本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速檢測(cè)cyp2c19基因多態(tài)性的方法和試劑盒。

背景技術(shù)：

細(xì)胞色素p450酶系(cyp或p450)是肝臟中主要的代謝酶系之一。cyp2c19是p450酶系第二家族中的重要成員，參與了p450酶系負(fù)責(zé)代謝藥物的約12％，是人體重要的藥物代謝酶。目前cyp2c19已發(fā)現(xiàn)很多單核苷酸多態(tài)性，引起了cyp2c19等位基因的發(fā)生，其中cyp2c19*2(g681a,rs4244285)、cyp2c19*3(g636a,rs4986893)和cyp2c19*17是亞洲人群中常見的等位基因型。cyp2c19*2型和cyp2c19*3型可引起cyp2c19基因編碼的酶活性喪失，代謝底物的能力減弱，使血藥濃度增加，從而引起與血藥濃度相關(guān)的藥物不良反應(yīng)，攜帶者稱為弱代謝者。cyp2c19*17型可引起cyp2c19基因編碼的酶活性增強(qiáng)，代謝底物的能力增強(qiáng)，攜帶者稱為快代謝。

氯吡格雷是一種血小板受體抑制劑類藥物，在急性冠狀動(dòng)脈綜合癥(acs)和經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(pci)的血小板治療中被廣泛應(yīng)用。因?yàn)閏yp2c19*2和cyp2c19*3基因多態(tài)性會(huì)使得cyp2c19酶代謝活性顯著降低，從而對(duì)氯吡格雷代謝轉(zhuǎn)化產(chǎn)生重要影響，造成血小板表面受體異常，導(dǎo)致不良心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)增加。2010年，美國食品藥品監(jiān)督管理局(fda)強(qiáng)調(diào)指出氯吡格雷代謝不良的患者藥物療效顯著降低，建議醫(yī)生應(yīng)該在用藥之前對(duì)患者的cyp2c19基因型進(jìn)行檢測(cè)，從而合理調(diào)整用藥劑量并確定具體個(gè)性化用藥方案。

目前用于檢測(cè)基因多態(tài)性的方法很多，主要有測(cè)序法、限制性內(nèi)切酶酶解片段長度多態(tài)性(rflp)分析法、arms(amplificationrefractorymutationsystem，擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng))法、taqmanpcr和基因芯片法等。這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，其中在臨床和科研中較為常見的方法為直接測(cè)序法以及arms法。

測(cè)序法的主要缺點(diǎn)在于：(1)pcr反應(yīng)前需要對(duì)樣本進(jìn)行提取dna，檢測(cè)質(zhì)量與濃度，操作復(fù)雜，存在混淆樣本的風(fēng)險(xiǎn)。(2)檢測(cè)多個(gè)位點(diǎn)時(shí)一個(gè)樣本需要進(jìn)行多個(gè)反應(yīng)，檢測(cè)成本高，對(duì)模板量的需求高，操作強(qiáng)度大，并容易造成操作錯(cuò)誤和污染。(3)pcr反應(yīng)后需要對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化和測(cè)序化學(xué)反應(yīng)等步驟?？傮w來說就是檢測(cè)靈敏度低，步驟繁瑣，試驗(yàn)周期長，成本高，不利于臨床大規(guī)模推廣。

arms-pcr法：arms-pcr(amplificationrefractorymutationsystem)又叫等位基因特異pcr，taqman聚合酶缺少3’→5’外切酶活性，在一定條件下pcr產(chǎn)物3’末端的錯(cuò)配導(dǎo)致產(chǎn)物的急劇減少，針對(duì)不同的已知突變，分別設(shè)計(jì)突變引物、野生引物，2個(gè)引物主要是3’末端堿基不同。該方法的主要限制因素是：a)若突變的位點(diǎn)為弱錯(cuò)配堿基序列，arms引物不能有效區(qū)分目標(biāo)核酸序列的野生型變異體和突變型變異體，從而使該方法的選擇性受到影響，也會(huì)因此產(chǎn)生假陰性或假陽性結(jié)果。b)arms-pcr只含有選擇性擴(kuò)增機(jī)制而不具備選擇性檢測(cè)，無法進(jìn)行基因型特異性檢測(cè)，因此當(dāng)選擇性擴(kuò)增出現(xiàn)錯(cuò)誤時(shí)會(huì)導(dǎo)致完全錯(cuò)誤的結(jié)論，即出現(xiàn)假陰性及假陽性結(jié)果。c)arms-pcr引物設(shè)計(jì)必須涵蓋多態(tài)性位點(diǎn)區(qū)域，當(dāng)這些區(qū)域有特殊序列或結(jié)構(gòu)時(shí)，擴(kuò)增(效率、特異性、選擇性)會(huì)被影響。

