本發(fā)明涉及藥物代謝動力學(xué)研究領(lǐng)域，尤其涉及用于研究藥物吸收的心肌纖維化細(xì)胞模型的建立方法。
背景技術(shù)：
心肌纖維化(myocardialfibrosis，mf)主要表現(xiàn)為心肌成纖維細(xì)胞(cardiacfibroblasts，cfs)數(shù)目增多和心肌細(xì)胞外間質(zhì)膠原過度沉積，發(fā)生于許多心血管疾病。cfs具有潛在較強(qiáng)分裂能力，且可合成和分泌基質(zhì)蛋白、i型和ⅲ型膠原纖維，因此有效抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡是防治心肌纖維化的策略之一。
成纖維細(xì)胞(cardiacfibroblasts，cfb)位于心臟間質(zhì)與動靜脈血管壁，占心臟非心肌細(xì)胞的90％-95％，是合成心肌膠原的主要細(xì)胞。cfb首先在體內(nèi)合成膠原前體即前膠原(procollagen)，由3條前α鏈組成，每一個前膠原分子的n端和c端分別含有1個前肽，成熟時前膠原分子經(jīng)胞吐作用被分泌至細(xì)胞外，受前膠原肽酶的作用，去除n端和c端的前肽，形成膠原。cfb具有潛在較強(qiáng)分裂能力，可合成和分泌多種基質(zhì)蛋白，有學(xué)者認(rèn)為，cfb活化是纖維化形成過程中的關(guān)鍵步驟。對cfb活化規(guī)律的研究表明，在正常的心肌cfb處于靜止?fàn)顟B(tài)，數(shù)量很少。只有在病理性刺激下，cfb才發(fā)生遷移、增殖、合成細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ecm)即發(fā)生cfb的活化。
cfb在一些理化介導(dǎo)因素如血管緊張素ⅱ(angⅱ)、生長因子、炎性細(xì)胞因子等刺激下能分泌一些促進(jìn)和抑制生長的細(xì)胞活性物質(zhì)，并通過這些物質(zhì)調(diào)控cfb的結(jié)構(gòu)和功能。pdgf為血小板衍生的生長因子，在促進(jìn)心肌cfb增生和膠原的蓄積方面起著重要的作用。
原代分離培養(yǎng)心肌細(xì)胞是一項(xiàng)費(fèi)時、費(fèi)力、耗資較大的工作，激活的大鼠成纖維細(xì)胞rat-icell-c002，具有穩(wěn)定的形態(tài)與細(xì)胞生物學(xué)特性，用rat-icell-c002細(xì)胞替代分離培養(yǎng)激活的心肌細(xì)胞則可使研究簡單易行。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題，本案提供用于研究藥物吸收的心肌纖維化細(xì)胞模型的建立方法。
用于研究藥物吸收的心肌纖維化細(xì)胞模型的建立方法，包括以下步驟：
(1)將大鼠心肌成纖維細(xì)胞采用高糖dmem培養(yǎng)液于體積濃度為5％的co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代；
(2)取步驟(1)中第四代后生長良好的大鼠心肌成纖維細(xì)胞于24孔板的transwell小室的濾膜上構(gòu)建心肌成纖維細(xì)胞模型；
(3)采用hbss培養(yǎng)液洗滌步驟(2)得到的心肌成纖維細(xì)胞模型3-5次；
(4)測定步驟(3)所得的心肌成纖維細(xì)胞模型的跨膜電阻值；
(5)取步驟(4)中跨膜電阻值大于500ω的心肌成纖維細(xì)胞模型，加入到含有pdgf的hbss培養(yǎng)液中培養(yǎng)24-48h，獲得心肌纖維化細(xì)胞模型；
(6)另取步驟(4)中跨膜電阻值大于500ω的心肌成纖維細(xì)胞模型加入到不含有pdgf的hbss培養(yǎng)液中培養(yǎng)24-48h，獲得心肌纖維化細(xì)胞模型的空白對照樣；
(7)測定該心肌纖維化細(xì)胞模型和空白對照樣的吸光度值，以判斷心肌纖維化細(xì)胞模型是否建立成功。
優(yōu)選的是，所述的用于研究藥物吸收的心肌纖維化細(xì)胞模型的建立方法，其中，所述高糖dmem培養(yǎng)液是將fbs120ml、100×天門冬氨酸15ml、青霉素160000單位和鏈霉素200mg溶于900mldmem高糖培養(yǎng)基中所得的培養(yǎng)液。
優(yōu)選的是，所述的用于研究藥物吸收的心肌纖維化細(xì)胞模型的建立方法，其中，所述步驟(1)中培養(yǎng)條件是指溫度為37℃，濕度為80-90％。
