本發(fā)明涉及免疫學(xué)中免疫球蛋白
技術(shù)領(lǐng)域：
的單克隆抗體，具體是一種抗ctrp4的單克隆抗體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：ctrp4是c1q/tnf相關(guān)蛋白超家族(c1qandtumornecrosisfactorrelatedproteinsuperfamilies，ctrps)的第4號(hào)成員。該家族是由lodish等于2004年在克隆脂聯(lián)素種內(nèi)的同源基因時(shí)被發(fā)現(xiàn)命名的，目前已發(fā)現(xiàn)15個(gè)成員(ctrp1～ctrp15)，與脂聯(lián)素、瘦素和抵抗素等一起被統(tǒng)稱為脂肪細(xì)胞因子超家族。ctrp4是我們實(shí)驗(yàn)室與國(guó)家人類基因組北方中心合作通過(guò)生物信息學(xué)和高通量篩選平臺(tái)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的脂肪細(xì)胞因子。2011年我們?cè)趪?guó)際上發(fā)表了第一篇報(bào)道c1q/tnf相關(guān)蛋白4(ctrp4/c1q/tnfrelatedprotein4，ctrp4)的文章，通過(guò)n末端測(cè)序確定ctrp4帶有經(jīng)典的信號(hào)肽序列，是一個(gè)新的分泌蛋白。我們確定重組ctrp4的真核蛋白和原核蛋白具有同樣的生物學(xué)功能。體外研究表明，分泌形式的ctrp4蛋白能夠上調(diào)腫瘤細(xì)胞中的炎癥信號(hào)水平，同時(shí)其自身表達(dá)也受炎癥信號(hào)的上調(diào)，另外對(duì)ctrp4的功能研究顯示ctrp4能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖水平，在抗腫瘤藥物處理下也會(huì)上調(diào)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的抗藥性。體內(nèi)研究表明，ctrp4在體內(nèi)具有明確的抗炎和抗癌作用作用。因此這是一個(gè)功能重要而復(fù)雜的分子。探尋特異的生物標(biāo)志物分子用于疾病的早期診斷一直是醫(yī)學(xué)科研工作者努力的目標(biāo)之一。目前，分子標(biāo)志物因其對(duì)多種疾病的診斷、治療和預(yù)后具有十分重要的作用，日益引起學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。而血液中蛋白的變化因其操作簡(jiǎn)單、快捷，且創(chuàng)傷小，易被患者接受，是目前診斷多種疾病主要輔助檢查之一，應(yīng)用廣泛。ctrp4的研究仍有許多工作要做，而準(zhǔn)確識(shí)別和分離ctrp4是研究工作中的重要環(huán)節(jié)。研究初期我們制備了ctrp4的多克隆抗體，但是該抗體的缺點(diǎn)是特異性差，免疫印跡實(shí)驗(yàn)不能識(shí)別內(nèi)源性蛋白。研究發(fā)現(xiàn)ctrp4在一些疾病中的表達(dá)具有較大差異，并且這種差異在血液中會(huì)明顯顯現(xiàn)出來(lái)，因此需要制備一種特異性好的抗體檢測(cè)疾病中ctrp4的表達(dá)變化，這對(duì)相關(guān)疾病的診斷可能具有重要價(jià)值。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：ctrp4是我們發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新基因，因此國(guó)內(nèi)外任何試劑公司都沒(méi)有商品化的單克隆抗體，為了更準(zhǔn)確、特異地檢測(cè)ctrp4的表達(dá)豐度，本發(fā)明提供了一種抗ctrp4單克隆抗體。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，該單克隆抗體的特異性非常好，可以特異識(shí)別內(nèi)源性的ctrp4蛋白，可以通過(guò)免疫印跡法、免疫熒光法、免疫組化檢測(cè)ctrp4在組織和細(xì)胞中的表達(dá)。