本發(fā)明涉及藥用化合物的技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種2-甲基-5-(3,4-二羥基苯基)吡啶及其提取方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

喙尾琵琶甲(blapsrynchopeterafairmaire)俗稱臭殼子、小黑蟲(chóng)、臭屁蟲(chóng)、高腳蟲(chóng)、高腳臭蟲(chóng)、打屁蟲(chóng)，臭蟲(chóng)等，成蟲(chóng)能分泌具有藥用價(jià)值的防御液(即臭屁)。喙尾琵琶甲是云南彝族長(zhǎng)期廣泛使用的昆蟲(chóng)藥物(彝族藥名音譯為“寒齋”)，用于熱證發(fā)燒、飲食積滯、小兒疳積、夜驚、乳癖、乳痰、瘡癢腫毒、濕疹、皮膚瘙癢等。據(jù)調(diào)查，彝族民間醫(yī)生在治療腫瘤、心血管等疑難病癥的處方中，80％以上都含有該昆蟲(chóng)藥。因此，喙尾琵琶甲是一種極具開(kāi)發(fā)和利用價(jià)值的民族民間藥用昆蟲(chóng)。

目前本領(lǐng)域?qū)︵刮才眉椎乃帉W(xué)和臨床應(yīng)用方面的研究報(bào)道非常少，尚未見(jiàn)關(guān)于喙尾琵琶甲提取物及其用途的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明目的在于提供2-甲基-5-(3,4-二羥基苯基)吡啶及其提取方法和應(yīng)用。本發(fā)明從喙尾琵琶甲中提取得到一種新化合物，2-甲基-5-(3,4-二羥基苯基)吡啶，該化合物具有優(yōu)異的抗氧化性，具有廣闊應(yīng)用的前景。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種名稱為2-甲基-5-(3,4-二羥基苯基)吡啶的化合物。

本發(fā)明提供了上述方案所述2-甲基-5-(3,4-二羥基苯基)吡啶的提取方法，包括以下步驟：

使用醇溶液對(duì)喙尾琵琶甲粉體進(jìn)行冷浸提取，得到提取液；

將所述提取液依次進(jìn)行石油醚萃取、氯代甲烷萃取和乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯萃取物；

將所述乙酸乙酯萃取物進(jìn)行第一硅膠柱層析分離，得到含第一粗產(chǎn)物的流分；所述第一硅膠柱層析分離的洗脫劑為石油醚-丙酮體系或石油醚-氯仿體系；

將所述含第一粗產(chǎn)物的流分進(jìn)行第二硅膠柱層析分離，得到含第二粗產(chǎn)物的流分；所述第二硅膠柱層析分離的洗脫劑為氯仿-甲醇體系；

將所述含第二粗產(chǎn)物的流份依次進(jìn)行ods反相柱層析分離、第三硅膠柱層析分離和凝膠柱層析分離，得到2-甲基-5-(3,4-二羥基苯基)吡啶。

優(yōu)選的，所述喙尾琵琶甲粉體的粒徑為10～40目。

優(yōu)選的，所述醇溶液中的醇為碳原子數(shù)為1～3的醇中的一種或幾種的混合物；

所述醇溶液的體積和喙尾琵琶甲粉體的質(zhì)量比為3～5:1；

優(yōu)選的，所述冷浸提取的次數(shù)為2～5次；

所述單次冷浸提取的時(shí)間獨(dú)立地為12～48h。

優(yōu)選的，所述石油醚萃取的相比為0.5～1.5:1；

所述氯代甲烷萃取的相比為0.5～1.5:1；

所述乙酸乙酯萃取的相比為0.5～1.5:1。

優(yōu)選的，所述第一硅膠柱層析分離的洗脫方式為梯度洗脫；所述各梯度洗脫劑中石油醚和丙酮或石油醚和氯仿的體積比依次為10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9、0:10。

優(yōu)選的，所述第二硅膠柱層析分離的洗脫方式為梯度洗脫；所述各梯度洗脫劑中氯仿和甲醇的體積比依次為100:1、50:1、25:1、12.5:1、10:1、5:1、4:1、3:1。

