本發(fā)明屬于抗癌藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及2,4,6-三取代吡啶并[3,4-d]嘧啶類(lèi)化合物及其鹽類(lèi)化合物、制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

癌癥是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的惡性疾病之一。近30年來(lái)，我國(guó)癌癥發(fā)生率正處于快速上升期，癌癥發(fā)病率約為200/10萬(wàn)人，每年新發(fā)病例達(dá)320萬(wàn)例以上，死亡約270多萬(wàn)，在治患者700萬(wàn)人以上。

目前癌癥的主要治療手段仍然是手術(shù)治療、放射治療及藥物治療，但在很大程度上仍是以藥物治療為主。因此，研究開(kāi)發(fā)新的抗癌藥物具有重要意義。

傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物活性強(qiáng)，但缺乏選擇性，毒性大。近年來(lái)，隨著腫瘤分子生物學(xué)研究的進(jìn)展，對(duì)腫瘤發(fā)病機(jī)理有了更多的認(rèn)識(shí)，找到了許多抗癌藥物作用的新靶點(diǎn)，如表皮生長(zhǎng)因子(egfr)酪氨酸激酶、pi3ks，btk等。

在多數(shù)腫瘤細(xì)胞中，一些激酶呈現(xiàn)高表達(dá)或過(guò)度激活。針對(duì)這一特點(diǎn)，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了吉非替尼、伊馬替尼、埃羅替尼、?？颂婺帷⑺骼悄?、舒尼替尼和拉帕替尼等激酶抑制劑，用作抗癌藥物。但是，吉非替尼等藥物應(yīng)用于臨床后發(fā)現(xiàn)其有效率并不高，有些患者使用后產(chǎn)生獲得性耐藥。因此，研發(fā)新的高效低毒的抗癌藥物具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供2,4,6-三取代吡啶并[3,4-d]嘧啶類(lèi)化合物及其鹽和應(yīng)用。該類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)新穎，具有顯著的抑制egfr酪氨酸激酶的活性，具有明顯的體內(nèi)、外抗腫瘤活性，可應(yīng)用于抗癌藥物制劑的制備，而且其合成原料易得、合成方法容易實(shí)現(xiàn)。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：

一種2,4,6-三取代吡啶并[3,4-d]嘧啶類(lèi)化合物，該化合物的結(jié)構(gòu)式為：

式中，r¹為取代氨基；

r²為芳基、取代的芳基、芳雜環(huán)基、取代的芳雜環(huán)基、環(huán)烷基、飽和雜環(huán)基或取代的甲基，其中，取代的甲基中的取代基為芳基、取代的芳基、芳雜環(huán)基、取代的芳雜環(huán)基、環(huán)烷基或飽和雜環(huán)基；

r³為取代氨基；

x為nh或o。

優(yōu)選地，所述r¹為二甲基氨基、二乙基氨基、1-吡咯烷基、1-哌啶基、4-嗎啉基、丙烯酰氨基取代的-1-吡咯烷基、丙烯酰氨基取代的-1-哌啶基、1-丙烯?；〈倪量┩榛被蛘弑；〈倪哙せ被?。

優(yōu)選地，所述r²中，芳基為苯基；取代的芳基為氟和/或氯取代的苯基、三氟甲基取代的苯基或者甲氧基取代的苯基；雜芳基為吡唑基、咪唑基或吡啶基；取代的雜芳基為1-烷基取代的吡唑基或取代的吡啶；環(huán)烷基為環(huán)己基或環(huán)戊基；飽和雜環(huán)基為四氫吡喃基、嗎啉基或四氫呋喃基。

優(yōu)選地，所述r²為苯基、3-氟苯基、4-氟苯基、3-氯-4-氟苯基、3,4-二氟苯基、3-三氟甲基苯基、2-吡啶基、3-吡啶基、芐基、吡啶-2-基甲基、吡啶-3-基甲基、吡啶-4-基甲基、4-四氫吡喃基、四氫吡喃-4-基甲基、環(huán)己基甲基、4-甲氧基芐基、4-氟基芐基或n-甲基-吡唑-4基。