因此，需要開發(fā)出一種全新的、操作簡單、特異性強(qiáng)、靈敏度高、通量高、可靠性強(qiáng)、檢測(cè)速度快和成本低的cyp2c19基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢測(cè)cyp2c19基因多態(tài)性的方法和試劑盒，使得所述方法以及試劑盒產(chǎn)品能夠快速簡便的檢測(cè)cyp2c19基因多態(tài)性，并具備較高的特異性和靈敏度。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種快速檢測(cè)cyp2c19基因多態(tài)性的方法，包括：

步驟1、待測(cè)樣品無需提取dna直接采用樣品處理液處理，釋放dna；

步驟2、將處理后的待測(cè)樣品采用cyp2c19基因多態(tài)性的特異性選擇性擴(kuò)增引物以及特異性選擇性探針進(jìn)行熒光定量pcr擴(kuò)增和檢測(cè)；

步驟3、根據(jù)熒光定量pcr結(jié)果的信號(hào)及/或信號(hào)值進(jìn)行基因分型。

作為優(yōu)選，所述cyp2c19基因多態(tài)性的特異性選擇性擴(kuò)增引物為cyp2c19*2型特異性選擇性擴(kuò)增引物、cyp2c19*3型特異性選擇性擴(kuò)增引物和cyp2c19*17型特異性選擇性擴(kuò)增引物中的一種或兩種以上；

其中，所述cyp2c19*2型特異性選擇性擴(kuò)增引物包括野生型擴(kuò)增上游引物、突變型擴(kuò)增上游引物和公共下游引物，野生型擴(kuò)增上游引物序列如seqidno:1所示，突變型擴(kuò)增上游引物序列如seqidno:2所示，公共下游引物如seqidno:3所示；

其中，所述cyp2c19*3型特異性選擇性擴(kuò)增引物包括野生型擴(kuò)增上游引物、突變型擴(kuò)增上游引物和公共下游引物，野生型擴(kuò)增上游引物序列如seqidno:4所示，突變型擴(kuò)增上游引物序列如seqidno:5所示，公共下游引物如seqidno:6所示；

其中，所述cyp2c19*17型特異性選擇性擴(kuò)增引物包括野生型擴(kuò)增上游引物、突變型擴(kuò)增上游引物和公共下游引物，野生型擴(kuò)增上游引物序列如seqidno:7所示，突變型擴(kuò)增上游引物序列如seqidno:8所示，公共下游引物如seqidno:9所示。

在本發(fā)明所述特異性選擇性擴(kuò)增引物中的野生型擴(kuò)增上游引物、突變型擴(kuò)增上游引物中，均包含以共價(jià)相連或直接相連的引物區(qū)序列和變異體識(shí)別區(qū)序列，所述引物區(qū)序列在3’端，變異體識(shí)別區(qū)序列在5’端，所述變異體識(shí)別區(qū)序列(即野生型擴(kuò)增上游引物和突變型擴(kuò)增上游引物的5’端)優(yōu)選共價(jià)連接有核酸雙鏈穩(wěn)定因子和/或含有不能被核酸酶水解的修飾因子，所述引物區(qū)序列能夠從目標(biāo)核酸基因多態(tài)性位點(diǎn)前開始擴(kuò)增，突變型擴(kuò)增引物變異體識(shí)別區(qū)序列包含目標(biāo)核酸基因多態(tài)性位點(diǎn)處的正常堿基，野生型擴(kuò)增引物變異體識(shí)別區(qū)序列包含目標(biāo)核酸基因多態(tài)性位點(diǎn)處的突變堿基，兩種變異體識(shí)別區(qū)序列均與所述引物區(qū)序列擴(kuò)增延伸產(chǎn)生的序列形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，從而影響不同擴(kuò)增效率，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的特異性。