優(yōu)選的，所述ods反相柱層析分離的洗脫方式為等度洗脫；所述ods反相柱層析分離的洗脫劑為甲醇-水體系；

所述第三硅膠柱層析分離的洗脫方式為等度洗脫；所述第三硅膠柱層析分離的洗脫劑為氯仿-甲醇體系；

所述凝膠柱層析分離的洗脫方式為等度洗脫；所述凝膠柱層析分離的洗脫劑為甲醇。

本發(fā)明提供了上述方案所述的2-甲基-5-(3,4-二羥基苯基)吡啶或上述方案所述提取方法得到的2-甲基-5-(3,4-二羥基苯基)吡啶在制備清除氧自由基藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種名稱為2-甲基-5-(3,4-二羥基苯基)吡啶的化合物。本發(fā)明提供的2-甲基-5-(3,4-二羥基苯基)吡啶是一種新型的化合物，具有清除氧自由基的能力，因而具有優(yōu)異的抗氧化活性，在開(kāi)發(fā)成為抗氧化劑方面有廣闊的應(yīng)用前景。

本發(fā)明提供的2-甲基-5-(3,4-二羥基苯基)吡啶的提取方法，首先使用醇溶液對(duì)喙尾琵琶甲粉體進(jìn)行冷浸提取，得到提取液，再通過(guò)萃取、第一硅膠柱層析分離、第二硅膠柱層析分離、ods反相柱層析分離、第三硅膠柱層析分離和凝膠柱層析分離得到2-甲基-5-(3,4-二羥基苯基)吡啶。本發(fā)明提供的提取方法步驟簡(jiǎn)單，成本低，且原料來(lái)源廣泛，容易進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1所得產(chǎn)物的h¹-h¹cosy和hmbc相關(guān)圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了一種名稱為2-甲基-5-(3,4-二羥基苯基)吡啶的化合物；具有式i所示結(jié)構(gòu)：

本發(fā)明提供的2-甲基-5-(3,4-二羥基苯基)吡啶是一種新型的化合物，具有清除氧自由基的能力，在抗氧化過(guò)程中可以釋放出氫原子與過(guò)氧化物或活潑氧自由基結(jié)合，從而中斷連鎖反應(yīng)，阻止氧化過(guò)程繼續(xù)進(jìn)行；本發(fā)明提供的2-甲基-5-(3,4-二羥基苯基)吡啶具有優(yōu)異的消除氧自由基的活性，可以保護(hù)細(xì)胞組織免受氧化作用的損害；本發(fā)明提供的2-甲基-5-(3,4-二羥基苯基)吡啶在治療與人體自由基破壞細(xì)胞功能有關(guān)的疾病方面有廣闊的應(yīng)用前景。

本發(fā)明還提供了所述2-甲基-5-(3,4-二羥基苯基)吡啶的提取方法，包括以下步驟：

使用醇溶液對(duì)喙尾琵琶甲粉體進(jìn)行冷浸提取，得到提取液；

將所述提取液依次進(jìn)行石油醚萃取、氯代甲烷萃取和乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯萃取物；

將所述乙酸乙酯萃取物進(jìn)行第一硅膠柱層析分離，得到含第一粗產(chǎn)物的流分；所述第一硅膠柱層析分離的洗脫劑為石油醚-丙酮體系或石油醚-氯仿體系；

將所述含第一粗產(chǎn)物的流分進(jìn)行第二硅膠柱層析分離，得到含第二粗產(chǎn)物的流分；所述第二硅膠柱層析分離的洗脫劑為氯仿-甲醇體系；

將所述含第二粗產(chǎn)物的流份依次進(jìn)行ods反相柱層析分離、第三硅膠柱層析分離和凝膠柱層析分離，得到2-甲基-5-(3,4-二羥基苯基)吡啶。

本發(fā)明使用醇溶液對(duì)喙尾琵琶甲粉體進(jìn)行冷浸提取，得到提取液。在本發(fā)明中，所述喙尾琵琶甲粉體的粒徑優(yōu)選為10～40目，更優(yōu)選為20目；本發(fā)明對(duì)喙尾琵琶甲粉體的制備方法沒(méi)有特殊要求，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的制備方法即可；在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，可以直接將喙尾琵琶甲藥材粉碎，得到喙尾琵琶甲粉體；如果是以鮮活喙尾琵琶甲為原始原料，也可以將鮮活喙尾琵琶甲用開(kāi)水燙死后依次進(jìn)行風(fēng)干和粉碎，得到喙尾琵琶甲粉體；本發(fā)明對(duì)所述粉碎沒(méi)有特殊要求，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的粉碎方法，能夠粉碎至所需粒徑即可，具體的如機(jī)械粉碎。

在本發(fā)明中，所述醇溶液中的醇優(yōu)選為碳原子數(shù)為1～3的醇中的一種或幾種的混合物，更優(yōu)選為甲醇和/或乙醇，最優(yōu)選為乙醇；所述醇溶液的質(zhì)量濃度優(yōu)選為90～95％，更優(yōu)選為95％；所述醇溶液和喙尾琵琶甲粉體的質(zhì)量比優(yōu)選為3～5:1，更優(yōu)選為4:1。