優(yōu)選地，所述r³為4-甲基-1-哌嗪基、4-乙基-1-哌嗪基、n-甲基-n-(2-二甲氨基乙基)氨基、4-二甲氨基-1-哌啶基或丙烯酰氨基。

優(yōu)選地，所述化合物為如下化合物中的一種：

2,4,6-三取代吡啶并[3,4-d]嘧啶類(lèi)化合物的合成方法，包括以下步驟：

步驟一：在叔胺存在下，2,4,6-三氯吡啶并[3,4-d]嘧啶與r¹-h在溶劑中攪拌得到4-取代-2,6-二氯吡啶并[3,4-d]嘧啶，即中間體a；

步驟二：在酸催化下，中間體a與芳胺或取代的芳胺反應(yīng)；或者，在堿存在下，中間體a與r²-oh、環(huán)烷基取代的胺、飽和雜環(huán)基取代的胺或取代的甲基取代的胺反應(yīng)；或者，中間體a與雜芳基胺或取代的雜芳基胺通過(guò)buchwald反應(yīng)；反應(yīng)完成后分離獲得中間體b或c；

步驟三：在鈀催化劑、有機(jī)膦配體和堿存在下，中間體b或c與2-氨基吡啶類(lèi)化合物反應(yīng)，可生成2,4,6-三取代吡啶并[3,4-d]嘧啶類(lèi)化合物p。

合成路線如下：

優(yōu)選地，所述的叔胺為三乙胺、二異丙基乙胺、dbu或吡啶；所述的鈀催化劑為醋酸鈀或三(二亞芐基丙酮)二鈀；所述的有機(jī)膦配體為2-二環(huán)己基磷-2,4,6-三異丙基聯(lián)苯、4,5-雙二苯基膦-9,9-二甲基氧雜蒽或1,1'-聯(lián)萘-2,2'-雙二苯膦；所述的堿為碳酸鉀、碳酸銫或氫化鈉。

所述的2,4,6-三取代吡啶并[3,4-d]嘧啶類(lèi)化合物的可藥用鹽，所述可藥用鹽為包括鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽、醋酸鹽、富馬酸鹽、蘋(píng)果酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、馬來(lái)酸鹽、乳酸鹽、枸櫞酸鹽、樟腦磺酸鹽、苯甲酸鹽、葡糖酸鹽、谷氨酸鹽、羥乙磺酸鹽、琥珀酸鹽或甲磺酸鹽。

2,4,6-三取代吡啶并[3,4-d]嘧啶類(lèi)化合物或其可藥用鹽在制備抗癌藥物制劑中的應(yīng)用。

優(yōu)選地，所述抗癌藥物制劑是能夠抑制雙突變或三突變的egfr的藥物制劑。更進(jìn)一步地，三突變的egfr是l858r/t790m/c797s的egfr；雙突變的egfr是l858r/t790m的egfr。

優(yōu)選地，所述抗癌藥物制劑為片劑、膠囊劑或注射劑，其中每片、每?；蛎恐е苿┲泻?0～500mg的2,4,6-三取代吡啶并[3,4-d]嘧啶類(lèi)化合物或其可藥用鹽。

優(yōu)選地，所述抗癌藥物制劑還包括輔料，輔料包括穩(wěn)定劑、增溶劑、潤(rùn)滑劑和崩解劑中的一種或幾種。進(jìn)一步優(yōu)選地，輔料包括淀粉、糊精、葡萄糖、乳糖、纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、果膠、環(huán)糊精、土溫-80、聚乙烯醇、硬脂酸鎂和滑石粉中的一種或多種。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：

本發(fā)明將吡啶并[3,4-d]嘧啶作為藥物骨架，提供的2,4,6-三取代吡啶并[3,4-d]嘧啶類(lèi)化合物或其鹽類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)新穎、易于合成。