作為優(yōu)選，所述核酸雙鏈穩(wěn)定因子包括鎖核酸、肽核酸或dna小溝結(jié)合物/類似物中的一種或一種以上的組合，所述修飾因子選自堿基類似物、核酸骨架、脫氧核糖類似物、肽核酸或硫代磷酸酯。

作為優(yōu)選，所述cyp2c19基因多態(tài)性的特異性選擇性探針為cyp2c19*2型特異性選擇性探針、cyp2c19*3型特異性選擇性探針和cyp2c19*17型特異性選擇性探針中的一種或兩種以上；

其中，所述cyp2c19*2型特異性選擇性探針包括野生型檢測(cè)探針和突變型檢測(cè)探針，野生型檢測(cè)探針序列如seqidno:10所示、突變型檢測(cè)探針序列如seqidno:11所示；

所述cyp2c19*3型特異性選擇性探針包括野生型檢測(cè)探針和突變型檢測(cè)探針，野生型檢測(cè)探針序列如seqidno:12所示、突變型檢測(cè)探針序列如seqidno:13所示；

所述cyp2c19*17型特異性選擇性探針包括野生型檢測(cè)探針和突變型檢測(cè)探針，野生型檢測(cè)探針序列如seqidno:14所示、突變型檢測(cè)探針序列如seqidno:15所示；

所述各基因型特異性選擇性探針的5’端和3’端分別具有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，所述熒光基團(tuán)為fam或hex或tamra，所述淬滅基團(tuán)為nfq(non-fluorescentquencher)-mgb，nfq本身不產(chǎn)生熒光，因此可以大大降低本底信號(hào)的強(qiáng)度，同時(shí)所述特異性探針上還連接有mgb修飾基團(tuán)，可以將該探針的tm值提高10℃左右，因此同樣的tm值，mgb探針可以比普通taqman探針設(shè)計(jì)的更短，使得探針在識(shí)別具有單個(gè)核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)時(shí)，特異性更強(qiáng)。

當(dāng)上述cyp2c19基因多態(tài)性的特異性選擇性擴(kuò)增引物以及特異性選擇性探針組合使用時(shí)能夠達(dá)到較高的檢測(cè)特異性、準(zhǔn)確性以及靈敏性，效果優(yōu)于其他特異性引物和探針。

作為優(yōu)選，本發(fā)明所述樣品處理液可直接處理待測(cè)樣品，不許提取dna即可完成dna的釋放，直接用于后續(xù)擴(kuò)增和檢測(cè)，方便快捷；所述樣品處理液包含處理緩沖液、金屬離子絡(luò)合劑和dna釋放促進(jìn)劑。其中，所述處理緩沖液為tris-hcl緩沖液，濃度為10～100mm，ph7.0～10.0；更具體地，所述tris-hcl的濃度為20mm，ph8.0；所述金屬離子絡(luò)合劑為edta，濃度為1～20mm，ph7.5～8.5；更具體地，所述edta濃度為2mm，ph8.0；所述dna釋放促進(jìn)劑為蛋白酶k，濃度為0.01～20mg/ml；更具體地，所述蛋白酶k濃度為2mg/ml。

此外，本發(fā)明基于上述檢測(cè)的方法，還對(duì)應(yīng)提供了一種快速檢測(cè)cyp2c19基因多態(tài)性的試劑盒，包括本發(fā)明所述方法中的cyp2c19基因多態(tài)性的特異性選擇性擴(kuò)增引物，以及所述方法中的cyp2c19基因多態(tài)性的特異性選擇性探針。

作為優(yōu)選，所述試劑盒還包括熒光定量pcr擴(kuò)增及檢測(cè)的反應(yīng)試劑(如pcr緩沖液、mgcl2、去垢劑、dna聚合酶和dntp)、本發(fā)明所述方法中的樣品處理液，以及基因型對(duì)照dna。

其中，所述基因型對(duì)照dna包括cyp2c19*2野生型dna和突變型dna、cyp2c19*3野生型dna和突變型dna、cyp2c19*17野生型dna和突變型dna中的一對(duì)或兩對(duì)以上；同時(shí)，本發(fā)明所述試劑盒還包括內(nèi)參，其中內(nèi)參序列的核苷酸序列如seqidno:16所示；內(nèi)參正向引物的核苷酸序列如seqidno:17所示；內(nèi)參反向引物的核苷酸序列如seqidno:18所示；內(nèi)參探針的核苷酸序列如seqidno:19所示；