本發(fā)明提供的抗ctrp4蛋白的單克隆抗體，特異性識(shí)別ctrp4蛋白，是由第一雜交瘤細(xì)胞株或第二雜交瘤細(xì)胞株分泌獲得，其中第一雜交瘤細(xì)胞株的保藏編號(hào)為：cgmccno.14307，第二雜交瘤細(xì)胞株的保藏編號(hào)為：cgmccno.14308。一種雜交瘤細(xì)胞株，保藏編號(hào)為cgmccno.14307。一種雜交瘤細(xì)胞株，保藏編號(hào)為cgmccno.14308。一種衍生抗體，由小鼠體內(nèi)接種保藏編號(hào)為cgmccno.14307的雜交瘤細(xì)胞株或接種保藏編號(hào)為cgmccno.14307的雜交瘤細(xì)胞株，使其產(chǎn)生含抗體的腹水，取出腹水進(jìn)行純化制備而成。本發(fā)明還提供了上述單克隆抗體或者衍生抗體在制備ctrp4特異性免疫識(shí)別試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了上述抗ctrp4蛋白的單克隆抗體或者衍生抗體在制備ctrp4的中和試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種免疫檢測(cè)試劑盒，含有上述抗ctrp4蛋白的單克隆抗體，或含有保藏編號(hào)為cgmccno.14307的雜交瘤細(xì)胞株或/和接種保藏編號(hào)為cgmccno.14307的雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體。優(yōu)選地，上述免疫檢測(cè)試劑盒用于輔助診斷腦組織疾病。我們的單抗在腦組織的免疫熒光、免疫組化和免疫印跡法中都可以特異檢測(cè)到ctrp4的表達(dá)。優(yōu)選地，因?yàn)閏trp4是一種分泌蛋白，因此通過(guò)上述單抗制成的免疫檢測(cè)試劑盒可以檢測(cè)到血液中ctrp4的表達(dá)。本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明提供的抗ctrp4蛋白的單克隆抗體，能夠與內(nèi)源性ctrp4蛋白高特異性結(jié)合，有效檢測(cè)ctrp4在組織和細(xì)胞中的表達(dá)。適用于制備以免疫印跡、免疫熒光、免疫組化等多種方法為基礎(chǔ)的檢測(cè)試劑，可方便快速準(zhǔn)確地完成檢測(cè)，為更好地研究分子標(biāo)志物ctrp4蛋白提供有效工具。保藏信息：第一雜交瘤細(xì)胞株：于2017年06月26日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)：cgmccno.14307，建議的分類命名：小鼠單克隆抗體細(xì)胞株，參椐的生物材料(株)：ctrp4-33。第二雜交瘤細(xì)胞株：于2017年06月26日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)：cgmccno.14308，建議的分類命名：小鼠單克隆抗體細(xì)胞株，參椐的生物材料(株)：ctrp4-35。附圖說(shuō)明圖1為實(shí)施例中制備抗ctrp4蛋白的單克隆抗體的技術(shù)路線。圖2為1-3號(hào)小鼠免疫完成后，對(duì)抗體免疫效價(jià)的檢測(cè)結(jié)果，其中橫坐標(biāo)是稀釋倍數(shù)，縱坐標(biāo)是od值。圖3是通過(guò)免疫印跡法對(duì)ctrp4不同雜交瘤細(xì)胞株的篩選檢測(cè)結(jié)果，標(biāo)注的數(shù)字為不同細(xì)胞株的編號(hào)。圖4是第16、33和35號(hào)雜交瘤細(xì)胞株制備的抗體純化后的電泳圖。圖5是三株雜交瘤細(xì)胞株制備的抗體westernblot檢測(cè)結(jié)果，其中1表示33號(hào)雜交瘤細(xì)胞株制備的單抗，2表示16號(hào)雜交瘤細(xì)胞株制備的單抗，3表示35號(hào)雜交瘤細(xì)胞株制備的單抗。圖6是用ctrp4-33在神經(jīng)細(xì)胞的免疫熒光檢測(cè)結(jié)果，其中a是細(xì)胞核染色，b是ctrp4蛋白染色，c是神經(jīng)元染色，d是b和c染色重疊。圖7是用ctrp4-33在小鼠腦組織的免疫熒光檢測(cè)結(jié)果，其中a是細(xì)胞核染色，b是ctrp4蛋白染色，c是腦多形性膠質(zhì)細(xì)胞染色，d是b和c重疊。圖8是用ctrp4-35在小鼠腦組織的免疫熒光檢測(cè)結(jié)果，其中a是細(xì)胞核染色，b是ctrp4蛋白染色，c是腦多形性膠質(zhì)細(xì)胞染色，d是b和c重疊。