本發(fā)明提供的2,4,6-三取代吡啶并[3,4-d]嘧啶類(lèi)化合物或其鹽類(lèi)化合物具有抑制表皮生長(zhǎng)因子受體(egfr)酪氨酸激酶的活性，對(duì)于單突變(l858r)、雙突變(l858r/t790m)和三突變(l858r/t790m/c797s)的egfr均有明顯的抑制活性，可用于與egfr突變相關(guān)的癌癥的治療。

本發(fā)明提供的化合物具有抑制人肺癌細(xì)胞a549、hcc827、h1975等腫瘤細(xì)胞增殖的活性，比如化合物44對(duì)a549、hcc827和h1975的ic50分別為0.95μmol·l^-1、0.008μmol·l^-1和0.49μmol·l^-1。而在同樣條件下，陽(yáng)性藥奧希替尼(azd9291)對(duì)a549、hcc827和h1975的ic50值分別為11.5、0.025和0.35μmol·l^-1。

本發(fā)明提供的化合物具有顯著的體內(nèi)抗腫瘤活性。

本發(fā)明提供的2,4,6-三取代吡啶并[3,4-d]嘧啶類(lèi)化合物及其鹽類(lèi)化合物，能夠應(yīng)用于制備抗癌藥物制劑，其中每片或?；蛑г撍幬镏苿┲泻?0～500mg。在利用本發(fā)明給出的活性化合物制備抗癌藥物制劑時(shí)，可以將該藥物制成片劑、膠囊劑或注射劑。這些藥物制劑可按照各種制劑的常規(guī)制備工藝制成。對(duì)于片劑或膠囊劑，優(yōu)選的含量為50～300mg。并且本發(fā)明涉及的口服制劑中可含有藥用輔料，包括添加劑、穩(wěn)定劑、增溶劑、潤(rùn)滑劑、崩解劑等，如淀粉、糊精、葡萄糖、乳糖、纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、果膠、環(huán)糊精、土溫-80、聚乙烯醇、硬脂酸鎂、滑石粉等。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。

本申請(qǐng)文件中，展示了本發(fā)明所合成的化合物中的部分代表性化合物及其制備方法。具體代表化合物的編號(hào)、結(jié)構(gòu)和表征列舉在表1中，其制備方法在具體實(shí)施例中進(jìn)行展示。

表1：代表化合物的編號(hào)、結(jié)構(gòu)和表征

實(shí)施例1：2-苯氨基-4-吡咯烷基-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物1)

步驟一：2,6-二氯-4-吡咯烷基吡啶并[3,4-d]嘧啶(中間體a1)的合成

向250ml茄型瓶中加入2,4,6-三氯吡啶并[3,4-d]嘧啶(2.50g，10.66mmol)，將其用四氫呋喃溶解后，加入dipea(2.8ml，15.99mmol)，磁力攪拌下滴加四氫吡咯(1.0ml，11.73mmol)，滴加過(guò)程中不斷有黃色固體析出，滴畢，室溫?cái)嚢?h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸除溶劑，殘余物用水懸浮，有大量黃色固體析出，抽濾，濾餅水洗，干燥得中間體a1，淡黃色固體粉末，2.61g，收率91.0％。¹hnmr(400mz,cdcl3)δ8.98(s,1h,ar-h),7.94(s,1h,ar-h),3.98(s,4h,nch2),2.13(s,4h,ch2)。

步驟二：2-苯氨基-4-吡咯烷基吡啶并[3,4-d]嘧啶(中間體b1)的合成

向100ml茄型瓶中加入2,6-二氯-4-吡咯烷基吡啶并[3,4-d]嘧啶(中間體a1)(1.00g，3.72mmol)，對(duì)甲苯磺酸(0.77g，4.48mmol)和仲丁醇(30ml)，磁力攪拌下加入苯胺(0.370ml，4.08mmol)，氬氣保護(hù)下回流4h，回流過(guò)程中不斷有黃色固體析出，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸除溶劑，殘余物用碳酸氫鈉水溶液懸浮，有大量固體析出，超聲均勻后抽濾，水洗濾餅，干燥得中間體b1，淡黃色固體粉末，1.20g，收率99.2％。¹hnmr(400mz,cdcl3)δ8.75(s,1h,ar-h),7.80(s,1h,ar-h),7.70(d,j＝7.7hz,2h,ar-h),7.34(t,j＝8.0hz,2h,ar-h),7.16(s,1h,nh),7.04(t,j＝7.4hz,1h,ar-h),3.91(s,4h,nch2),2.09(t,j＝6.5hz,4h,ch2)。