在本發(fā)明中，所述冷浸提取的次數(shù)優(yōu)選為2～5次，更優(yōu)選為3次；所述單次冷浸提取的時(shí)間獨(dú)立地優(yōu)選為12～48h，更優(yōu)選為24～48h；在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，當(dāng)冷浸提取次數(shù)為3次時(shí)，第一次冷浸提取的時(shí)間優(yōu)選為40～50h，更優(yōu)選為48h；第二次冷浸提取的時(shí)間優(yōu)選為15～30h，更優(yōu)選為24h；第三次冷浸提取的時(shí)間優(yōu)選為15～30h，更優(yōu)選為24h；本發(fā)明優(yōu)選將喙尾琵琶甲粉體浸泡在醇溶液中進(jìn)行冷浸提取。

在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，當(dāng)冷浸提取次數(shù)≥2次時(shí)，第一次冷浸提取完成后，本發(fā)明優(yōu)選將提取體系過(guò)濾，將過(guò)濾所得濾渣再次浸泡在醇溶液中進(jìn)行第二次提取，依次類推，最終將過(guò)濾所得濾液合并。在本發(fā)明中，所述每次冷浸提取醇溶液的用量均以初始喙尾琵琶甲粉體的質(zhì)量為基準(zhǔn)進(jìn)行計(jì)算。

冷浸提取完成后，本發(fā)明優(yōu)選將所得濾液進(jìn)行濃縮，得到提取液。本發(fā)明優(yōu)選通過(guò)減壓蒸餾將所述濾液濃縮，所述減壓蒸餾的溫度優(yōu)選≤60℃，更優(yōu)選為40～50℃；本發(fā)明對(duì)所述減壓蒸餾的時(shí)間沒(méi)有特殊要求，在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，優(yōu)選將濾液蒸餾至無(wú)醇味為止；本發(fā)明對(duì)所述減壓蒸餾的壓力沒(méi)有特殊要求，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的減壓蒸餾壓力，能夠?qū)⒋颊麴s出來(lái)即可；本發(fā)明優(yōu)選使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器進(jìn)行減壓蒸餾；本發(fā)明通過(guò)減壓蒸餾將濾液中的醇回收，并將濾液進(jìn)行濃縮，以便于后續(xù)的分離。

得到提取液后，本發(fā)明將所述提取液依次進(jìn)行石油醚萃取、氯代甲烷萃取和乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯萃取物。在本發(fā)明中，所述石油醚萃取的相比優(yōu)選為0.5～1.5:1，更優(yōu)選為1:1；所述石油醚萃取的次數(shù)優(yōu)選為2～4次，更優(yōu)選為3次；所述單次萃取的時(shí)間優(yōu)選≥1h，更優(yōu)選為1～2h，最優(yōu)選為1.5h。本發(fā)明通過(guò)石油醚萃取去除提取液中的低極性脂溶性雜質(zhì)。

石油醚萃取完成后，本發(fā)明優(yōu)選將石油醚萃取后的萃余液進(jìn)行氯代甲烷萃取。在本發(fā)明中，所述氯代甲烷優(yōu)選為氯仿或二氯甲烷；所述氯代甲烷萃取的相比優(yōu)選為0.5～1.5:1，更優(yōu)選為1:1；所述氯代甲烷萃取的次數(shù)優(yōu)選為2～4次，更優(yōu)選為3次；所述單次萃取的時(shí)間優(yōu)選≥1h，更優(yōu)選為1～2h，最優(yōu)選為1.5h。本發(fā)明通過(guò)氯代甲烷萃取將提取液中甾醇、長(zhǎng)鏈脂肪酸和一元酚酸等弱極性的物質(zhì)去除。

氯代甲烷萃取完成后，本發(fā)明優(yōu)選將氯代甲烷萃取后的萃余液進(jìn)行乙酸乙酯萃取。在本發(fā)明中，所述乙酸乙酯萃取的相比優(yōu)選為0.5～1.5:1，更優(yōu)選為1:1；所述乙酸乙酯萃取的次數(shù)優(yōu)選為2～4次，更優(yōu)選為3次；所述單次萃取的時(shí)間優(yōu)選≥1h，更優(yōu)選為1～2h，最優(yōu)選為1.5h。本發(fā)明通過(guò)乙酸乙酯萃取將提取液中極性中等的化合物萃取到乙酸乙酯相中，本發(fā)明所要提取的目標(biāo)化合物即存在于乙酸乙酯萃取相中，高極性化合物和水溶性化合物剩余在乙酸乙酯萃余液中。