采用本發(fā)明所述方法和試劑盒，可根據(jù)需要同時(shí)檢測(cè)cyp2c19*2型、cyp2c19*3型和cyp2c19*17型中的一種或兩種以上。

本發(fā)明步驟3中，根據(jù)熒光定量pcr結(jié)果的信號(hào)及/或信號(hào)值進(jìn)行基因分型可參考表1(只有在內(nèi)參基因有擴(kuò)增時(shí)檢測(cè)結(jié)果可信，表中數(shù)值僅為參考，具體數(shù)值會(huì)因反應(yīng)體系、樣品來源、機(jī)器種類等差異而有差異)：

表1檢測(cè)結(jié)果判定

根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例所記載的實(shí)驗(yàn)效果，本發(fā)明具備下述積極效果：

1、檢測(cè)速度快：本發(fā)明提供的方法將樣品與樣品處理液混合處理后，無需對(duì)樣品進(jìn)行dna提取，省去了繁瑣又費(fèi)時(shí)的dna提取步驟，在不長于7min即可完成樣品的快速處理，并直接對(duì)所述樣品和樣品處理液的混合液進(jìn)行選擇性擴(kuò)增及基因型特異性選擇性檢測(cè)，從樣本處理到獲取最終檢測(cè)數(shù)據(jù)整個(gè)過程在1h內(nèi)完成(當(dāng)采用abi7500fast定量pcr儀器時(shí))。

2、能準(zhǔn)確檢測(cè)基因多態(tài)性：采用特異性選擇性擴(kuò)增引物選擇性擴(kuò)增目的核酸序列變異體，而非目的核酸序列變異體無法擴(kuò)增，在擴(kuò)增的同時(shí)通過特異性選擇性探針檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)，從而確保了基因分型的準(zhǔn)確性，優(yōu)于arms方法。

3、結(jié)合本發(fā)明所提供cyp2c19基因多態(tài)性的特異性選擇性擴(kuò)增引物以及特異性選擇性探針，兩者組合使用時(shí)能夠達(dá)到較高的檢測(cè)特異性、準(zhǔn)確性以及靈敏性，效果優(yōu)于其他的特異性引物和探針。

由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明提供了一種快速檢測(cè)cyp2c19基因多態(tài)性的方法和試劑盒，將待測(cè)樣本與樣品處理液混合處理后，無需進(jìn)行dna提取步驟，在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本的簡易處理，并進(jìn)一步通過選擇性擴(kuò)增引物與選擇性檢測(cè)探針實(shí)現(xiàn)對(duì)cyp2c19基因野生型變異體與突變型變異體的有效區(qū)分，從樣本處理到獲取最終檢測(cè)結(jié)果整個(gè)過程在1h內(nèi)完成，并且保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性、特異性和靈敏度。

附圖說明

圖1所示為血液樣本經(jīng)快速處理后內(nèi)參模板的擴(kuò)增結(jié)果；

圖2所示為一組血液樣本cyp2c19*2野生純合型樣本的檢測(cè)結(jié)果；

圖3所示為一組血液樣本cyp2c19*2突變型樣本的檢測(cè)結(jié)果；

圖4所示為一組血液樣本cyp2c19*3野生純合型樣本的檢測(cè)結(jié)果；

圖5所示為一組血液樣本cyp2c19*3純合型樣本的檢測(cè)結(jié)果；

圖6所示為兩組血液樣本cyp2c19*17野生純合型樣本的檢測(cè)結(jié)果；

圖7所示為兩組血液樣本經(jīng)快速處理后的模板的擴(kuò)增結(jié)果；

圖8所示為使用本發(fā)明所述方法對(duì)cyp2c19*3野生型質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果；

圖9所示為使用本發(fā)明所述方法對(duì)cyp2c19*3突變型質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果；

圖10所示為使用arms方法對(duì)cyp2c19*3野生型質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果；

圖11所示為使用arms方法對(duì)cyp2c19*3野生型質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果；

圖12所示為使用其它特異性引物、特異性探針組合對(duì)cyp2c19*3突變型質(zhì)粒的檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明公開了一種快速檢測(cè)cyp2c19基因多態(tài)性的方法和試劑盒，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明所述試劑盒和方法已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

以下就本發(fā)明所提供的一種快速檢測(cè)cyp2c19基因多態(tài)性的方法和試劑盒做進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1：血液樣本的處理