步驟三：2-苯氨基-4-吡咯烷基-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物1)的合成

向50ml茄型瓶中加入2-苯氨基-4-吡咯烷基吡啶并[3,4-d]嘧啶(中間體b1)(50mg,0.15mmol)，2-氨基-5-(4-甲基-1-哌嗪基)吡啶(38mg，0.20mmol)，pd(oac)2(4mg，0.015mmol)，x-phos(14mg，0.030mmol)，cs2co3(122mg，0.38mmol)和1,4-二氧六環(huán)(10ml)，混合物于氬氣保護(hù)下回流3h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸除溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱色譜分離，得化合物1，黃色固體粉末，36mg，收率48.6％。

實(shí)施例2：2-(3-氟苯氨基)-4-吡咯烷基-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物2)

方法同化合物1的制備，黃色固體粉末。

實(shí)施例3：2-(3-氯-4-氟苯氨基)-4-吡咯烷基-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物3)

方法同化合物1的制備，黃色固體粉末。

實(shí)施例4：2-(n-甲基-4-吡唑胺基)-4-吡咯烷基-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物4)

方法同化合物1的制備，黃色固體粉末。

實(shí)施例5：2-苯氨基-4-吡咯烷基-6-(4-(n-甲基-n-二甲氨基乙基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物5)

方法同化合物1的制備，黃色固體粉末。

實(shí)施例6：2-苯氨基-4-吡咯烷基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物6)

方法同化合物1的制備，黃色固體粉末。

實(shí)施例7：2-苯氨基-4-二甲胺基-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物7)

方法同化合物1的制備，黃色固體粉末，收率65.8％。

實(shí)施例8：2-(3-三氟甲基苯氨基)-4-吡咯烷基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物8)

方法同化合物1的制備，黃色固體粉末。

實(shí)施例9：2-(3-氯-4-氟苯氨基)-4-吡咯烷基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物9)

方法同化合物1的制備，黃色固體粉末，收率11.0％。

實(shí)施例10：2-苯氨基-4-哌啶基-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物10)

方法同化合物1的制備，黃色固體粉末，收率52.1％。

實(shí)施例11：2-苯氨基-4-嗎啉基-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物11)

方法同化合物1的制備，黃色固體粉末。

實(shí)施例12：2-苯氨基-4-哌啶基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物12)

方法同化合物1的制備，黃色固體粉末。

實(shí)施例13：2-苯氨基-4-嗎啉基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物13)

方法同化合物1的制備，黃色固體粉末。

實(shí)施例14：2-(3-三氟甲基苯氨基)-4-嗎啉基-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物14)

方法同化合物1的制備，黃色固體粉末。

實(shí)施例15：2-(3-三氟甲基苯氨基)-4-嗎啉基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物15)

方法同化合物1的制備，黃色固體粉末。

實(shí)施例16：2-(3-氯-4-氟苯氨基)-4-嗎啉基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物16)

方法同化合物1的制備，黃色固體粉末。

實(shí)施例17：2-(3,4-二氟苯氨基)-4-嗎啉基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物17)

方法同化合物1的制備，黃色固體粉末。

實(shí)施例18：2-(4-氟苯氨基)-4-嗎啉基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物18)

方法同化合物1的制備，黃色固體粉末。

實(shí)施例19：2-(3-吡啶氨基)-4-嗎啉基-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物19)