乙酸乙酯萃取完成后，本發(fā)明將得到的乙酸乙酯萃取相濃縮，得到乙酸乙酯萃取物。本發(fā)明優(yōu)選通過(guò)減壓蒸餾將所述濾液濃縮，所述減壓蒸餾的溫度優(yōu)選≤60℃，更優(yōu)選為40～50℃；本發(fā)明對(duì)所述減壓蒸餾的時(shí)間沒(méi)有特殊要求，在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，優(yōu)選將乙酸乙酯萃取相蒸餾至干；本發(fā)明對(duì)所述減壓蒸餾的壓力沒(méi)有特殊要求，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的減壓蒸餾壓力，能夠?qū)⒁宜嵋阴フ麴s出來(lái)即可；本發(fā)明優(yōu)選使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器進(jìn)行減壓蒸餾；本發(fā)明通過(guò)減壓蒸餾將乙酸乙酯萃取相中的乙酸乙酯溶劑回收，并將乙酸乙酯萃取相進(jìn)行濃縮，以便于后續(xù)的分離。

得到乙酸乙酯萃取物后，本發(fā)明將所述乙酸乙酯萃取物進(jìn)行第一硅膠柱層析分離，得到含第一粗產(chǎn)物的流分。在本發(fā)明中，所述第一硅膠柱層析分離用硅膠的粒徑優(yōu)選為80～100目或100～150目，更優(yōu)選為80～100目；所述第一硅膠柱層析分離的溫度優(yōu)選為室溫，無(wú)需進(jìn)行額外的加熱或降溫；所述第一硅膠柱層析分離的壓力優(yōu)選為常壓。

在本發(fā)明中，所述第一硅膠柱層析分離的洗脫劑為石油醚-丙酮體系或石油醚-氯仿體系；所述第一硅膠柱層析分離的洗脫方式優(yōu)選為梯度洗脫；所述梯度洗脫優(yōu)選為11個(gè)梯度；所述各梯度洗脫劑中石油醚和丙酮(或石油醚和氯仿)的體積比優(yōu)選依次為10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9、0:10；所述洗脫劑的流速優(yōu)選為10～30ml/min，更優(yōu)選為15～20ml/min；本發(fā)明在梯度洗脫過(guò)程中將流份收集，按照上述洗脫劑比例依次得到11種流份(按照極性從小到大分別記為fra、frb、frc、frd、fre、frf、frg、frh、fri、frj、frk)。本發(fā)明通過(guò)梯度洗脫將乙酸乙酯萃取物中不同極性的化合物逐步洗脫出來(lái)，其中frc流份即為本發(fā)明所述的含有第一粗產(chǎn)物的流份(在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，可以對(duì)所得各個(gè)流份進(jìn)行薄層色譜tlc或高效液相色譜hplc檢測(cè)，以確定含有目標(biāo)化合物的流份)；在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，為簡(jiǎn)化試驗(yàn)步驟，可僅進(jìn)行前3個(gè)梯度的洗脫，得到frc流份即可，后續(xù)的洗脫過(guò)程可省略。本發(fā)明通過(guò)第一硅膠柱層析對(duì)乙酸乙酯萃取物中的化合物進(jìn)行初步分離。

得到含有第一粗產(chǎn)物的流份后，本發(fā)明將所述含第一粗產(chǎn)物的流分進(jìn)行第二硅膠柱層析分離，得到含第二粗產(chǎn)物的流分。在本發(fā)明中，所述第二硅膠柱層析分離用硅膠的粒徑優(yōu)選為200～300目或300～400目，更優(yōu)選為300～400目；所述第二硅膠柱層析分離的溫度優(yōu)選為室溫，無(wú)需進(jìn)行額外的加熱或降溫；本發(fā)明對(duì)所述第二硅膠柱層析分離的洗脫壓力沒(méi)有特殊要求，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的洗脫壓力即可，在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，優(yōu)選使用小型空氣加壓泵于柱頂加壓洗脫，以加快洗脫速度。

在本發(fā)明中，所述第二硅膠柱層析分離的洗脫劑為氯仿-甲醇體系；所述第二硅膠柱層析分離的洗脫方式優(yōu)選為梯度洗脫；所述梯度洗脫優(yōu)選按照氯仿和甲醇的體積比為100:1→3:1比例進(jìn)行洗脫；在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，所述梯度洗脫優(yōu)選為6～10個(gè)梯度；所述各梯度洗脫劑中氯仿和甲醇的體積比優(yōu)選依次為100:1、50:1、25:1、12.5:1、10:1、5:1、4:1、3:1。在本發(fā)明中，所述洗脫劑的流速優(yōu)選為5～20ml/min，更優(yōu)選為10～15ml/min；本發(fā)明對(duì)所述第二硅膠柱層析分離的洗脫壓力沒(méi)有特殊要求，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的洗脫壓力，能夠達(dá)到要求的流速即可；在本發(fā)明的具體實(shí)施例中優(yōu)選使用小型空氣加壓泵于柱頂加壓洗脫，以使洗脫速度達(dá)到要求。