圖9是用ctrp4-33免疫組化法檢測(cè)ctrp4在小鼠腦組織的分布，顯示ctrp4在海馬部位特異性高表達(dá)。圖10是用ctrp4-33免疫印跡法檢測(cè)ctrp4在小鼠腦組織的分布，顯示其在嗅球和海馬部位高表達(dá)，并且表達(dá)量與年齡相關(guān)。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)一步說(shuō)明，意識(shí)本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明。實(shí)施例1單克隆抗體的制備及篩選1.重組人ctrp4-his蛋白的表達(dá)和純化實(shí)驗(yàn)室以已知的克隆人源ctrp4基因序列為基礎(chǔ)，先常規(guī)方法構(gòu)建了重組人ctrp4-gst蛋白(ctrp4與谷胱甘肽融合)，但后續(xù)在大腸桿菌中該融合蛋白并未表達(dá)。因此又構(gòu)建了pet-32a-c(+)-ctrp4原核表達(dá)載體。pet-32a-c(+)-ctrp4表達(dá)的重組蛋白為c端帶有his標(biāo)簽且去除信號(hào)肽的ctrp4蛋白。分別在不同的溫度、誘導(dǎo)劑濃度及時(shí)間下誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，發(fā)現(xiàn)隨著溫度的降低，可溶形式的蛋白表達(dá)量增加。經(jīng)過(guò)westernblot鑒定，預(yù)期大小的條帶系重組人ctrp4-his蛋白。最后選用了最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件：24℃、10小時(shí)、iptg終濃度為0.4mmol/l的條件進(jìn)行蛋白的大量誘導(dǎo)表達(dá)。重組ctrp4-his蛋白c-端含有6個(gè)組氨酸，采用ni2+柱親和層析進(jìn)行純化。首先采用了50mm咪唑洗脫雜蛋白，200mm咪唑洗脫目的蛋白，但是純化效果不理想，洗脫的目的蛋白有較多雜蛋白。改用100mm咪唑洗脫雜蛋白，再用500mm咪唑洗脫目的蛋白，得到的蛋白純度可以達(dá)到90％以上。純化的目的蛋白下文簡(jiǎn)稱為“ctrp4”。2.ctrp4單克隆抗體制備、純化、鑒定單抗制備的技術(shù)路線參見(jiàn)圖1。2.1免疫用“ctrp4”，按60μg蛋白/只小鼠的量，皮下初次免疫4只spfbalb/c雌性小鼠，編號(hào)為：#1、#2、#3、#4。兩周后，皮下第一次加強(qiáng)免疫，免疫量為30μg蛋白/只。兩周后，皮下第二次加強(qiáng)免疫，免疫量為30μg蛋白/只。三周后，皮下第三次加強(qiáng)免疫，免疫量為30μg蛋白/只。三周后第五天，皮下第四次加強(qiáng)免疫，免疫量為30μg蛋白/只。10天以后，用“ctrp4”包板，elisa測(cè)定免疫小鼠效價(jià)。步驟：用“ctrp4”，2μg/ml，4℃包被過(guò)夜；2％牛奶，37℃封閉2h；血清從200倍開(kāi)始2倍梯度稀釋，空白對(duì)照(blank)為pbs，陰性對(duì)照(negative)為陰性血清200倍稀釋。結(jié)果參見(jiàn)圖2和表1(效價(jià)為1/2最大od值所對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù))：表110天以后，即融合前，用“ctrp4”免疫原50μg，腹腔沖擊#1小鼠，做細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)。2.2細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)概述：取小鼠脾細(xì)胞與sp2/0細(xì)胞，采用peg法進(jìn)行融合。融合完細(xì)胞用半固體培養(yǎng)基(含hat)進(jìn)行篩選培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)器材：滅菌的手術(shù)器械，包括三把剪刀、三把鑷子、一個(gè)細(xì)胞篩、一個(gè)注射器的內(nèi)芯和一個(gè)平皿，濕盒，2個(gè)500ml燒杯，2個(gè)50ml離心管，3個(gè)15ml離心管。