在這個(gè)實(shí)施例中，對(duì)5組血液進(jìn)行40倍稀釋后進(jìn)行快速處理。其中處理液為20mmtris-hclph8.0，2mmedta，2mg/ml蛋白酶k，將2ul血液與78ul該處理液混合，并充分混勻后經(jīng)56℃保溫5min，98℃保溫2min，粗制樣本即處理完成。

實(shí)施例2：唾液試子樣本的處理

在這個(gè)實(shí)施例中，使用專用唾液試子刮取口腔內(nèi)粘膜細(xì)胞，用剪刀剪取部分試子或者將整個(gè)試子進(jìn)行浸泡，其中處理液為20mmtris-hclph8.0，2mmedta，2mg/ml蛋白酶k，所需體積浸泡以處理液全部覆蓋試子為宜，并劇烈震蕩1min后，粗制樣本即處理完成。

實(shí)施例3：血液樣本的快速檢測(cè)

在這個(gè)實(shí)施例中，通過使用本發(fā)明所述的實(shí)施例1中的方法對(duì)血液進(jìn)行快速處理并檢測(cè)內(nèi)參基因的擴(kuò)增。

內(nèi)參序列為：

5’-cggactgaaggagctgcccatgagaaatttacagggtgagaggctgggatgccaaggctgggggttcataaatgcagacagcagttccgatggc-3’

正向引物：5’-cggactgaaggagctgcc-3’

反向引物：5’-gccatcggaactgctgtctg-3’

檢測(cè)探針：5’-cy5-ccccagccttggcatccca-bhq2-3’

pcr反應(yīng)體系為25μl，每個(gè)反應(yīng)體系中含有2％甘油，datp、dctp、dgtp、dttp各200μm，正向引物、反向引物各200nm，檢測(cè)探針200nm和1個(gè)單位的熱啟動(dòng)taqdna聚合酶。其中1個(gè)單位是指在72℃30分鐘摻入10nmoldntps所需要的酶量。

使用abi7500fast熒光定量pcr儀進(jìn)行pcr反應(yīng)和后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。pcr熱循環(huán)條件為95℃，2min；40循環(huán)(95℃，3s；60℃，25s，單循環(huán))。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果通過在618nm-660nm的熒光變化來體現(xiàn)的。圖1中可見血液經(jīng)快速處理后有充足的模板量用于檢測(cè)且檢測(cè)方法可行。

實(shí)施例4：使用本發(fā)明所提供的試劑盒實(shí)現(xiàn)對(duì)cytochromep4502c19細(xì)胞色素p450同工酶2c19對(duì)應(yīng)位點(diǎn)cyp2c19*2,3及17的三重選擇性擴(kuò)增與檢測(cè)

在這個(gè)實(shí)施例中，分別選擇兩組血液樣本，經(jīng)實(shí)施例1所描述的方法進(jìn)行快速處理，然后使用本發(fā)明所提供的試劑盒，對(duì)cytochromep4502c19細(xì)胞色素p450同工酶2c19對(duì)應(yīng)位點(diǎn)cyp2c19*2,3及17的三重選擇性擴(kuò)增與檢測(cè)。突變型與野生型分兩個(gè)獨(dú)立管進(jìn)行檢測(cè)。

cyp2c19*2野生型序列為：

5’-gttttctcttagatatgcaataattttcccactatcattgattatttcccg(多態(tài)性位點(diǎn))ggaacccataacaaattacttaaaaaccttgcttttatggaaagtgatattttggagaaagtaaaagaacaccaagaatcgatggacatcaacaaccctcgggactttattgattgcttcctgatcaaaatggagaaggtaaaatgttaa-3’

cyp2c19*2突變型序列為：

5’-gttttctcttagatatgcaataattttcccactatcattgattatttccca(多態(tài)性位點(diǎn))ggaacccataacaaattacttaaaaaccttgcttttatggaaagtgatattttggagaaagtaaaagaacaccaagaatcgatggacatcaacaaccctcgggactttattgattgcttcctgatcaaaatggagaaggtaaaatgttaa-3’

cyp2c19*2野生型正向選擇性引物序列為：

5’-(mgb)-cctgggaaa(變異體識(shí)別區(qū)，下劃線堿基為多態(tài)性位點(diǎn))tgcaataattttcccactatcattgatt(引物區(qū))-3’