優(yōu)選的是，所述的用于研究藥物吸收的心肌纖維化細(xì)胞模型的建立方法，其中，所述步驟(2)中心肌成纖維細(xì)胞模型的構(gòu)建方法是指首先采用高糖dmem培養(yǎng)液將步驟(1)所得的心肌成纖維細(xì)胞制成5×105個/ml的懸液；然后將心肌成纖維細(xì)胞接種于所述24孔板transwell小室的濾膜上，并控制接種濃度為1×104-1.2×104個/cm2，培養(yǎng)28-35天即可。
優(yōu)選的是，所述的用于研究藥物吸收的心肌纖維化細(xì)胞模型的建立方法，其中，所述hbss培養(yǎng)液是將10g/lnacl、30mg/lkh2po4、48mg/lnahpo4、1.2g/l葡萄糖溶于hank's液，并用質(zhì)量濃度為1％的hcl溶液或質(zhì)量濃度為5％的naoh溶液調(diào)整ph值至7.2的溶液。
優(yōu)選的是，所述的用于研究藥物吸收的心肌纖維化細(xì)胞模型的建立方法，其中，所述步驟(5)中hbss培養(yǎng)液中pdgf的濃度為20-50ng/ml。
優(yōu)選的是，所述的用于研究藥物吸收的心肌纖維化細(xì)胞模型的建立方法，其中，所述心肌纖維化細(xì)胞模型的吸光度值的測定方法是向待測細(xì)胞中加入10mg/ml的mtt溶液，3h后棄去培養(yǎng)基中的上清液，每孔加入dmso100μl，于室溫以50rpm轉(zhuǎn)速水平回旋震搖，30min后用酶標(biāo)儀測定490nm波長處的吸光度。
本發(fā)明的有益效果是：
本發(fā)明以大鼠心肌成纖維細(xì)胞為基礎(chǔ)，通過pdgf培養(yǎng)，建立了藥物吸收的心肌纖維化細(xì)胞模型，操作簡單，經(jīng)濟(jì)科學(xué)，可實(shí)現(xiàn)高通量測定，對心肌纖維化人群個體化用藥，合理用藥具有較大的促進(jìn)作用。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。
實(shí)施例1：
大鼠心肌成纖維細(xì)胞購自-賽百慷(上海)生物技術(shù)股份有限公司的rat-icell-c002細(xì)胞，細(xì)胞純度高于90％。
(1)將rat-icell-c002細(xì)胞采用高糖dmem培養(yǎng)液于37℃、濕度80％、體積濃度為5％的co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每兩天換液一次，至下一代傳代；
所述高糖dmem培養(yǎng)液是指將fbs120ml、100×天門冬氨酸15ml、青霉素16000單位和鏈霉素200mg溶于900mldmem高糖培養(yǎng)基中所得的培養(yǎng)液。
(2)取步驟(1)中第四代后生長良好的大鼠心肌成纖維細(xì)胞于24孔板的transwell小室的濾膜上構(gòu)建心肌成纖維細(xì)胞模型；
其中：rat-icell-c002心肌成纖維細(xì)胞模型的構(gòu)建方法是指首先采用高糖dmem培養(yǎng)液將所述步驟(1)所得的rat-icell-c002細(xì)胞制成5×105個/ml的懸液；然后將1×104個/cm2接種rat-icell-c002細(xì)胞于所述24孔板transwell小室的濾膜上，培養(yǎng)28天即得；其中接種24h后換液，前兩周隔天換液，之后每天換液。
(3)棄去所述transwell小室中的培養(yǎng)基，采用hbss洗所述rat-icell-c002心肌成纖維細(xì)胞模型3次；
所述hbss培養(yǎng)液是將10g/lnacl、30mg/lkh2po4、48mg/lnahpo4、1.2g/l葡萄糖溶于hank's液，并用質(zhì)量濃度為1％的hcl溶液或質(zhì)量濃度為5％的naoh溶液調(diào)整ph值至7.2的溶液。
(4)測定所述步驟(3)所得的rat-icell-c002心肌成纖維細(xì)胞模型的跨膜電阻值，當(dāng)跨膜電阻值大于500ω時，則為合格的細(xì)胞rat-icell-c002心肌成纖維細(xì)胞模型；
(5)取步驟(4)中跨膜電阻值大于500ω的心肌成纖維細(xì)胞模型，加入到含有pdgf的hbss培養(yǎng)液中培養(yǎng)48h，獲得心肌纖維化細(xì)胞模型；
其中：pdgf的濃度為20ng/ml。
(6)另取步驟(4)中跨膜電阻值大于500ω的心肌成纖維細(xì)胞模型加入到不含有pdgf的hbss培養(yǎng)液中培養(yǎng)48h，獲得心肌纖維化細(xì)胞模型的空白對照樣；