2-(3-吡啶氨基)-4-嗎啉基吡啶并[3,4-d]嘧啶(中間體b2)的合成

向50ml茄型瓶中加入4-嗎啉基吡啶并[3,4-d]嘧啶(500mg,1.75mmol)，3-氨基吡啶(150mg，1.58mmol)，pd(oac)2(40mg，0.18mmol)，xant-phos(314mg，0.53mmol)，cs2co3(1.42g，4.38mmol)和乙二醇二甲醚(30ml)，混合物于氬氣保護(hù)下回流2.5h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸除溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱色譜分離，得化合物中間體b2，淡黃色固體粉末，202mg，收率37.4％。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.92(s,1h,ar-h),8.62(d,j＝8.5hz,1h,ar-h),8.30(dd,j＝4.9,1.0hz,1h,ar-h),8.05(bs,1h,nh),7.79–7.71(m,1h,ar-h),7.56(s,1h),7.02–6.94(m,1h,ar-h),3.91–3.87(m,4h,och2),3.84–3.80(m,4h,nch2)。

參考化合物1的制備步驟中的步驟三，用中間體b2替換中間體b1，制得化合物19，黃色固體粉末，收率31.4％。

實(shí)施例20：2-(3-吡啶氨基)-4-嗎啉基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物20)

方法同化合物19的制備，黃色固體粉末。

實(shí)施例21：2-(2-吡啶氨基)-4-嗎啉基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物21)

方法同化合物19的制備，黃色固體粉末。

實(shí)施例22：2-芐氨基-4-嗎啉基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物22)

2-芐氨基-4-嗎啉基吡啶并[3,4-d]嘧啶(中間體b3)的合成

向100ml茄型瓶中加入2,6-二氯-4-嗎啉基吡啶并[3,4-d]嘧啶(100mg，0.35mmol)，芐胺(41μl，0.39mmol)，碳酸鉀(121mg，0.88mmol)，二甲基亞砜，催化量的碘化鉀和四丁基碘化銨，混合物于120℃油浴中攪拌3h，將反應(yīng)混合物倒入水中，用乙酸乙酯(30ml×2)萃取，合并乙酸乙酯相，依次用水(30ml×3)和飽和食鹽水(30ml×2)洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓除去乙酸乙酯，殘留物經(jīng)硅膠柱色譜分離，得黃色油狀物，乙醇重結(jié)晶得中間體b3，黃色固體粉末，70mg，收率56.0％。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.75(s,1h,ar-h),7.47(s,1h,ar-h),7.38–7.27(m,5h,ar-h),5.40(bs,1h,nh),4.69(d,j＝5.6hz,2h,nhch2),3.85–3.69(m,8h,och2+nch2)。

參考化合物1的制備步驟中的步驟三，用中間體b3替換中間體b1，制得化合物22，黃色固體粉末，收率43.0％。

實(shí)施例23：2-(2-吡啶基甲氨基)-4-嗎啉基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物23)

方法同化合物22的制備，黃色固體粉末。

實(shí)施例24：2-(3-吡啶基甲氨基)-4-嗎啉基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物24)

方法同化合物22的制備，黃色固體粉末。

實(shí)施例25：2-苯氨基-4-嗎啉基-6-(1-甲基-4-吡唑氨基)吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物25)

方法同化合物1的制備，黃色固體粉末。

實(shí)施例26：2-(3-吡啶氧基)-4-嗎啉基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物26)

2-(3-吡啶基氧基)-4-嗎啉基吡啶并[3,4-d]嘧啶(中間體c1)的合成

向100ml圓底燒瓶中加入2,6-二氯-4-嗎啉基吡啶并[3,4-d]嘧啶(200mg，0.70mmol)，3-羥基吡啶(67mg，0.70mmol)，碳酸鉀(100mg，1.76mmol)和dmf(10ml)?；旌衔镉?0℃油浴中攪拌5h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去dmf，殘余物經(jīng)硅膠柱色譜分離得中間體c1，淡黃色固體粉末，125mg，收率51.9％。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.86(s,1h,ar-h),8.60(d,j＝2.4hz,1h,ar-h),8.52(d,j＝4.3hz,1h,ar-h),7.65(s,1h,ar-h),7.62(ddd,j＝8.3,2.6,1.4hz,1h,ar-h),7.40(dd,j＝8.3,4.8hz,1h,ar-h),3.93–3.89(m,4h,och2),3.88–3.83(m,4h,nch2)。