本發(fā)明在第二硅膠柱層析分離梯度洗脫過(guò)程中將流份收集，并將相同的流份合并(在本發(fā)明的實(shí)施例中，可使用硅膠薄層板進(jìn)行點(diǎn)板分析，然后將相同流分進(jìn)行合并，也可以采用hplc檢測(cè)合并)，共得到7種流份(按照極性從小到大依次記為frc1、frc2、frc3、frc4、frc5、frc6、frc7)。本發(fā)明通過(guò)梯度洗脫進(jìn)一步將第一粗產(chǎn)物中不同極性的化合物逐步洗脫出來(lái)，其中frc5流份即為本發(fā)明所述的含有第二粗產(chǎn)物的流份(在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，可以對(duì)所得各個(gè)流份進(jìn)行tlc或hplc檢測(cè)，以確定含有目標(biāo)化合物的流份)。本發(fā)明通過(guò)第二硅膠柱層析將第一粗產(chǎn)物中的化合物進(jìn)一步分離。

得到含有第二粗產(chǎn)物的流份后，本發(fā)明將所述含第二粗產(chǎn)物的流份進(jìn)行ods反相柱層析分離，得到含第三粗產(chǎn)物流份。在本發(fā)明中，所述ods(十八烷基硅烷)反相柱層析分離的洗脫方式為等度洗脫；所述ods反相柱層析分離的洗脫劑為甲醇/水體系；所述洗脫劑中甲醇和水的體積比優(yōu)選為15～25:75～85，更優(yōu)選為20:80；所述洗脫劑的流速優(yōu)選為0.5～2ml/min，更優(yōu)選為1～1.5ml/min；所述ods柱層析分離的溫度優(yōu)選為室溫，無(wú)需進(jìn)行額外的加熱或降溫；本發(fā)明對(duì)所述ods柱層析分離的洗脫壓力優(yōu)選使用小型空氣加壓泵于柱頂加壓洗脫，以使洗脫速度達(dá)到要求；在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，優(yōu)選對(duì)洗脫液進(jìn)行tlc檢測(cè)，將組分相同流份合并，獲得4種流份，按洗脫順序依次記為frc5-1，frc5-2，frc5-3，frc5-4，其中frc5-2流份即為本發(fā)明所述的含有第三粗產(chǎn)物的流份(在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，可以對(duì)所得各個(gè)流份進(jìn)行tlc、hplc檢測(cè)，以確定含有目標(biāo)化合物的流份)。本發(fā)明通過(guò)ods柱層析將第二粗產(chǎn)物中的化合物進(jìn)一步分離。

得到含第三粗產(chǎn)物的流份后，本發(fā)明將所述含第三粗產(chǎn)物的流份依次進(jìn)行第三硅膠柱層析分離和凝膠柱層析分離，得到2-甲基-5-(3,4-二羥基苯基)吡啶。

在本發(fā)明中，所述第三硅膠柱層析分離的洗脫方式優(yōu)選為等度洗脫；所述第三硅膠柱層析分離的洗脫劑優(yōu)選為氯仿-甲醇體系；所述洗脫劑中氯仿和甲醇的體積比優(yōu)選為6～10:1，更優(yōu)選為8:1；所述洗脫劑的流速優(yōu)選為1～3ml/min，更優(yōu)選為1.5～2.5ml/min。在本發(fā)明中，所述第三硅膠柱層析分離使用的硅膠的粒徑優(yōu)選為200～300目或300～400目，更優(yōu)選為300～400目；所述第三硅膠柱層析分離的溫度優(yōu)選為室溫，無(wú)需進(jìn)行額外的加熱或降溫；本發(fā)明對(duì)所述第三硅膠柱層析分離的洗脫壓力沒(méi)有特殊要求，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的洗脫壓力，能夠達(dá)到要求的流速即可；在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，優(yōu)選使用小型空氣加壓泵于柱頂加壓洗脫，以使洗脫速度達(dá)到要求；在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，可以對(duì)洗脫液進(jìn)行tlc、hplc檢測(cè)，以跟蹤目標(biāo)化合物。本發(fā)明通過(guò)第三硅膠柱層析將ods反相柱層析洗脫液進(jìn)一步純化。