(7)測定所述步驟(6)所得的細(xì)胞rat-icell-c002心肌纖維化細(xì)胞模型的吸光度值即可完成模型評價(jià)。
棄去所述transwell小室中的hbss，加入新的hbss，置37℃恒溫?fù)u床上，對所述步驟(5)和(6)培養(yǎng)的rat-icell-c002心肌成纖維細(xì)胞模型以100rpm的速度洗20min；
細(xì)胞rat-icell-c002心肌纖維化細(xì)胞模型吸光度值的測定方法是指向兩組細(xì)胞中，加入10mg/ml的四甲基偶氮唑鹽(mtt)溶液，每孔加入5μl，3h后吸棄培養(yǎng)基中上清液，每孔加入dmso100μl，于室溫以50rpm速率水平回旋震搖，30min后用酶標(biāo)儀測定490nm波長處每組吸光度。每個濃度或時間點(diǎn)重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。
空白對照組和增殖對照組a值分別為(0.2205±0.0200)和(0.3235±0.0140)，可見pdgf培養(yǎng)可顯著提高心肌纖維化細(xì)胞對的代謝率，吸光度值明顯升高，與空白對照組比較差異有極顯著性(p<0.01)，說明心肌纖維化模型已建立。
實(shí)施例2：
(1)將rat-icell-c002細(xì)胞采用高糖dmem培養(yǎng)液于37℃、濕度85％、體積濃度為5％的co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每兩天換液一次，至下一代傳代；
其中高糖dmem培養(yǎng)液同實(shí)施例1。
(2)取步驟(1)中第四代后生長良好的大鼠心肌成纖維細(xì)胞于24孔板的transwell小室的濾膜上構(gòu)建心肌成纖維細(xì)胞模型；
其中：rat-icell-c002心肌成纖維細(xì)胞模型的構(gòu)建方法是指首先采用高糖dmem培養(yǎng)液將所述步驟(1)所得的rat-icell-c002細(xì)胞制成5×105個/ml的懸液；然后將1.2×104個/cm2接種rat-icell-c002細(xì)胞于所述24孔板transwell小室的濾膜上，培養(yǎng)30天即得；其中接種24h后換液，前兩周隔天換液，之后每天換液。
(3)棄去所述transwell小室中的培養(yǎng)基，采用hbss洗所述rat-icell-c002心肌成纖維細(xì)胞模型5次；
其中hbss同實(shí)施例1。
(4)測定所述步驟(3)所得的rat-icell-c002心肌成纖維細(xì)胞模型的跨膜電阻值，當(dāng)跨膜電阻值大于500ω時，則為合格的細(xì)胞rat-icell-c002心肌成纖維細(xì)胞模型；
(5)取步驟(4)中跨膜電阻值大于500ω的心肌成纖維細(xì)胞模型，加入到含有pdgf的hbss培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h，獲得心肌纖維化細(xì)胞模型；
其中：pdgf的濃度為20ng/ml。
(6)另取步驟(4)中跨膜電阻值大于500ω的心肌成纖維細(xì)胞模型加入到不含有pdgf的hbss培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h，獲得心肌纖維化細(xì)胞模型的空白對照樣；
(7)測定所述步驟(6)所得的細(xì)胞rat-icell-c002心肌纖維化細(xì)胞模型的吸光度值即可完成模型評價(jià)。
其中細(xì)胞rat-icell-c002心肌纖維化細(xì)胞模型吸光度值的測定方法同實(shí)施例1。
空白對照組和增殖對照組a值分別為(0.2135±0.0197)和(0.3510±0.0112)，可見pdgf培養(yǎng)可顯著提高心肌纖維化細(xì)胞對的代謝率，吸光度值明顯升高，與空白對照組比較差異有極顯著性(p<0.01)，說明心肌纖維化模型已建立。
實(shí)施例3：
(1)將rat-icell-c002細(xì)胞采用高糖dmem培養(yǎng)液于37℃、濕度90％、體積濃度為5％的co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每兩天換液一次，至下一代傳代；
其中高糖dmem培養(yǎng)液同實(shí)施例1。
(2)取步驟(1)中第四代后生長良好的大鼠心肌成纖維細(xì)胞于24孔板的transwell小室的濾膜上構(gòu)建心肌成纖維細(xì)胞模型；
