從磁力架上去下，與純化磁珠懸浮液混勻后靜置5分鐘。

(5)靜置時間到，短暫離心上磁力架，待吸附2分鐘后收集液體到新的1.5ml離心管。

(6)獲得純化后pcr擴增產(chǎn)物。

2酶切打斷

將擴增的dna片段進行酶切打斷，打斷起始量為10ng，反應體系如下表7，

表7

反應條件為37℃，5分鐘；反應結束后，加入5μl，0.5medta終止反應；再加入2.5μl10％sds混勻后，取49.5μl純化磁珠懸浮液，70％乙醇洗兩次，41.5μlddh2o洗脫dna，獲得打斷的dna片段。

3末端修復

對步驟2獲得的酶切產(chǎn)物進行末端修復，反應體系如下表2，

表8

反應條件為20℃，30分鐘，取90μl純化磁珠懸浮液，70％乙醇洗兩次，20μlddh2o洗脫dna，獲得平末端dna片段。

43'端加a反應

取步驟3中獲得的平末端dna片段按表9進行3'端加a反應，反應體系如下：

表9

反應條件為37℃，30分鐘，獲得3'端加a的dna片段。

5加接頭反應

取步驟4中獲得的3'端加a的dna片段進行加接頭反應，反應體系如下表10，

表10

反應條件為20℃，15分鐘，取93.6μl純化磁珠懸浮液，70％乙醇洗兩次，18μlddh2o洗脫dna，得到加接頭dna片段。

6pcr反應

取步驟5中獲得的加接頭dna片段，使用表11中的反應體系進行pcr，反應體系如下表，使用index1引物，公共引物進行pcr。

index1引物序列(seqidno:3)：

5'-caagcagaagacggcatacgagataagcaatggtgactggagttc-3'

ann引物序列(seqidno:1)：

5'-aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgac-3'

表11

反應條件為：

取50μl純化磁珠懸浮液，70％乙醇洗兩次，20μlddh2o洗脫dna，獲得pcr擴增產(chǎn)物(文庫)，完成文庫構建。

7文庫濃度測定

使用安捷倫2100和qpcr方法檢測文庫的峰圖和濃度。

8上機測序

使用測序儀550ar對構建的文庫進行測序，將下機數(shù)據(jù)進行生物信息學分析。

對比例

使用樣本2使用dop-pcr進行全基因組擴增，得到擴增產(chǎn)物之后，利用傳統(tǒng)文庫構建方法進行建庫，獲得樣本2的文庫。將樣本2的文庫進行測序，測序策略與實施例中步驟8一致。

將測序結果利用生物信息學分析把這些序列定位到人類基因組參考圖譜上，通過與參考基因組的對比分析，查找各染色體上存在的數(shù)目和結構異常；經(jīng)分析，本發(fā)明的方法檢測到樣本1在5號染色體短臂上存在12.5m的缺失(表12)，存在一處cnv。對比例中樣本2存在三處cnv，即在5號染色體短臂上存在兩處缺失，在5號染色體長臂上存在一處缺失。并使用樣本3進行arraycgh驗證發(fā)現(xiàn)樣本3在5號染色體短臂上存在一處缺失(表12)，結果與樣本1檢測結果一致，說明該方法(本發(fā)明方法)能夠準確的檢測出樣本cnv。

表12

還需要說明的是，在可實施且不明顯違背本發(fā)明的主旨的前提下，在本說明書中作為某一技術方案的構成部分所描述的任一技術特征或技術特征的組合同樣也可以適用于其它技術方案；并且，在可實施且不明顯違背本發(fā)明的主旨的前提下，作為不同技術方案的構成部分所描述的技術特征之間也可以以任意方式進行組合，來構成其它技術方案。本發(fā)明也包含在上述情況下通過組合而得到的技術方案，并且這些技術方案相當于記載在本說明書中。

上述說明示出并描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施例，如前所述，應當理解本發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構想范圍內(nèi)，通過上述教導或相關領域的技術或知識進行改動。而本領域技術人員所進行的改動和變化不脫離本發(fā)明的精神和范圍，則都應在本發(fā)明所附權利要求的保護范圍內(nèi)。

工業(yè)實用性

根據(jù)本發(fā)明，能夠適用于胚胎植入前染色體異常檢測的方法及試劑盒。

序列表

<110>安諾優(yōu)達基因科技（北京）有限公司

<120>一種用于胚胎植入前染色體異常檢測的方法及試劑盒

<130>1703recn

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>45

<212>dna

<213>人工序列

<400>ann引物

aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgac45

<210>2

<211>45

<212>dna

<213>人工序列

<400>index引物

caagcagaagacggcatacgagatannnnnnngtgactggagttc45

<210>3

<211>45

<212>dna

<213>人工序列

<400>index1引物

caagcagaagacggcatacgagataagcaatggtgactggagttc45