cyp2c19*2突變型正向選擇性引物序列為：

5’-(mgb)-cccgggaaa(變異體識(shí)別區(qū)，下劃線堿基為多態(tài)性位點(diǎn))tgcaataattttcccactatcattgatt(引物區(qū))-3’

cyp2c19*2公共下游引物為：

5’-agcaaggtttttaagtaatttgttatggg-3’

cyp2c19*2野生型檢測(cè)探針序列為：

5’-(hex)-ttcccgggaaataa-(mgb)-3’

cyp2c19*2突變型檢測(cè)探針序列為：

5’-(hex)-ttcctgggaaataa-(mgb)-3’

cyp2c19*3野生型序列為：

5’-accctgtgatcccactttcatcctgggctgtgctccctgcaatgtgatctgctccattattttccagaaacgtttcgattataaagatcagcaatttcttaacttgatggaaaaattgaatgaaaacatcaggattgtaagcaccccctgg(多態(tài)性位點(diǎn))atccaggtaaggccaagttttttgcttcctgagaaaccacttacagtctttttttctgggaaatccaaaattctatattgaccaagccctgaag-3’

cyp2c19*3突變型序列為：

5’-accctgtgatcccactttcatcctgggctgtgctccctgcaatgtgatctgctccattattttccagaaacgtttcgattataaagatcagcaatttcttaacttgatggaaaaattgaatgaaaacatcaggattgtaagcaccccctga(多態(tài)性位點(diǎn))atccaggtaaggccaagttttttgcttcctgagaaaccacttacagtctttttttctgggaaatccaaaattctatattgaccaagccctgaag-3’

cyp2c19*3野生型正向選擇性引物序列為：

5’-(mgb)-tgaatccag(變異體識(shí)別區(qū)，下劃線堿基為多態(tài)性位點(diǎn))aggaagcaaaaaacttggcctt(引物區(qū))-3’

cyp2c19*3突變型正向選擇性引物序列為：

5’-(mgb)-tggatccag(變異體識(shí)別區(qū)，下劃線堿基為多態(tài)性位點(diǎn))aggaagcaaaaaacttggcctt(引物區(qū))-3’

cyp2c19*3公共下游引物為：

5’-gaaaacatcaggattgtaagcaccc-3’

cyp2c19*3野生型檢測(cè)探針序列為：

5’-(fam)-cctggatccaggtaa-(mgb)-3’

cyp2c19*3突變型檢測(cè)探針序列為：

5’-(fam)-ctgaatccaggtaag-(mgb)-3’

cyp2c19*17野生型序列為：

5’-tggttctatttaatgtgaagcctgttttatgaacaggatgaatgtggtatatattcagaataactaatgtttggaagttgttttgttttgctaaaacaaagttttagcaaacgattttttttttcaaatttgtgtcttctgttctcaaagc(多態(tài)性位點(diǎn))atctctgatgtaagagataatgcgccacgatgggcatcagaagacctcagctcaaatcccagttctgccagctatgagctgtgtggcaccaaca-3’

cyp2c19*17突變型序列為：

5’-tggttctatttaatgtgaagcctgttttatgaacaggatgaatgtggtatatattcagaataactaatgtttggaagttgttttgttttgctaaaacaaagttttagcaaacgattttttttttcaaatttgtgtcttctgttctcaaagt(多態(tài)性位點(diǎn))atctctgatgtaagagataatgcgccacgatgggcatcagaagacctcagctcaaatcccagttctgccagctatgagctgtgtggcaccaaca-3’

cyp2c19*17野生型正向選擇性引物序列為：

5’-(mgb)-agtatctct(變異體識(shí)別區(qū)，下劃線堿基為多態(tài)性位點(diǎn))atcgtggcgcattatctcttacat(引物區(qū))-3’

cyp2c19*17突變型正向選擇性引物序列為：

5’-(mgb)-agcatctct(變異體識(shí)別區(qū)，下劃線堿基為多態(tài)性位點(diǎn))atcgtggcgcattatctcttacat(引物區(qū))-3’

cyp2c19*17公共下游引物為：

5’-tttttttcaaatttgtgtcttctgttctc-3’

cyp2c19*17野生型檢測(cè)探針序列為：

5’-(tamra)-aagcatctctgatgtaa-(mgb)-3’

cyp2c19*17突變型檢測(cè)探針序列為：

5’-(tamra)-aagtatctctgatgtaagag-(mgb)-3’

pcr反應(yīng)體系為25μl，每個(gè)反應(yīng)體系中含有2％甘油，datp、dctp、dgtp、dttp各200μm，cyp2c19*2,3,17及內(nèi)參的四種正向引物、反向引物各200nm，四種檢測(cè)探針各200nm和2個(gè)單位的熱啟動(dòng)taqdna聚合酶。其中2個(gè)單位是指在72℃30分鐘摻入10nmoldntps所需要的酶量。