第三硅膠柱層析分離完成后，本發(fā)明將得到的第三硅膠柱層析洗脫液進(jìn)行凝膠柱層析分離，得到2-甲基-5-(3,4-二羥基苯基)吡啶。在本發(fā)明中，所述凝膠柱層析分離的層析介質(zhì)優(yōu)選為葡聚糖凝膠或瓊脂糖凝膠，更優(yōu)選為葡萄糖凝膠，在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，優(yōu)選使用sephadexlh-20(羥丙基葡萄糖凝膠)作為層析介質(zhì)；所述凝膠柱層析分離的洗脫方式優(yōu)選為等度洗脫；所述凝膠柱層析分離的洗脫劑優(yōu)選為甲醇；所述洗脫劑的流速優(yōu)選為0.5～2ml/min，更優(yōu)選為1～1.5ml/min。本發(fā)明對(duì)所述凝膠柱層析分離的具體操作方法沒(méi)有特殊要求，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的凝膠柱層析分離方法即可；優(yōu)選采用恒流泵于柱頂添加洗脫劑；在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，可以對(duì)洗脫液進(jìn)行tlc、hplc檢測(cè)，以跟蹤目標(biāo)化合物。本發(fā)明通過(guò)凝膠柱層析分離將第三硅膠柱層析洗脫液中極性相近而分子量不同的雜質(zhì)去除，得到含有2-甲基-5-(3,4-二羥基苯基)吡啶的洗脫液。

凝膠柱層析分離后，本發(fā)明優(yōu)選將得到的含有2-甲基-5-(3,4-二羥基苯基)吡啶的洗脫液中的洗脫劑去除，得到2-甲基-5-(3,4-二羥基苯基)吡啶。本發(fā)明優(yōu)選通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將洗脫劑去除，本發(fā)明對(duì)所述旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的具體條件沒(méi)有特殊要求，能夠?qū)⑾疵搫┤コ耆纯?；本發(fā)明對(duì)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的時(shí)間沒(méi)有特殊要求，旋蒸至干即可。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，旋蒸至干后，得到白色固體，即為2-甲基-5-(3,4-二羥基苯基)吡啶；命名為喙尾琵琶甲素c。

本發(fā)明還提供了上述方案所述的2-甲基-5-(3,4-二羥基苯基)吡啶或上述方案所述提取方法得到的2-甲基-5-(3,4-二羥基苯基)吡啶在制備清除氧自由基藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的2-甲基-5-(3,4-二羥基苯基)吡啶具有清除氧自由基的能力，在抗氧化過(guò)程中可以釋放出氫原子與過(guò)氧化物結(jié)合，從而中斷連鎖反應(yīng)，阻止氧化過(guò)程繼續(xù)進(jìn)行；在治療與人體自由基破壞細(xì)胞功能有關(guān)的疾病方面有廣闊的應(yīng)用前景。

本發(fā)明對(duì)所述2-甲基-5-(3,4-二羥基苯基)吡啶在制備清除氧自由基藥物中的具體應(yīng)用方法沒(méi)有特殊要求，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行應(yīng)用即可。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，可以將2-甲基-5-(3,4-二羥基苯基)吡啶和微晶纖維素混合，采用乙醇濕法治粒的方法制備具有清除氧自由基作用的膠囊；所述膠囊中2-甲基-5-(3,4-二羥基苯基)吡啶的含量?jī)?yōu)選為10～30g/100g。

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的2-甲基-5-(3,4-二羥基苯基)吡啶及其提取方法和應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明，但是不能把它們理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。

實(shí)施例1

取喙尾琵琶甲干粉5kg，采用95％乙醇冷浸提取三次(乙醇和喙尾琵琶甲干粉的質(zhì)量比為3:1，第一次提取時(shí)間為48h，第二次提取時(shí)間為12h，第三次提取時(shí)間為12h)，將三次提取的濾液合并，將濾液減壓蒸餾至無(wú)醇味，得到冷浸提取液；將冷浸提取液依次用石油醚(相比為1:1，萃取3次)、氯仿(相比為1:1，萃取3次)、乙酸乙酯(相比為1:1，萃取3次)萃取，將乙酸乙酯萃取相合并，然后進(jìn)行減壓蒸餾，將乙酸乙酯回收，得到乙酸乙酯萃取物；乙酸乙酯萃取物(200g)經(jīng)硅膠柱層析分離，以石油醚:丙酮(v:v＝10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9、0:10)梯度洗脫得到fra～frk流分，將frc流份經(jīng)硅膠柱層析分離，以氯仿：甲醇(v:v＝100:1→3:1)進(jìn)行梯度洗脫，得到frc1～frc7流份；對(duì)frc5流份進(jìn)行十八烷基硅烷(ods)反相柱層析(甲醇和水體積比為20:80進(jìn)行洗脫)，得到frc5-1～frc5-4流份；將frc5-2流份依次進(jìn)行硅膠柱層析(氯仿和甲醇的體積比為5:1進(jìn)行洗脫)、葡聚糖凝膠(sephadexlh-20)柱層析(甲醇洗脫)，將洗脫液旋蒸至干，除去洗脫劑，得到固體產(chǎn)物(白色固體)8mg。