實(shí)驗(yàn)試劑：imdm培養(yǎng)基，imdm完全培養(yǎng)基(含15％血清)，2.2％甲基纖維素(廠家：sigma，貨號(hào)：m0262-100g)，新生牛血清10ml，peg1500(廠家：roche，貨號(hào)：78364)，hat(廠家：sigma，貨號(hào)：h0262-10vl)，ht(廠家：sigma，貨號(hào)：h0137-10vl)。融合實(shí)驗(yàn)步驟：(1)將狀態(tài)良好的sp2/0細(xì)胞輕柔地從培養(yǎng)瓶壁上吹打下來(lái)，吸入到50ml離心管中。(2)小鼠摘眼球取血，然后拉頸處死，放入75％的酒精中浸泡5min。(3)在平皿中倒入少量無(wú)血清的imdm，將細(xì)胞篩及注射器內(nèi)芯放入平皿中。用剪刀和鑷子取下小鼠的脾臟，放到細(xì)胞篩上。用注射器的內(nèi)芯輕輕地將脾充分碾碎，將碾好的細(xì)胞吸入到裝sp2/0的離心管中，離心1500rad/min，5min。(4)用剪刀和鑷子取下小鼠的胸腺，碾碎。將碾好的胸腺細(xì)胞放到15ml離心管中，再加入1ml的hat，放在孵箱中備用。(5)將離心好的細(xì)胞，倒掉上清，用無(wú)血清的imdm將細(xì)胞小心輕柔地吹勻，離心(1500rad/min，5min)。(6)將離心好的細(xì)胞上清盡量倒掉。拍打離心管底充分懸浮細(xì)胞，將離心管放入37℃溫水中，在1分鐘內(nèi)緩慢加入1ml的peg，加完后，在溫水中靜置1min。然后2min內(nèi)緩慢加入2ml的無(wú)血清的imdm，接著2min內(nèi)緩慢加入8ml無(wú)血清的imdm。離心1000rad/min，5min。(7)倒掉上清，加入10ml的血清，小心的將細(xì)胞吹勻，倒入前面準(zhǔn)備好的胸腺細(xì)胞。再加入25ml滅過(guò)菌的半固體培養(yǎng)基，充分混勻。然后均勻倒入30個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中。將細(xì)胞培養(yǎng)皿放入濕盒中，然后放入孵箱中培養(yǎng)。2.3挑克隆挑10板×93個(gè)細(xì)胞單克隆，培養(yǎng)于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(事先用胸腺細(xì)胞鋪板，100μl/孔)。2.4單克隆細(xì)胞第一次篩選概述：挑克隆培養(yǎng)一周后，用“ctrp4”包板，對(duì)挑選的克隆采用elisa方法，做第一次篩選，得到41株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株。實(shí)驗(yàn)試劑：包被液(碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液，ph9.6)、pbs緩沖液ph7.4、封閉液(含2％牛奶的pbs)、洗液pbst(含0.05％吐溫的pbs)、顯色液:1％a液+10％b液(a液：含1％tmb的dmso；b液：含0.1％h2o2的檸檬酸緩沖液)、終止液(2m硫酸)、二抗(山羊抗小鼠igg/hrp)。實(shí)驗(yàn)步驟：(1)用包被液稀釋“ctrp4”至終濃度為2μg/ml，100μl/孔，4℃，過(guò)夜；后用洗液洗滌3次。(2)2％牛奶封閉液封閉，200μl/孔，37℃孵箱，2h；后用洗液洗滌3次。(3)加入一抗(細(xì)胞培養(yǎng)上清)、陰性對(duì)照(sp2/0培養(yǎng)上清)、空白對(duì)照(pbs)、陽(yáng)性對(duì)照(陽(yáng)性血清pbs200倍稀釋)，均為100μl/孔，37℃孵箱，1h；后用洗液洗滌3次。(4)加入pbs稀釋20000倍的二抗，100μl/孔，37℃孵箱，1h；取出后用洗液洗滌3次。(5)顯色，顯色液100μl/孔，顯色時(shí)間為5min左右。(6)每孔加入50μl終止液終止。(7)雙波長(zhǎng)(450，630)測(cè)吸光值，記錄保存數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2(共41株)：表2注：*代表對(duì)免疫蛋白篩選呈陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞株，共41株?！