其中：rat-icell-c002心肌成纖維細(xì)胞模型的構(gòu)建方法是指首先采用高糖dmem培養(yǎng)液將所述步驟(1)所得的rat-icell-c002細(xì)胞制成5×105個/ml的懸液；然后將1.1×104個/cm2接種rat-icell-c002細(xì)胞于所述24孔板transwell小室的濾膜上，培養(yǎng)35天即得；其中接種24h后換液，前兩周隔天換液，之后每天換液。
(3)棄去所述transwell小室中的培養(yǎng)基，采用hbss洗所述rat-icell-c002心肌成纖維細(xì)胞模型5次；
其中hbss同實(shí)施例1。
(4)測定所述步驟(3)所得的rat-icell-c002心肌成纖維細(xì)胞模型的跨膜電阻值，當(dāng)跨膜電阻值大于500ω時，則為合格的細(xì)胞rat-icell-c002心肌成纖維細(xì)胞模型；
(5)取步驟(4)中跨膜電阻值大于500ω的心肌成纖維細(xì)胞模型，加入到含有pdgf的hbss培養(yǎng)液中培養(yǎng)36h，獲得心肌纖維化細(xì)胞模型；
其中：pdgf的濃度為35ng/ml。
(6)另取步驟(4)中跨膜電阻值大于500ω的心肌成纖維細(xì)胞模型加入到不含有pdgf的hbss培養(yǎng)液中培養(yǎng)36h，獲得心肌纖維化細(xì)胞模型的空白對照樣；
(7)測定所述步驟(6)所得的細(xì)胞rat-icell-c002心肌纖維化細(xì)胞模型的吸光度值即可完成模型評價(jià)。
其中細(xì)胞rat-icell-c002心肌纖維化細(xì)胞模型吸光度值的測定方法同實(shí)施例1。
空白對照組和增殖對照組a值分別為(0.2017±0.0187)和(0.3240±0.0142)，可見pdgf培養(yǎng)可顯著提高心肌纖維化細(xì)胞對的代謝率，吸光度值明顯升高，與空白對照組比較差異有極顯著性(p<0.01)，說明心肌纖維化模型已建立。
實(shí)施例4：
(1)將rat-icell-c002細(xì)胞采用高糖dmem培養(yǎng)液于37℃、濕度88％、體積濃度為5％的co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每兩天換液一次，至下一代傳代；
其中高糖dmem培養(yǎng)液同實(shí)施例1。
(2)取步驟(1)中第四代后生長良好的大鼠心肌成纖維細(xì)胞于24孔板的transwell小室的濾膜上構(gòu)建心肌成纖維細(xì)胞模型；
其中：rat-icell-c002心肌成纖維細(xì)胞模型的構(gòu)建方法是指首先采用高糖dmem培養(yǎng)液將所述步驟(1)所得的rat-icell-c002細(xì)胞制成5×105個/ml的懸液；然后將1.2×104個/cm2接種rat-icell-c002細(xì)胞于所述24孔板transwell小室的濾膜上，培養(yǎng)28天即得；其中接種24h后換液，前兩周隔天換液，之后每天換液。
(3)棄去所述transwell小室中的培養(yǎng)基，采用hbss洗所述rat-icell-c002心肌成纖維細(xì)胞模型4次；
其中hbss同實(shí)施例1。
(4)測定所述步驟(3)所得的rat-icell-c002心肌成纖維細(xì)胞模型的跨膜電阻值，當(dāng)跨膜電阻值大于500ω時，則為合格的細(xì)胞rat-icell-c002心肌成纖維細(xì)胞模型；
(5)取步驟(4)中跨膜電阻值大于500ω的心肌成纖維細(xì)胞模型，加入到含有pdgf的hbss培養(yǎng)液中培養(yǎng)48h，獲得心肌纖維化細(xì)胞模型；
其中：pdgf的濃度為50ng/ml。
(6)另取步驟(4)中跨膜電阻值大于500ω的心肌成纖維細(xì)胞模型加入到不含有pdgf的hbss培養(yǎng)液中培養(yǎng)48h，獲得心肌纖維化細(xì)胞模型的空白對照樣；
(7)測定所述步驟(6)所得的細(xì)胞rat-icell-c002心肌纖維化細(xì)胞模型的吸光度值即可完成模型評價(jià)。
其中細(xì)胞rat-icell-c002心肌纖維化細(xì)胞模型吸光度值的測定方法同實(shí)施例1。
空白對照組和增殖對照組a值分別為(0.2147±0.0195)和(0.3302±0.0150)，可見pdgf培養(yǎng)可顯著提高心肌纖維化細(xì)胞對的代謝率，吸光度值明顯升高，與空白對照組比較差異有極顯著性(p<0.01)，說明心肌纖維化模型已建立。
盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)。