2-(3-吡啶氧基)-4-嗎啉基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物26)的合成。

參考化合物1的制備步驟中的步驟三，用中間體c1替換中間體b1，制得化合物26，黃色固體粉末，收率73.9％。

實(shí)施例27：2-(4-四氫吡喃氧基)-4-嗎啉基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物27)

2-(4-四氫吡喃氧基)-4-嗎啉基-吡啶并[3,4-d]嘧啶(中間體c2)的合成

將4-羥基四氫吡喃(72mg，0.77mmol)和四氫呋喃(10ml)加入圓底燒瓶中，攪拌下分批加入氫化鈉(56mg，60％，1.40mmol)，混合物在氬氣保護(hù)下于室溫?cái)嚢?0min，加入4-嗎啉基2,6-二氯吡啶并[3,4-d]嘧啶(200mg，0.70mmol)，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去四氫呋喃，殘余物經(jīng)硅膠柱色譜分離得中間體c2，黃色固體粉末，171mg，收率69.5％。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.90(s,1h,ar-h),7.60(s,1h,ar-h),5.40–5.27(m,1h,och),4.14–4.02(m,2h,och2),3.97–3.85(m,8h,och2+nch2),3.71–3.59(m,2h,och2),2.20–2.09(m,2h,ch2),1.99–1.89(m,2h,ch2)。

參考化合物1的制備步驟中的步驟三，用中間體c2替換中間體b1，制得化合物27，黃色固體粉末。

實(shí)施例28：2-(四氫吡喃-4-甲氧基)-4-嗎啉基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物28)

方法同化合物27的制備，黃色固體粉末。

實(shí)施例29：2-(四氫吡喃-4-氧基)-4-吡咯烷基-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物29)

方法同化合物27的制備，黃色固體粉末。

實(shí)施例30：2-環(huán)己基甲氧基-4-吡咯烷基-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物30)

方法同化合物27的制備，黃色固體粉末。

實(shí)施例31：2-芐氧基-4-吡咯烷基-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物31)

方法同化合物27的制備，黃色固體粉末。

實(shí)施例32：2-(3-吡啶甲氧基)-4-吡咯烷基-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物32)

方法同化合物27的制備，黃色固體粉末。

實(shí)施例33：2-(4-吡啶甲氧基)-4-吡咯烷基-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物33)

方法同化合物27的制備，黃色固體粉末。

實(shí)施例34：2-(4-甲氧基芐氧基)-4-吡咯烷基-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物34)

方法同化合物27的制備，黃色固體粉末。

實(shí)施例35：2-(4-氟芐氧基)-4-吡咯烷基-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物35)

方法同化合物27的制備，黃色固體粉末。

實(shí)施例36：2-(4-氟芐氧基)-4-吡咯烷基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物36)

方法同化合物27的制備，黃色固體粉末。

實(shí)施例37：2-(4-氟芐氧基)-4-二甲氨基-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物37)

方法同化合物27的制備，黃色固體粉末。

實(shí)施例38：(s)-2-苯氨基-4-(3-丙烯酰氨基-1-吡咯烷基)-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物38)

方法同化合物1的制備，黃色固體粉末。

實(shí)施例39：(r)-2-苯氨基-4-(3-丙烯酰氨基-1-吡咯烷基)-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物39)

方法同化合物1的制備，黃色固體粉末。

實(shí)施例40：(s)-2-苯氨基-4-(3-丙烯酰氨基-1-哌啶基)-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物40)

方法同化合物1的制備，黃色固體粉末。

實(shí)施例41：(r)-2-苯氨基-4-(3-丙烯酰氨基-1-哌啶基)-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物41)

方法同化合物1的制備，黃色固體粉末。

實(shí)施例42：(s)-2-苯氨基-4-(1-丙烯?；?3-吡咯烷基氨基)-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物42)

方法同化合物1的制備，黃色固體粉末。

實(shí)施例43：(r)-2-苯氨基-4-(1-丙烯酰基-3-吡咯烷基氨基)-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物43)