鵀殛?yáng)性對(duì)照讀數(shù)，△為空白對(duì)照讀數(shù)，☆為陰性對(duì)照讀數(shù)(下同)。2.5單克隆細(xì)胞第二次篩選將41株陽(yáng)性的細(xì)胞株，用“ctrp4”及標(biāo)簽his,myc及天然樣本”包板，采用elisa方法，做第二次篩選，得到22株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株。表3編號(hào)ctrp4天然樣本c-myc*his編號(hào)60948天然樣本c-myc*his10.1290.1060.068230.329*0.0730.0220.265*0.0740.03240.796*0.1930.03230.575*0.1330.037250.497*0.1180.04640.769*0.1590.052260.1520.1030.08350.747*0.430.045270.614*0.0740.02260.2160.0630.04280.739*0.1380.04170.624*0.2980.033290.2180.0840.08180.1880.080.03300.777*0.7520.90390.853*0.1010.017310.552*0.1150.025100.051*0.7350.029320.415*0.0610.023110.2340.1080.026330.767*0.1410.045120.781*0.2280.093340.371*0.0780.026130.857*0.5430.037350.249*0.1640.023140.682*0.180.025360.476*0.1940.062150.281*0.0760.027370.2040.1330.102160.519*0.0660.027380.314*0.0590.015170.395*0.0880.024390.796*0.0690.022180.241*0.2210.754400.683*0.0360.017190.334*0.070.024410.0920.0610.119200.432*0.0550.028陰0.0230.0370.018210.1510.0610.024空0.0170.0490.018220.661*0.180.023陽(yáng)0.6370.160.1992.6單克隆細(xì)胞亞類鑒定概述：將篩選出來(lái)的30株陽(yáng)性細(xì)胞株進(jìn)行亞類鑒定，最后得到22株igg類型的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株。實(shí)驗(yàn)試劑：包被抗體：(southernbiotech)；封閉液：含有2％bsa和3％蔗糖的pbs；顯色液:0.2mla液+10mlb液(內(nèi)含10μl30％h2o2)、各型亞類二抗:(均購(gòu)自southernbiotech)。a液是含有15mg/mlabts的h2o；b液為ph4.0的檸檬酸緩沖液。實(shí)驗(yàn)步驟：(1)用100mmpbs(ph7.4)稀釋包被抗體至0.5μg/ml，每孔加0.1ml，4℃，過(guò)夜。(2)pbs-t洗3次，每孔加入200μl封閉液，37℃孵育2h。(3)pbs-t洗3次，每孔加入100μl雜交瘤上清，37℃孵育1h。(4)pbs-t洗3次，用封閉液1：1000(κ,λ)或1：2000(其它的)稀釋的hrp標(biāo)記的抗體0.1ml每孔，分別加入適當(dāng)?shù)目字校?7℃孵育1h。(5)pbs-t洗3次，每孔加50μl底物溶液，10～20min內(nèi)于雙波長(zhǎng)(450，630)測(cè)吸光值，記錄保存數(shù)據(jù)(見(jiàn)表4)。表4實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)注：※表示igg類型的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株。表5單克隆細(xì)胞株相關(guān)信息表5中不同編號(hào)的雜交瘤細(xì)胞株通過(guò)免疫印跡法篩選，結(jié)果見(jiàn)圖3，最終挑選出條帶清晰、雜蛋白少的第16、33和35號(hào)雜交瘤細(xì)胞株，對(duì)其表達(dá)的蛋白進(jìn)行電泳分析，sds-page顯示兩條蛋白條帶，分子量約為50kd和25kd，表達(dá)的抗體有典型的重鏈及輕鏈結(jié)構(gòu)，檢測(cè)純化后抗體純度達(dá)95％以上(參見(jiàn)圖4)。