使用abi7500fast熒光定量pcr儀進(jìn)行pcr反應(yīng)和后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。pcr熱循環(huán)條件為95℃，2min；40循環(huán)(95℃，3s；60℃，25s，單循環(huán))；

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2至圖7，cyp2c19*2實(shí)驗(yàn)的結(jié)果通過hex的熒光變化來體現(xiàn)的，cyp2c19*3實(shí)驗(yàn)的結(jié)果通過fam的熒光變化來體現(xiàn)的，cyp2c19*17實(shí)驗(yàn)的結(jié)果通過tamra的熒光變化來體現(xiàn)的，內(nèi)參實(shí)驗(yàn)的結(jié)果通過在cy5的熒光變化來體現(xiàn)的。

圖2中可見該組血液樣本cyp2c19*2為野生純合型樣本，僅野生型檢測(cè)孔存在擴(kuò)增，突變型檢測(cè)孔無擴(kuò)增。

圖3中可見該組血液樣本cyp2c19*2為突變型樣本，僅突變型檢測(cè)孔存在擴(kuò)增，野生型檢測(cè)孔無擴(kuò)增。

圖4中可見該組血液樣本cyp2c19*3為野生純合型樣本，僅野生型檢測(cè)孔存在擴(kuò)增，突變型檢測(cè)孔無擴(kuò)增。

圖5中可見該組血液樣本cyp2c19*3為雜合型樣本，野生型檢測(cè)孔與突變型檢測(cè)孔均存在擴(kuò)增。

圖6中可見兩組血液樣本cyp2c19*17均為野生純合型樣本，僅野生型檢測(cè)孔存在擴(kuò)增，突變型檢測(cè)孔無擴(kuò)增。

圖7中可見該兩組血液樣本經(jīng)快速處理后均含有足量模板，可滿足后續(xù)的相關(guān)基因檢測(cè)。

實(shí)施例5：使用本發(fā)明所述的方法與arms方法對(duì)cytochromep4502c19細(xì)胞色素p450同工酶2c19對(duì)應(yīng)位點(diǎn)cyp2c19*3的檢測(cè)對(duì)比

在這個(gè)實(shí)施例中，分別選擇含有cyp2c19*3突變及野生序列的質(zhì)粒1000copy，檢測(cè)本專利發(fā)明所述的方法與arms方法，用于對(duì)cytochromep4502c19細(xì)胞色素p450同工酶2c19對(duì)應(yīng)位點(diǎn)cyp2c19*3的檢測(cè)。突變型與野生型分兩個(gè)獨(dú)立管進(jìn)行檢測(cè)。

野生型序列為：同實(shí)施例4

突變型序列為：同實(shí)施例4

野生型正向arms引物序列為：

5’-aaaaacttggccttacctggatc-3’

突變型正向arms引物序列為：

5’-aaaaaacttggccttacctggatt-3’

公共arms下游引物為：

5’-tccctgcaatgtgatctgctc-3’

公共arms檢測(cè)探針序列為：

5’-(fam)-caatcctgatgttttc-(mgb)-3’

本專利所述方法需要的引物探針同實(shí)施例4

pcr反應(yīng)體系為25μl，每個(gè)反應(yīng)體系中含有2％甘油，datp、dctp、dgtp、dttp各200μm，正向引物、反向引物各200nm，檢測(cè)探針200nm和1個(gè)單位的熱啟動(dòng)taqdna聚合酶。其中1個(gè)單位是指在72℃30分鐘摻入10nmoldntps所需要的酶量。

使用羅氏lightcycler480熒光定量pcr儀進(jìn)行pcr反應(yīng)和后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。pcr熱循環(huán)條件為95℃，2min；40循環(huán)(95℃，3s；60℃，25s，單循環(huán))。