對(duì)所得白色固體產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定：

使用紅外圖譜對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行分析，得到如下數(shù)據(jù)：ir(kbr,cm^-1)νmax:3342,2959,1740,1603,1519,1430,1290,1195,1110,944,805。

使用hr-esi-ms對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果顯示m/e:202.0859(計(jì)：202.0868，m+h,)，推算分子式為c12h11no2。

所得產(chǎn)物的核磁共振碳譜和核磁共振氫譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表1，碳譜數(shù)據(jù)顯示1個(gè)伯碳，6個(gè)叔碳，5個(gè)季碳共12個(gè)信號(hào)

氫譜低場(chǎng)信號(hào)顯示有兩組3取代芳香環(huán)，耦合常數(shù)提示均為1,3,4取代。根據(jù)13c化學(xué)位移值及hmbc相關(guān)信號(hào)提示存在3,4-二羥基苯基片段。但另一個(gè)芳環(huán)3組1h信號(hào)明顯偏低場(chǎng)，提示可能與強(qiáng)吸電子性基團(tuán)相連或?yàn)槿宝蟹辑h(huán)；而高場(chǎng)提示有1個(gè)甲基信號(hào)，hmbc提示直接與該芳環(huán)相連，結(jié)合分子式，推測(cè)另一個(gè)芳香環(huán)可能為吡啶環(huán)，且直接和苯環(huán)相連。

通過(guò)hmqc各hmbc對(duì)核磁共振碳譜和核磁共振氫譜信號(hào)進(jìn)行歸屬，所得結(jié)果如表1所示；

所得產(chǎn)物的h-hcosy和hmbc相關(guān)圖如圖1所示，通過(guò)解析hmbc相關(guān)信號(hào)，可知δ2.49的甲基僅主要與155.98(c2)和123.24(c3)相關(guān)，提示甲基處于吡啶環(huán)的2位；δ129.30(c1′)與同環(huán)的h-4(δ6.90)及吡啶環(huán)中h-4(δ7.80)和h-6(δ8.64)相關(guān)，而δ133.62(c5)同時(shí)與苯環(huán)中的h-2′(δ7.11)，h-6′(δ6.97)及吡啶環(huán)中的h-3(δ7.24)相關(guān)，推測(cè)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)為2-甲基吡啶的5號(hào)位與1,2-二苯酚的4號(hào)位相連。

根據(jù)以上分析，可以確定所得產(chǎn)物結(jié)構(gòu)為2-甲基-5-(3,4-二羥基苯基)吡啶。

表1實(shí)施例1所得產(chǎn)物的核磁共振碳譜和核磁共振氫譜數(shù)據(jù)

注：核磁共振波譜數(shù)據(jù)在brukerav-400型核磁共振波譜儀測(cè)定(δ單位為ppm，j為耦合常數(shù)，用括號(hào)中的數(shù)字表示，單位為hz)；測(cè)試所用氘代溶劑為氘代甲醇cd3od；表1中的原子編號(hào)對(duì)應(yīng)圖1中的原子編號(hào)；d為雙重峰，dd為雙雙重峰。

實(shí)施例2

取喙尾琵琶甲干粉5kg，采用95％乙醇冷浸提取三次(乙醇和喙尾琵琶甲干粉的質(zhì)量比為3:1，第一次提取時(shí)間為48h，第二次提取時(shí)間為12h，第三次提取時(shí)間為12h)，將三次提取的濾液合并，將濾液減壓蒸餾至無(wú)醇味，得到冷浸提取液；將冷浸提取液依次用石油醚(相比為1.1:1，萃取3次)、二氯甲烷(相比為1.1:1，萃取3次)、乙酸乙酯(相比為1:1，萃取3次)萃取，將乙酸乙酯萃取相合并，然后進(jìn)行減壓蒸餾，將乙酸乙酯回收，得到乙酸乙酯萃取物；乙酸乙酯萃取物(200g)經(jīng)硅膠柱層析分離，以石油醚:氯仿(v:v＝10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9、0:10)梯度洗脫得到fra～frk流分，將frc流份經(jīng)硅膠柱層析分離，以氯仿：甲醇(v:v＝100:1→3:1)進(jìn)行梯度洗脫，得到frc1～frc7流份；對(duì)frc5流份進(jìn)行十八烷基硅烷(ods)反相柱層析(甲醇和水體積比為20:80進(jìn)行洗脫)得到frc5-1～frc5-4流份；將frc5-2流份依次進(jìn)行硅膠柱層析(氯仿和甲醇的體積比為5:1進(jìn)行洗脫)、葡聚糖凝膠(sephadexlh-20)柱層析(甲醇洗脫)，將洗脫液旋蒸至干，除去洗脫劑，得到固體產(chǎn)物(白色固體)8mg。