2.7小鼠腹腔接種法大規(guī)模制備單抗將第16、33和35號(hào)雜交瘤細(xì)胞株分別進(jìn)行組織培養(yǎng)，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后收集清洗稀釋后分別注射小鼠腹腔，7～14天后采集腹水，分離的上清液里即含有抗ctrp4蛋白的單克隆抗體。三株雜交瘤細(xì)胞株制備的抗體分別標(biāo)記為ctrp4-16、ctrp4-33、ctrp4-35。2.8單克隆抗體的特異性檢測(cè)2.8.1體外特異性結(jié)合實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法：westernblot。實(shí)驗(yàn)材料：抗原：ctrp4蛋白過(guò)表達(dá)材料一抗：三株雜交瘤細(xì)胞對(duì)應(yīng)制備的單克隆抗體。二抗：hrp標(biāo)記羊抗鼠抗體。實(shí)驗(yàn)條件參見(jiàn)表6，實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見(jiàn)圖5。表6結(jié)合附圖5，其中1表示33號(hào)雜交瘤細(xì)胞株制備的單抗ctrp4-33，2表示16號(hào)雜交瘤細(xì)胞株制備的單抗ctrp4-16，3表示35號(hào)雜交瘤細(xì)胞株制備的單抗ctrp4-35。從圖5可以看出，1和3的電泳條帶清晰，表明抗體特異性高。2.8.2體內(nèi)特異性結(jié)合實(shí)驗(yàn)用ctrp4-33在神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，結(jié)果參見(jiàn)圖6，用ctrp4-33和ctrp4-35分別在小鼠腦組織進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，結(jié)果參見(jiàn)圖7和圖8。體內(nèi)免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明，通過(guò)這兩種抗體，ctrp4蛋白能夠清晰地被標(biāo)記出來(lái)，ctrp4-35的標(biāo)記效果更佳，優(yōu)于ctrp4-33。通過(guò)單抗檢測(cè)小鼠腦組織中ctrp4的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，ctrp4在腦組織中的表達(dá)與其年齡相關(guān)，年輕鼠表達(dá)量高，老年鼠表達(dá)量下降，特別在老年鼠海馬組織ctrp4表達(dá)量明顯下降。ad模型鼠腦組織特別是嗅球組織ctrp4的表達(dá)下降，這是ctrp4的表達(dá)可能與ad的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系的一個(gè)有力證據(jù)。用ctrp4-33免疫組化法檢測(cè)ctrp4在小鼠腦組織的分布，顯示ctrp4在海馬部位特異性高表達(dá)。參見(jiàn)圖9。用ctrp4-33免疫印跡法檢測(cè)ctrp4在小鼠腦組織的分布，顯示其在嗅球和海馬部位高表達(dá)，并且表達(dá)量與年齡相關(guān)。參見(jiàn)圖10，其中a為嗅球組織，b為海馬組織。a圖中，編號(hào)1～3為老年鼠，4～6為青年鼠，7～9為ad鼠。b圖中，編號(hào)1～3為ad鼠，4～6為青年鼠，7～9為老年鼠。m是分子量標(biāo)志。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，ad(阿爾茨海默病)鼠的嗅球組織中ctrp4表達(dá)量減少，與老年鼠表達(dá)量近似。本文中應(yīng)用了具體個(gè)例對(duì)發(fā)明構(gòu)思進(jìn)行了詳細(xì)闡述，以上實(shí)施例的說(shuō)明只是用于幫助理解本發(fā)明的核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離該發(fā)明構(gòu)思的前提下，所做的任何顯而易見(jiàn)的修改、等同替換或其他改進(jìn)，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)12