本發(fā)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖8和9，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果通過在fam的熒光變化來體現(xiàn)的。

arms實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖10和11，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果通過在fam的熒光變化來體現(xiàn)的。

圖8中可見該引物探針組合可有效擴(kuò)增野生型質(zhì)粒，而突變型質(zhì)?；緹o擴(kuò)增，圖9可見該引物探針組合可有效擴(kuò)增突變型質(zhì)粒，而野生型質(zhì)?；緹o擴(kuò)增，該發(fā)明所采用的引物探針組合會(huì)顯著區(qū)分兩種類型的質(zhì)粒。

圖10，圖11中可見arms引物探針組合會(huì)同時(shí)擴(kuò)增野生型質(zhì)粒及突變型質(zhì)粒，選擇性擴(kuò)增效果遠(yuǎn)差于本發(fā)明所描述的方法。同時(shí)本發(fā)明所描述的方法在檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)兩種基因型的差異極大，而arms-pcr法不同的基因型幾乎在檢測(cè)信號(hào)上沒有差異。

實(shí)施例6：使用本發(fā)明所述的方法所設(shè)計(jì)的兩組引物探針組合對(duì)cytochromep4502c19細(xì)胞色素p450同工酶2c19對(duì)應(yīng)位點(diǎn)cyp2c19*3進(jìn)行檢測(cè)對(duì)比

在這個(gè)實(shí)施例中，分別選擇含有cyp2c19*3突變及野生序列的質(zhì)粒1000copy，檢測(cè)本專利所發(fā)明的方法所設(shè)計(jì)的兩組引物探針組合并對(duì)比檢測(cè)，用于對(duì)cytochromep4502c19細(xì)胞色素p450同工酶2c19對(duì)應(yīng)位點(diǎn)cyp2c19*3的檢測(cè)，僅使用突變型引物探針組合檢測(cè)突變型與野生型，并分兩個(gè)獨(dú)立管進(jìn)行檢測(cè)。

野生型序列為：同實(shí)施例4

突變型序列為：同實(shí)施例4

本專利所述方法需要的引物探針同實(shí)施例4

以下引物和探針為用于對(duì)比的特異性引物和探針：

cyp2c19*3突變型參比正向選擇性引物序列為：

5’-(mgb)-ctggatcca(變異體識(shí)別區(qū)，下劃線堿基為多態(tài)性位點(diǎn))aggaagcaaaaaacttggcctt(引物區(qū))-3’

cyp2c19*3參比公共下游引物為：

5’-atcaggattgtaagcaccccctg-3’

cyp2c19*3突變型參比檢測(cè)探針序列為：

5’-(fam)-cccctgaatccaggt-(mgb)-3’

pcr反應(yīng)體系為25μl，每個(gè)反應(yīng)體系中含有2％甘油，datp、dctp、dgtp、dttp各200μm，正向引物、反向引物各200nm，檢測(cè)探針200nm和1個(gè)單位的熱啟動(dòng)taqdna聚合酶。其中1個(gè)單位是指在72℃30分鐘摻入10nmoldntps所需要的酶量。

使用羅氏480lightcycler480熒光定量pcr儀進(jìn)行pcr反應(yīng)和后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。pcr熱循環(huán)條件為95℃，2min；40循環(huán)(95℃，3s；60℃，25s，單循環(huán))。

本發(fā)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖9，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果通過fam的熒光變化來體現(xiàn)的。

參比實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖12，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果通過fam的熒光變化來體現(xiàn)的。

圖9可見本發(fā)明提供的引物探針組合可有效擴(kuò)增突變型質(zhì)粒，而野生型質(zhì)粒基本無擴(kuò)增，因此本發(fā)明所采用的引物探針組合會(huì)顯著區(qū)分兩種類型的質(zhì)粒。

圖12中可見參比引物探針組合會(huì)同時(shí)擴(kuò)增野生型質(zhì)粒及突變型質(zhì)粒，區(qū)分效果顯著差于本發(fā)明所采用的引物探針組合，但區(qū)分能力仍優(yōu)于arms法所示的圖11。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

sequencelisting

<110>蘇州新海生物科技股份有限公司

<120>一種快速檢測(cè)cyp2c19基因多態(tài)性的方法和試劑盒

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cctggatccaggtaa15

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ctgaatccaggtaag15

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