利用實(shí)施例1中的方法對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，鑒定結(jié)果和實(shí)施例1一致，所得白色固體即為2-甲基-5-(3,4-二羥基苯基)吡啶。

實(shí)施例3

1,1-二苯基-二苦基肼(dpph)是一種比較穩(wěn)定的脂性自由基，其n上有一個(gè)游離電子，其乙醇溶液呈紫色，經(jīng)全波長(zhǎng)掃描可知其在517nm處有最大吸收峰。加入抗氧化劑以后，dpph捕捉一個(gè)電子與游離電子配對(duì)，紫色褪去，變?yōu)闊o(wú)色物質(zhì)，在517nm處吸收峰消失，褪色程度與其接受的電子數(shù)成定量關(guān)系。即dpph被氧化還原時(shí)吸收值下降，吸光度越低，其抗氧化作用越強(qiáng)。據(jù)此原理測(cè)定樣品提供氫原子、清除自由基、抗氧化的能力。

對(duì)實(shí)施例1所得2-甲基-5-(3,4-二羥基苯基)吡啶進(jìn)行抗氧化活性測(cè)試，測(cè)試步驟如下：

(1)dpph溶液的配制：精密稱取0.0050克的dpph，用無(wú)水乙醇溶解，并定量轉(zhuǎn)入25毫升(ml)棕色容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容、搖勻，得質(zhì)量濃度為200毫克/升(mg/l)的dpph溶液。

(2)清除dpph·能力的測(cè)定：使用無(wú)水乙醇將實(shí)施例1所得2-甲基-5-(3,4-二羥基苯基)吡啶配制成不同濃度的溶液，作為待測(cè)樣品溶液；待測(cè)樣品溶液的濃度梯度為：256μg/ml，128μg/ml，64μg/ml，32μg/ml，16μg/ml，8μg/ml，4μg/ml；

以維生素c(vitc)溶液為陽(yáng)性對(duì)照，按照相同的方法檢測(cè)維生素c的清除自由基活性，維生素c檢測(cè)濃度梯度為：128，64，32，16，8，4，2μg/ml。

取不同濃度的待測(cè)樣品溶液、不同濃度的vitc溶液、無(wú)水乙醇置于96孔板中，平行三個(gè)復(fù)孔，每孔50微升(μl)，并加入dpph溶液50μl，混勻；另于三個(gè)復(fù)孔中各加入100μl無(wú)水乙醇作為空白對(duì)照，室溫下暗室放置30分鐘，用酶標(biāo)儀于517nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品、陽(yáng)性對(duì)照吸光度(ai)、空白對(duì)照吸光度(a0)、dpph溶液吸光度(aj)。

(3)自由基清除率(k)計(jì)算公式：k＝[1－(ai－a0)/(aj－a0]×100％。

(4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：清除50％自由基時(shí)的待測(cè)化合物濃度為ic50值，以待測(cè)化合物濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)，dpph自由基清除率k(％)為縱坐標(biāo)，繪制樣品的清除率曲線，根據(jù)曲線計(jì)算線性回歸方程，并根據(jù)回歸方程計(jì)算ic50值，所得ic50值為三次結(jié)果的平均值，所得結(jié)果如表2所示：

表2實(shí)施例1所得產(chǎn)物清除dpph自由基活性數(shù)據(jù)

根據(jù)表1中的結(jié)果可以看出，本發(fā)明提供的2-甲基-5-(3,4-二羥基苯基)吡啶具有對(duì)dpph自由基的清除活性，其對(duì)dpph自由基清除能力與維生素c相當(dāng)。說(shuō)明2-甲基-5-(3,4-二羥基苯基)吡啶具有良好的清除氧自由基的能力，在治療與人體自由基破壞細(xì)胞功能有關(guān)的疾病方面有廣闊的應(yīng)用前景。

由以上實(shí)施例可知，本發(fā)明以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。