方法同化合物1的制備，黃色固體粉末。

實(shí)施例44：(s)-2-苯氨基-4-(1-丙烯?；?3-哌啶基氨基)-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物44)

方法同化合物1的制備，黃色固體粉末。

實(shí)施例45：(r)-2-苯氨基-4-(1-丙烯?；?3-哌啶基氨基)-6-(5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物45)

方法同化合物1的制備，黃色固體粉末。

實(shí)施例46：2-苯氨基-4-(1-吡咯烷基)-6-(6-丙烯酰氨基-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物46)

方法同化合物1的制備，黃色固體粉末。

實(shí)施例47：2-(3-氟苯氨基)-4-(1-吡咯烷基)-6-(6-丙烯酰氨基-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物47)

方法同化合物1的制備，黃色固體粉末。

實(shí)施例48：2-芐氧基-4-(1-吡咯烷基)-6-(6-丙烯酰氨基-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物48)

方法同化合物27的制備，黃色固體粉末。

實(shí)施例49：2-(4-氟芐氧基)-4-(1-吡咯烷基)-6-(6-丙烯酰氨基-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物49)

方法同化合物27的制備，黃色固體粉末。收率35.0％。

實(shí)施例50：2-(4-(四氫吡喃)甲氧基)-4-(1-吡咯烷基)-6-(6-丙烯酰氨基-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物50)

方法同化合物27的制備，黃色固體粉末。收率27.6％。

實(shí)施例51：2-(4-(四氫吡喃)氧基)-4-(1-吡咯烷基)-6-(6-丙烯酰氨基-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶(化合物51)

方法同化合物27的制備，黃色固體粉末。

實(shí)施例52：2-苯氨基-4-嗎啉基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶鹽酸鹽(化合物52)

將化合物13溶解于四氫呋喃，加入1.2倍摩爾量的濃鹽酸，密封，混合物于室溫度攪拌過(guò)夜，抽濾，干燥得化合物52。ei-ms：526.5(m+h⁺)。

實(shí)施例53：2-(3-三氟甲基苯氨基)-4-吡咯烷基-6-(5-(4-二甲氨基-1-哌啶基)-2-吡啶基)氨基吡啶并[3,4-d]嘧啶甲磺酸鹽(化合物53)

方法同化合物52的制備。

實(shí)施例54：抑制egfr-酪氨酸激酶活性的測(cè)定

方法：將待測(cè)定化合物分別用dmso溶解配制成10mmol/l的母液，逐級(jí)稀釋?zhuān)玫綕舛葹?μmol/l的溶液，并將5μl待測(cè)定的不同藥物或dmso分別加入酶反應(yīng)體系中。酶反應(yīng)體系的組成為：40mmol/ltris，ph7.4，10mmol/lmgcl2，0.1mg/mlbsa，1mmol/ldtt，10μmol/latp，egfr(l858r)或egfr(l858r/t790m)25mg/l，底物為0.2mg/mlpoly(glu,tyr)，反應(yīng)體系的終體積為50μl，而藥物的終濃度為100nmol/l。反應(yīng)體系置于30℃反應(yīng)40min后，加入終止液終止反應(yīng)，并用熒光素酶的方法檢測(cè)體系內(nèi)的atp含量，在md-spectramaxm5多功能酶標(biāo)儀上檢測(cè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)，化學(xué)發(fā)光信號(hào)的強(qiáng)度與反應(yīng)體系的酶的活性成反比。將檢測(cè)到的化學(xué)發(fā)光信號(hào)值代入公式：

抑制率＝[1-((lu酶-lu本底)/lu藥物-lu本底)]×100％

式中：lu藥物表示給藥組，lu本底表示空白組(不加酶不加藥)，lu酶表示溶劑對(duì)照組。

實(shí)驗(yàn)測(cè)定的結(jié)果展示在表2中。

表2.部分化合物在濃度為100nmol/l時(shí)對(duì)酶活性的抑制率(％)

“-”表示未測(cè)定。

實(shí)施例55：體外抗癌活性的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證本發(fā)明合成的及其鹽類(lèi)化合物的抗癌活性，以azd9291為陽(yáng)性對(duì)照藥物，采用體外mtt法測(cè)定了化合物1-53對(duì)人肺癌細(xì)胞hcc827、h1975生長(zhǎng)抑制作用。

驗(yàn)證方法：將腫瘤細(xì)胞hcc827培養(yǎng)在含10％小牛血清的rpmi1640培養(yǎng)基中，內(nèi)含青霉素有100u·ml^-1，鏈霉素100μg·ml^-1，于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。取0.25％胰酶消化貼壁的腫瘤細(xì)胞，用含10％小牛血清的rpmi1640培養(yǎng)液配制細(xì)胞懸液，濃度為6×10³個(gè)細(xì)胞/毫升。于96孔培養(yǎng)板內(nèi)每孔接種200μl(約含1000個(gè)腫瘤細(xì)胞)，37℃培養(yǎng)24h。給藥組加入不同濃度藥物，每藥設(shè)定10、3.33、1.0、0.33和0.10μmol·l^-15個(gè)濃度梯度，每組設(shè)3個(gè)平行孔。對(duì)照組加入與藥等體積的溶劑，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入20μl5mg·ml^-1的mtt溶液，孵育4h后，棄去上清液，每孔加入dmso150μl，輕度振蕩后用酶標(biāo)儀在570nm下測(cè)定光密度值(od)。

結(jié)果計(jì)算：

以溶劑對(duì)照處理的腫瘤細(xì)胞為對(duì)照組，按照下式求藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率：

并進(jìn)一步采用線性回歸法求出半數(shù)抑制濃度(ic50)。

測(cè)定結(jié)果顯示，化合物1-53對(duì)hcc827的ic50為0.008-5.17μmol·l^-1；對(duì)h1975的ic50為0.44-5.63μmol·l^-1；對(duì)a549的ic50值為0.16-8.39μmol·l^-1。陽(yáng)性藥奧希替尼(azd9291)對(duì)hcc827、h1975和a549的ic50值分別為0.025、0.35和11.5μmol·l^-1。

實(shí)施例56：體內(nèi)抗癌活性的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證本發(fā)明提供化合物的體內(nèi)抗癌活性，我們采用小鼠s180移植瘤模型，灌胃給藥，考察了化合物53的體內(nèi)抗癌活性。

驗(yàn)證方法：昆明種小鼠，雄性，體重20-23g。取出小鼠腹腔接種s180后第8天的腹水，用生理鹽水以1:1比例稀釋?zhuān)瞥蓅180細(xì)胞混懸液。用注射器在每只小鼠右腋窩皮下接種0.1ml。接種次日，將小鼠隨機(jī)分為3組，每組8只，分別為：

1)空白對(duì)照組(nmp/peg400/h2o)

2)化合物53低劑量組(5.0mg·kg^-1)

3)化合物53高劑量組(15.0mg·kg^-1)

將化合物53用nmp/peg400/h2o(體積比為1:5:4)溶解。接種后第二天開(kāi)始按上述給藥方案灌胃給藥，一日一次，連續(xù)給藥8天。給藥當(dāng)日記為d1，給藥體積為10ml·kg^-1體重。每日給藥前記錄小鼠體重。停藥次日(d9)將小鼠處死，剝離出瘤塊，剔除其他組織后稱(chēng)重。

結(jié)果：化合物53在劑量為5.0mg·kg^-1和15.0mg·kg^-1時(shí)，對(duì)小鼠體內(nèi)s180移植瘤的生長(zhǎng)抑制率分別為52.5％和80.3％。

結(jié)論：本發(fā)明提供的化合物53具有明顯的體內(nèi)抗癌活性。

實(shí)施例57：急性毒性試驗(yàn)

化合物53用nmp、peg400和水溶解，以不同的劑量，給昆明種小鼠一次性灌胃給藥，觀察7天。結(jié)果表明：本發(fā)明中編號(hào)53的化合物給藥劑量為300mg·kg^-1時(shí)，小鼠活動(dòng)正常。試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明提供的化合物毒性很小。